全 文 ：遗 传毕 报, _10 (幻 : 3 3一 3 40 , 1 2尽子
闷目加 G . 朋 t沁口 iS n 亡e o
终蓖麻蚕核糖体核糖核酸基因上 18 5 、 285 和`
5
.
85核糖体扶糖核酸基因的定位通’
娜什布 钱t肖贞 杨冠珍` 张爱宝 李载平 ’
(中国科学院上海生物化学研究所)
蓖麻蚕的核塘体核箱核酸 ( rR N 人 )
到, 在每。 熏复单位中含有 1昨、
的荃因 ( r D N人孰.是多拷贝基因 ,其宜复单位成线性方
2 85 和 , . 8足 r RN A 基因各一个。 了解它们的排列伏
娜_ rD N人结构的基拙 本文将无性繁殖的该 rD漱 用各种限制性内切酶水解后 ,制成
“ u ht er n 转移膜与放射性同位素标记的 1 85 、 2 85 和 , . 85 r R N A 杂交 ;又将 1 85 和 285 r RN A制成 N o rt h* 。 转掺咖放射性同位素标记的 r、 A 片段杂交 , 从而排出 1。云 : 。 s 和 , . : s愁、亦兄基幽 ` · r o N* 濒的相对位置、 1 《 一
我们已经研究了蓖麻蚕 ( A ,t ~ 厅讨` O 核糖体核糖核酸 (r RN A ) 的基因 (
r D N A )
的限制性内切酶酶切图谙山公而且该 r DNA 通过质休 BP 3R 2 D N A 的运载在大肠杆菌中
的无性繁殖也获成功切。 ` 在进一步研究 : D N A 的功能表达时我们豁要对这个基因的结
构顺序作一个大致的分析瑞解酌。 本文就是用 枷 the nr 杂交法以及 N o r tbe nr 杂交法在
r D N A 的酶切图谱上大致确定了 1 8 5 、 2 85 和 , .8 5 r D N人 的相应定位。
材 料 与 方 法
(~ )
r D N A 及其 ·肠。压 er n 转移
蓖麻蚕 r D N A 是从无性繁殖 (克隆 ) 在大肠杆菌里面的 r D N A一 p B 3R 2 重 组子
(协 lR n ) 中得到的切 。 重组子 衅班 11 包含了完整的 r D N A 单位与 p B R 3 2 2。 它是用限
制性内切酶 乃 d 从蓖麻蚕染色体 D N A 中水解得到完整的 : D N A 单位 , 然后与同样是
用 几 tI 水解的 p BR 3 2 D N A 重组而成山 。 p A IU l l , 分别用限制酶 P, I十 aB二 H l , 乃d 十
E co IR
,
1 如 I 布 s碗 和 jtPI + 兔1 酶解 。 电泳展开后 , 用 枷ht er n 法转移到硝酸纤维素撼膜上面 17 。 在做酶切图谱时并没有必要分开 r D N A 和 p BR 32 2 D N A , 因为在 枷山。 n
杂交时能很容易地将它们区别开的 。
(二 ) 185 、 滋8S 和 5 . 85 r R N A 的分离纯化以及放射性同位案标记
一` 用 iK r by 法从蓖麻蚕后部丝腺体中分离纯化的 r RNA 「” 。
` 在 2关琼脂搪凝胶电泳展
开山 , 然后分别切出含有 1 85 和 2 85 : RN A 的凝胶片段 ,各 自嵌人 2关 琼脂搪凝胶中走第
· 本文于 19雌年 , 月 17 日收到 。
l) 朱绳祖 、 吴雪 、 孔玉英 、冯宗铭 、 钱斌提供工具酶 , 吴祥甫 、 江福美提供 p A lR 、 p人川” , 旅培禅裕助撅影 , 特此致谢 .
.3 ` . 一 . … ~ ~ .尹 传 学 · 报 \ 二态` . . … 碧产 .二次电泳。 再切出含有 l。s 或 : 5 8, RN A 的凝胶片段 ,分别用电泳洗脱法回收 , 蓄痢宛化的 1 85 和 28 5 : RN A 。 5 . 85 : RN A 则从加热变性的 rR N A 中释放出来 , 用聚丙烯酞
胺凝胶电泳展开后 , 电泳洗脱纯化得到。
,
.
8 5 和 185 、 28 5 r RN A 分别用 气囚 或 1 一 ” P一 A PT .t] 标记制成分子杂交用的探
针 。
(三 ) 肠 . d . r n 杂交
将放射性同位素标记 的 .5 85 、 18 5 和 285 rR N A 分 别与 PA IR n 经酶切 后 的
如 het nr 转移膜杂交。 杂交方法参照 G吃 e 等阅。 在与标记的 1s rR NA 杂交时加人 60 倍最的非标记的 28 5 r RN A , 以抵消在 1 85 r RN A 中可能污染的 28 5 r RN A 的影响。 在
与标记的 2 55 r RN ^ 杂交时则加人非标记的 1 5 5 : R N ^ 。 而在与 , . 5 5 r RN ^ 杂交时加
人 2 0 0倍 t 非标记的无 5 . 8 5 : RN A 的 1 85 和 2 8 5 r RN A o
(四 ) , R付A `的 N or ht .r n 转移 线
参照 hT om as 的方法。 ,稍作一些改变。 我们或将总 r NR A 电泳展开后转移到硝酸纤
维素终琪上 , 或将总 rR N A 电泳展开后如方法 (二 ) 中所述的方法一样 , 分别切出含有
1 85 和 2 85 , R N A 的凝胶 , 第二次电泳后再分别转移到硝酸纤维素滤膜上。
为了得到含有 , . 85 rR N A 的凝胶区带 , 我们将总 r R N A 经 60 ℃ 加热变性释放出
,
.
85 r RN A
, 然后经电泳展开后转移到硝酸纤维素薄膜上 。
.
(五 ) 由N A 的次级克挂及其旅射性祠位素标记 4 、 、 一
一 除了 p A lR l 和 户取 I 制备 (包括 r D N A 的 刀。 用 IH 一 aB o IH 的 4 K b 片段 。 参见山)
外 , 我们还制造了分别年含有 rND A 的限制性内切酶酶切片段 几E : 、 lP岛 、 E :乌 和 E么
(图 Z A 、 B ) 的次级克隆 , 即 PA R p 几凡 、 PA R PI 几 、 PA R瓦乌 和 PA RE : R 。
这些克隆或次级克隆的重组予 _ D NA 分别用 ’气 标记囚或用 二一” P一 T P 和 a 一蕊之P -
dc T P 缺口标记 “ 0J 作分子杂交探针 。
(六 ) N or 出er n 杂文 卜 一将标记的 p A RI n D N A 和各种次级克隆的重组子分别与 1 85 、 2 85 和 5 . 85 r RN A
的 N hoert m 转移膜杂交
,杂交方法见文献 [ 7J 、 一 ;
结 果 与 讨 论
(一 ) .5 85 r RN A 、 15 r R N A 和 2招 r R N A 的纯化
如方法 (二 )所述 , 经过两次电泳分离后得到的各种 r RN A 基本上是纯的 (图 1 ) , 因
而可以作为分子杂交的探针 ,在 P^ RI n 的酶解图谱中找到它们各自的基因所在 。
(二 ) I招 、 25 和 .5 . r 0 N A 定位 _ _ - 一
1
.
ouS het rD 杂交的结果 图 2 给出了 户月 11 的酶切图谱 ( A 、 B ) 和 衅 lR l 的
如het nr 滤膜与 18义C ) 、 28 5 r R N A ( D ) 杂交的结果 。 各种酶切片段大小可参阅文献
川 和 [ 2 1。 在放射自.显影中一些分子 t 很小的片段 ,曝光太弱 , 在制成正片时反映不出
来 。 在图 Z A 、 B 中 , 为了叙述的方便 , 我们将 r D N A 上面各种限制性内切酶的切点分
别注以 1 、 2 、 3 、 小 · · …等序号 。 例如在下面讨论时就以 P尹: 代表 rD N A 上从第一个 几d
切口开始的 乃吐一 aB 。 印 片段 ,其余类推 。
,
’期 ” 郑仲承等 : 蓖麻蚕核塘体核塘核酸基因上 t s 、 2 85和 5 .脸核糖体核艳核酸基因的定位 3 3压,
刁 ` _ .
、 `乏
圈 l 纯化的各种 r明 ^
1井 t RN A,’. 不飞 2。 285 r R N A 3。 18 5 r RN A
的电味弃定
峪. 5 .肠 r又 N A
八 . 凡妞 .
l
。
T o勿 l
加热变性 ,释放出 , . as r皿N ^ 。
lE
e中叩卜时 e云 : 记 en 6 6 e a d on o f ht e d i到沁r . . .
,
.总 r几N连
词际. 施 .
r ib ” o四 1 r RN A , 2 2 8 5 r R N A . 3. 185 r R N A . 弓
5
.
5
。
8 5
r RN A r el .ae 记 扮。 m h ae t d e . 口 tur d 勿如d
厂亡
,
。
8 5
甘联N ^ 。
从N .^
公及N .^
件千
以
r ~ ~ 广 ~ ~ ~ . ~ ~ ,
2 3 4
, -
` . ~ . ~ 一 ` . 么 . J
目 2 185 和 2 8S t RN 人 的杂交结果
A
.
p A扣 11上面 r D N A 的醉切图进 ; B . p人川” 经醉切电泳后各 r心N人
片段的相应位 , 示愈翻 ; C . p A和盯 的 oS ut henr 腆与 比 S r获N ^ 杂交 ;爪 .D p A lnR 的 oS 以 h er n 膜与 2 85 rNR A 杂交 ,
、
F i二 2。 oS u t h .t n h油 r i d玉. 翻 io n a an l” 。 o f 18 5 a o d Z月5 r R N A
凡 · 1 n e r o t l c u o n m a P Ot P凡 . J u ` 。 · 工 O e t e l a 。 , e ’ o t v . n o姗 r e 目t[ , c t e d
far g~
t 征 tD N A On p A扣 n 盈血er d ce t 叩腼油… .c 脚y6 r id 翻 t i . of
p A及刀I w汕 1 85 r R N A . D . H户的 d i。 如n o f p A和叮 w i t h 2 85 r RN A .
卜一 - .尸川 , B一 B口份 H l ;脚用 IH 书 2— 巧比 +
E一肠 o RI ; Sse S口1 ;
cE
o斑 ; 于-一尸“ I + 5 . 妇书
称一一死拍 . 1一月碗 +今钾州褚协互+ B’ 位 .
遗 传 ’ 学 报 0 1犷卷
( 一) 8 5 1: RN A 基因的定位 : 根据图 2的结果 , 虽然 15 5 : RN A 与 残乌、 P: E l 、
瓦E : 、 几s 、 几鲍 l 、 兔 I gB Z 和 死 2兔 3 等都杂交 , 但仔细分析一下 , 乌 到 马 一段并不
与 185 r RN 人 杂交 , 此外 18 5 r RN A 也不与 R BI : 一杂交 , 所以可以认定 1 85 r RN A 的一
头在 B l一E : 之间 , 另
( 2 ) 2 85
r RN A 基
一瓦 之间 (图 3 )。
由图 2 也可看出 ,
氏R 、 马 R 、 lPS 、 s几、 璐 ZB g 3 、 兔 3飞呼 和 飞 4几。
与 2叨 rR N A 杂交的片段是 残残、
照图 3的分析看出 28 5 rD N A 的一
头在 瓦一残 之间 ,另一头在 S一几 之间。 为了进一步确定它的位置 , 我们将次级克隆
PA R E禹 用 E co RI 和 砚。 IH 双酶水解 , 得到两个片段。 一个是来自 p B R 32 ( ~ 3 . 7K b ) ,另一个来自 r D N A (一 .3儿bK ) (图 4 , A 、 1 ) , 然冶又用 E co 祖 + s, ,1I 双酶水解这个重
组子 ,得到 4个片段 , 它们分别为 3 . 7 9 、 1 . 4 2 、 1 . 0 4 和 0 . 70 K b (图 4 , A 、 2 ) , 因为这些片段
大小总和为 6 ·” 勒 , 说叽巳酶切完全。 将这些酶切片段制成 ” ou het rn 膜分别与放射性
同位素标记的 15 5 和 2 5 5 , RN A 杂交 , 结果是 : 第一 ,只有 2 5 5 r RN A 与 几几 杂交 , 而
1 85 : RN A 不与 ·乌残 :杂交 (图 4 , B ) ,这结果与上面的相同 , 更加证明 1 85 rD N A 并未延
, ` 厂 ’ : ” · . 一 三
护翻盆+ 刀油脚 H l
185 ( + )
湖S ( 一 ) 劝 S( + ) 龙 S ( + ) 15 (一 ) 28 5( + )
旁 卜d + ￡“ lR
盆岭 ( +公巧 (一 一8S ( + )娜 ( 一 ) 峭 (一 ) 劝 S ( + )
护,口I+ S时 I 1双 + ) Zd s (十 )
185 (一 )
(些笙士编
打 , I+ 刀皿川
185 ( + )
龙 S (一 ) 娜 (一 》 185 ( + 》 劝 S( + )
185 (一 )
28 5 (+ )
` 门. . . 叶一一一门. . . . . .
孕寻弃尺 ·
泌 圈 3 1 85 和 2 8s r D N ^ 的相应定位
( + ) 衰示能杂文的片段 ; ( 一 ) 表示不能杂交的片段 。
药: . 3 T h e r e la U , e Ioca d o助 o f I S a记 2 85 r D N人
( + )
,
ho w
, t h e fat g m
e n . tha t 公。 h沙 r记坛曰书
( 一 ) s h o w 一 th e fr a g m e n如 tab t at e 以 .
伸到 瓦 之后 ;第二 瓦残 经 E co RI + 凡。 H l 水解后 , 只有 3 . 26 K b 的片段与 2 85 rR N冉
杂交 , 因为它是来自 r D N A 的片段 ,而 .3 7bK 的 BP R 3 2 D N A 当然不杂交 ;第三 , E Z几
经 coE RI + S t,n
.水解后的 4个片段中 , 只有两个片段 ( ` 3 . 7 9 K b 和 1 . 42 K b ) 与 2 85
rR N A 杂交。 我们知道限制酶 & lt .在 BP 3R 2 上面没有切 口 , 所以
~
+
s,tI 所切开的 乌乌 的最大片段 ( 3 .” bK ) 无疑是 .3 7bK 的 p BR 3 2 加上从 乌一端开始的一个
rD N A片段 ( .0” K b ), 而另一个与 285 rNR A 熊杂交的片段 , 也一定是 rD N A .0 09 K b的片段向 几 方向延伸过去的一个片段 l( .权 K b ) 。 这样就可以初步认定 2 85 rD N A 从
乌 向 E : 方向延伸了大约 1 . sl K b 的长度。 份 ,I 在 乌巧 上的另一个切 口 如 果 用
刀娜 H l + &沮 水解 PA R E盔玩 就能确定 , 而 2 85 rD N A 的另一头我们未能测准 , 按照
5期 郑仲承等 : 蓖麻蚕核塘体核施核酸基因上 1 8 5、 28 5和 , . 85 核艳体核箱核酸荃因的定位 3 3 ,
ù用斗 ` p A RE满 ` :次级克睦与 1娜加 加 5 rR N A 的杂交分析
A
.
P A R E
:
B
: 云功蔺褚: 1 . E声: 雨一。掀 + 瓜 , IH 水解 ;
2
.
E声: 用 凡。斑 + st U 水解。二 p A RE声: 醉切哥进声& 川 d呢 r。 腆的杂交结果:
1
.与 1 85 r R N A 不傀杂交 ; 2 . 与 、 28 5 r RN A 索交`
C
.
2肠` tD N A 在 p人侧凡. . 上的定位` .
iF s
. 呼 T h e b户耐 i“ d o . . “ .户。 o f p A RE . B , s此 e l o o e w i t h 1 85 a n d 2 85 r R N人
^
.
T阮 r改 ic ` 翔 、 . p of 衅RE : 乌: 1. 乌乌 卜列 r ol y, 记 w此 cE 。班 + B动 IH ,、 ` 下
B
.
H户 r id iaz 吐的
么 , 氏 B : h尹七 0 1产 d w汕 cE o IR 十 s “ n ·
. 血目扣。 砖 PA R E月 B : : 1 . T加 t aet
,城 b内记坛己 , i t h 18 5 r R N A ,
2
.
T ab t ar
e 卜户r id 玉z已 w玉t h 2 85 r R N A .
C
.
T h e Icao d叨 o f 2 85 t D N A w i .苗。 p A只E .几 .
2 55 r D N A 的大小 , 推算在 4 2 4 o b p 左右阂 。 2 5 5 r D N ^ 在 r D N ^ 上面的定位大约是在
几一巧 间的 5 . 7 6一 10 . OK b 之间。( 3 ) 5 . 85 rD N A的定位 :将分离纯化的 5 . 85 rR N A 用放射性同位素 3乎标记后 ,与 p朋 1
酶切后的 s . the m 膜杂交 , 结果 乃 tI + 凡。 IH 的 lB 岛 片段 , 乃d + 肠RI 的 E仍 片段 ,竹d + S碗 的 lP s 片段和 tP l + 兔瓜 的 B g Z一 Bg 3片段能与 5 . 85 r RN 人 杂交 , 其余的片
段不杂交 。 将这些片段进行分析比较 (见图 5 ) ,可知 5 . 85 : D N A 可能定位在 瓦乌 片段里
面。 我们已经知道 2 85 rD N A 由 岛 向 几 `方向延伸人两个 &沮 切口位里 , 所以 5 .8 5
r
ND
A 可能在 s,lt
一
E
: 之间某一个位点上。 因为我们没有适当的限制性内切酶能进一步
剖析这个片段 ,所以未能更精确地认定 5 . 85 r D N人 的位置 。 . : ;
2
.
N o rt h e r n 杂交的结果 在做 S ou het nr 杂交的同时 , 我们也进行了 N or t h er n 杂
交的研究 。 将 pA R n (含有 rD N A 的 残一 lB 片段 )和 p凡RI ” 分另帅放射性同位素标记
与总 rR N A 的 N or het nr 膜杂交 。 结果 p A班 I 只与 28 5 r RN A 杂交 ,而 p A UI l l 则既与
幻住 遗 ` 传 学 报 0 1称
、
丽活心
, 劝皿十月肠 . H .
P,’I + ` l世室二哩 .止` 一一` 进巴 -一一
,
.书 (一 )
尸“ 班+ 3 .几 ,名以+ )
,.’1 + a’uI `竺生生竺立一竺竺匕竺左竺竺乙
圈 , , . 85 r DN ^ 的定位 : : ,
盛 . , . BS r R N A 每 洲人团 . 头刚山。 , 跳杂交。 -
. ,
.
85
r D N A 相应定位 : (+ ) 农示曲杂文的片段 , (一 ) 衰示不曲杂交的片段。
二 几 川` . , 竹 e 】. 川如。 成 , . 85 闭D拍 A · ’
^ 、 T如 汤甲 ,` . , 卜尹汾记七. ` . 。奋p A Ru l ` , ikt
·
,
. 肠 军从从人 . ;
B
.
T坛 r d巨吐, e l侧 , d口口 of , .朋 山 N A . 少 (十 ) . h口 , , 比 e f r . ` m二 吐川 .. ’ 、 J加标瞬军成 (一 ) .知 , : 山 e .扮明~ . 山吟 那尽 脚喊 .
(一 ) . 《十 ) ,
叹熟 几
L一冲 一- 一一 ` 后一一` J
p A砚. 1 1 . 5 (一 ) 、 2肠 (十 )
目 价 rD N 人 的 N . 伪 . 杂交分析
坏记的 p人R n 与总 `获N人 N “ 场趁。 疾杂交。
标记的 p A和叮 与总 r R N A N Or 场enr 腆杂交。林nR 和 p A . 月“ 的关系圈` ’
儿斌.C
;
’ 二. , . {抓` . ` 仆。 N “ 场已 . 卜户南运d四 . 目户。 of r D扣A
.A 几 e N o 母` ` n hy6 叫妇曰 ` . Of 比 1 t NR 人 , iht 卜阮 l己 p人习皿 .` .BL 份阮 N b r山 er n 卜户 d d i . d如 bf 叻 1 tR N人 w iht 肺 d d p A RIn .
C` }几 e 嗽砂a叨作 k . ` . o f r R冲A ` en o fr 阳 m en t 坛 p A nR a n d p A恤·
, 期 郑仲承等 : 蓖麻蚕核塘体核搪核酸基因上 1 8 5 、 2 85和 5 . 85 核糖体核塘核酸基因的定位 弓 ”
的是基本一致 (数据未列出 )。
3
.
rD N A 的相对定位 综合上述结果 , 图 7 列出了目前我们所认识的在蓖麻 蚕
rD N A 上面 1 85 、 28 5 和 .5 85 的相对定位 ,这结果与 M二吨 在家蚕的报道相秘目 ,说
明尽管蓖麻蚕与家蚕在进化上有所分化 ,但因为它们毕竟是同一纲 ,且有接近血缘关系的
生物 , 作为有相同重要生物功能的 rD N A 在基本结构上还是有一定保守性的。
在对 tD N A 定位研究的基础上 、 我们正对这个基因进行适当的改造哆以进` 步研究
其功能表达。 “ · 分 护 卜一丫 `
10 . 0
.日K`
图 7 蓖麻蚕 ( 刁碑t a o u 了 “ ` ) 沁N A 上面
18 5
、
5
.
8 5 和 2 85 r D N人 的相应定位
F ig
.
7 T h e r e la d v e l oc a t io n . o f 18 5
,
5
.
85
, a n d 2 85 r D N A on 山 e
r D N A fr o m s il k w o r m 注“ ` c .u 万 c`耐
, 考 文 献
〔 1 ]
t Z ]
1 3 ]
[ 1 0 ]
郑仲承 、钱肖贞 、 储美班 、 张爱室 、李载平 : l, 8 .1 遗传学报 , 歇 2 03 一 2 1 1。
吴祥甫 、 郑仲承 、 江福美 、 储美班 、钱肖贞、 李载平 : 19 82 。 生物化学与生物物理学报 , 日 : ( 3) 2盯一 2 9 30
G 。 * 2 . M
.
J
. ,
L
.
C
.
A l t e n b u r g an d G
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o r d er s : 1 9 7 2
,
iB 闭 i m . B i o灿了` 拟at, 2 8 7: 4 8卜一
4 9 4
.
G a g e
,
L
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.
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. 从吕 n n i n g : 1 9 76 . J . 肚。忿. B味。 忿. , 10 1 : 韶 7一34 8 .
K i
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.
E 体B梦协。落. , 1 2 : 8 7e 9 9 .
M a n n i n g
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P
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F
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P
.
B
. 队m o l . a n d L . P . G a g e : 1 9 7 8 . G旅 e , 4 : 1 5 3一1 6 6 .
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M
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19 75
.
.J 卫办L B 协忍. , 98 : 5 03一 . 517 .
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K u . u d a : 19 79
. 盆。 了. G已犯 . G改 e亡二 172 : 13 7一 141 .
外 o m朋 , P . 8 . : 1 9 8 0 . 矛勺。 。 . 刃叫王. A阅 .d 召氏 泞召通 , 77 : 5 20 1一 5 2肠 .
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,
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. 从 W e i se , H . ( 翅dar a n d B . 七 e1 ; · 19 78 . `西派 , 75 : 129卜一130 .3
,
.J, .J工.JiJ,j,七口舟O月`Ré即口. fL.r.护`.r
3 心0 遗 传 学 报 1 0 卷
L c o` 112 吐 i仲 公 158 , 2 8 5 a n d 5 . 85 R i加的m a l R N A G en .e o n
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