全 文 ：菌 物 系 统 22（2）：247~251, 2003
Mycosystema
大粉瘤菌小亚基 rDNA片段的克隆测序*
刘淑艳 李 玉**
（吉林农业大学农学院植病教研室 长春130118）
摘 要：对大粉瘤菌 Lycogala flavofuscum 的 19S rDNA 片段进行了克隆测序，序列长度为
1443bp。同时将之与多头绒泡菌的相应序列进行了比较，其序列同源性为 58.16%。
关键词：大粉瘤菌，19S rDNA，克隆，测序
中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：1007-3515（2003）02-0247-0251
粘菌（Myxomycetes）作为真核生物中的一个特殊类群，在生物界中占有重要地位。但
是有关粘菌在生物界中的分类地位却一直没有得到统一，一些学者强调其动物属性而将其归
属原生动物界，另一些学者则强调它与真菌的关系，而将其归属菌物界。到底粘菌应归属哪
一个类群，这是用传统的形态分类学方法所无法解决的问题。本文正是为了寻找解决这一问
题的有效途径，而选取大粉瘤菌 Lycogala flavofuscum为实验材料，对其 19S rDNA进行 PCR
扩增和序列测定，以期从分子生物学角度为粘菌的系统演化提供证据。
1材料和方法
1.1 标本和试剂
1.1.1标本：大粉瘤菌标本为吉林农业大学真菌标本室所藏标本，标本号为 10093，采集时间
为 1998年 8月。
1.1.2试剂：质粒 pGEM® -T Easy Vector（购自 Promega公司）；转化宿主细胞 JM109（由中科
院微生物所提供）；限制性内切酶 EcoRⅠ、X-gal、IPTG（购自北京鼎国生物技术服务工程公
司）。
1.2 方法
1.2.1 待克隆 DNA片段的制备：应用引物 SMNUR101和 NS6来扩增大粉瘤菌的 19S rDNA。
引物 SMNUR101和 NS6的序列分别是 SMNUR101： 5’ CTG GTT GAT CCT GCC AGT AG 3’
（20bp），NS6：5’ GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC 3’（24bp）[Rusk et al., 1995,White
et al.,1990]。预计扩增产物大小为 1400～1500bp。扩增反应体系如下：10×Buffer 2.5ml,
MgCl2(15mmol/L)2.5ml, dNTP(各 2.5mmol/L)2.0ml, 引物 SMNUR101和 NS6各 1.0ml, Taq DNA
polymerase(5U/μl)0.3ml,模板DNA 2.0ml, 最后以重蒸水补足至 25ml, 加液体石蜡约20ml覆盖反
应液。扩增反应条件为：首先 95℃预变性 3min,接着 95℃变性 1min、52℃退火 1min和 72℃延

*基金项目:中科院微生物所真菌地衣系统学开放实验室基金 921
**通信作者：李玉，1944年生，博士，教授，博士生导师，主要从事菌物学和粘菌系统学研究。E-mail: liyuziyong@hotmail.com
收原稿日期：2002-07-10，收修改稿日期：2002-12-20
DOI:10.13346/j.mycosystema.2003.02.014
248 菌 物 系 统 22卷
伸 2min，共 35个循环，最后 72℃延伸 10分钟。扩增产物检测：取反应产物 5ml，于含溴化乙
锭的 1.0% 琼脂糖凝胶上 50V电压电泳 1h后取出，在紫外分析仪中观察，并由 GDS500 系统
中的图谱存录系统 UVP-Imagestore 5000录入软盘。
1.2.2 靶DNA片段与载体的体外连接：取pGEM®- T Easy Vector 1ml，PCR扩增产物5ml， T4DNA
连接酶 1ml，Rapid Ligation Buffer 5ml，混匀后于 4℃冰箱中过夜，等待转化用。
1.2.3 重组质粒转入感受态细胞：用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞，参照金冬雁等所
描述的方案进行（金冬雁和黎孟枫，1995），略有改良。
1.2.4 可疑性转化菌的转种培养：用接种针挑取白斑点接种于装有含氨苄青霉素的 LB培养基的
试管中，于 37℃ 180r/min振荡培养约 12～14h。
1.2.5 阳性重组质粒的筛选和鉴定：质粒 DNA的提取用购于 Promega公司的Wizard®微量 DNA
纯化系统（Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System）提取。酶切鉴定：将提取得到的
质粒 DNA用 EcoR I进行酶切，因质粒 DNA插入位点两端各有一个 EcoR I 切点，酶切后电泳
如有与扩增片段等长的片段出现，说明转化成功，即可将菌体保存或用于测序。酶切反应体系
如下：10×bufferH 1ml，BSA（10mg/ml）1ml,质粒 DNA 5ml，EcoRⅠ1ml，用重蒸水补足至 10ml，
混匀，37℃水浴 4 小时,取出 5ml 酶切产物,以购自北京鼎国生物技术服务工程公司的 Lambda
DNA/EcoR I+ Hind III Marker作为分子量标准，在 1.2% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下检
测，看是否有两条带产生，并且要看所产生的带是否与 PCR 产物大小相同。如果片段大小与
PCR产物正好吻合，就可初步断定转化成功，该菌株便可用于序列测定。对转化产物的检测也
可用 PCR法：即以分离得到的质粒 DNA为模板，用同一引物在相同的反应条件下进行扩增, 看
是否有同样大小产物产生。如产生与原来 PCR产物相同的片段，就可初步断定转化成功。
1.2.6 PCR克隆产物的序列测定：将含有 PCR产物的大肠杆菌 JM109直接送到上海基康生物技
术有限公司进行测序。
2 结果
大粉瘤菌 19S rDNA序列全长 1443bp，序列前 20个碱基为引物 SMNUR101的序列，最后
24个碱基为引物 NS6的互补序列。该序列在 GenBank中的登录号为 AY187083。
3 讨论
编码 rDNA的基因与其相关的间隔区（spacer）统称为核糖体 DNA（ribosomal DNA，rDNA)。
由于 rDNA是合成蛋白质的装置——核糖体的重要成分，而蛋白质的合成则是一切生命存在的
先决条件，所以 rRNA及相关的 rDNA广泛存在于所有生命系统，且在进化过程中表现出高度
的保守性，成为研究生命起源和早期生物进化、高级阶元系统发育的最主要的分子标记。它由
转录单位和非转录的间隔区组成一个重复单位，在基因组中重复单位是串联重复排列的，重复
次数随物种不同而异。高等真核生物一般为 200个～500个拷贝。每一个拷贝由编码 5S、17-18S、
5.8S、25-28S RNA的转录区和不编码 RNA的非转录区构成。各区的进化速率是不同的，编码
区保守，可在科目水平上用于不同生物的比较，在其中的高度保守区，所有的异源基因几乎都
能与之强烈杂交；转录间区（ITS）和基因间隔区（IGR）进化速度最快，可用于区分同属不同
种甚至于种内水平的变异。这种特性使得 rDNA适于各级分类单元系统学的比较研究（Bruns et
2期 刘淑艳等：大粉瘤菌小亚基 rDNA 片段的克隆测序 249
al.，1991；Hibbett，1992；Mitchell et al.,1995；Vossbrinck et al.，1987；黄原，1998）。
小亚基 rDNA因其进化速度较慢，且序列相对较长（1800bp左右），而被广泛用于菌物分
子系统学研究中。如 Gunderson et al.(1987)用 18S rRNA 序列进行分析，结果表明金藻
Chrysophytes和卵菌 Oomycetes的关系较近。Sogin et al.（1986a）研究了脉胞菌 Neurospora与
其它真核生物之间的关系；Hendriks et al.（1991）研究了担子菌白冬孢酵母属 Leucosporidium
的 17S rRNA；Hibbett et al.（1997）对伞菌和腹菌的研究，以及 Castlebury和 Domier（1998），
Förster et al.（1990），Hendriks et al.（1989），Silva-Hanlin和 Hanlin（1999），Sogin et al.（1989），
Ward和 Adams（1998）等的研究，都有是利用小亚基 rRNA进行的有关菌物系统学方面的研
究。此外，小亚基 rRNA序列还被广泛用于研究生物主要类群之间的关系，如 Woese(1987)关
于细菌进化的研究，Woese et al.(1990)和 Sogin et al.(1989)关于生物所有界级关系的研究。
目前，有关粘菌小亚基序列的研究还很少，已经报道的仅有多头绒泡菌一个种测得了其小
亚基的完整序列[Johansen et al., 1988]。本研究所测得的大粉瘤菌的小亚基序列长度为 1443bp，
与多头绒泡菌 Physarum polycepharum的序列比较见表 1，其同源性为 58.16%，这表明粘菌小
亚基 rDNA序列在种间存在着一定的变异。该序列的测得添补了我国粘菌分子生物学研究的空
白，也为进一步研究粘菌的起源和演化提供了重要证据。
表 1大粉瘤菌与多头绒泡菌 19S rDNA序列比较
(上面为多头绒泡菌片段长度为 1563 bp，下面为大粉瘤菌片段长度为 1442 bp)
Table 1 The sequences alignment of 19S rDNA fragments of Lycogala flavofuscum and Physarum polycephalum
(Upper line is Physarum polycephalum from 1 to 1563bp.Lower line is Lycogala flavofuscum from 1 to 1442bp)
1 CTGGTTGATCCTGCCAGTAGT.GTATGCTTCTCCTAAAGACTAAGCCATGCATGTCTCCG
||||||||||||||||||||| ||||||| || ||||| |||||||||||||||| |
1 CTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAG
60 AATAGAAGAGCAAGTCTCTCTGAATCTGCGAACGGCTCCGCATACCAGTTGTAAACCATA
||| || | | || |||| ||||||| ||||| | | ||||| || ||
61 TATA.AACAACTCTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATT
120 GCAAGCAAGCCGCGTTGTTGCCGCAAGGCGACGGCGCGGTTCACAGGGATAACCCTGGTA
| || | || | ||| ||||||| |||||
120 ............TGATGGTACCTTA...............CTACATGGATAACTGTGGTA
180 ATTCTGAGGCTAATACAAGAACGTACCACCCGCTTCGACCCGTAAGGGGAGGGCGGGGGT
||||| ||||||||| | | || |||| | || |
153 ATTCTAGAGCTAATACATGC.....TGAAAAGCCCCGACTTCTGGAAGGGG.........
240 TGTGTGACCCAGGTCGCAAATATTAACTGGGAGTGGCCACACGATCTGACCACCATACCA
||| | || | ||| | || | | | || ||| | || |
199 TGTATTTATTAGAT..AAAAAACCAATGGCGGGCAACCG.....TCTTGCGTTGATTCAT
300 AACGGTTATCCGCTTCGAAAGCTTCGGTGAGTAACGGCGGATTTCTGGGTGGCTCTCGCT
|| | || ||| | | | | || | || |
252 AATAACTTCTCGAATCGCATGGCCTTGCG................CCGGCGATGCTTCAT
360 GTGTGCTTCTGACCTATCAACTA..GATGGCAGCGTAACGGACATGCCATGGTAACAACG
|||| |||||||||| ||||| || || | | | ||||||| | |||
296 TCAAATATCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAG.AGGCCTACCATGGTTATGACG
418 GGTA.CAGAGGATAAGGGTTCGATCCTGGAGAGTGGGCCTGAGAGATTGCTCACACTTCT
|||| | | | ||||||||||||| | |||||| |||||||||| | || | || | ||
355 GGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGAGGGCCTGAGAAACGGCCCTCAGTCCT
477 AAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAACGT.TCCCATTG.GGCAAAGCTCGAGGGCGTTAGGGGA
|||| | ||||||||||||||| | |||||| | || | || | | | |
415 AAGGGACGCAGCAGGCGCGCAAATTATCCCATCCCGACACGGGGAGATAGTGACAATAAA
535 CATATGAATGCCTGCCTTATGG..TGGGCAATTCAAATGGGACTGTTTTAAACAT CTA
| || ||| |||| |||| |||| | |||||| | ||
475 TAACAATATAGGGCCCTAATGGGTCTTATAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAA
250 菌 物 系 统 22卷
（续表1）
593 CGAGTAACAATTAGAGGACAAGTCTGGTGCCAGCACCCGCGGTAATTCCAGCTCTAATAG
|||| | ||||| |||| ||||||||||||| |||||| |||||
535 CGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAG
653 CATACGTTAAAGTTGTTGCGGTTAAAACGCTCGTAGTCGGCTCCAGACCTTCAGAGCCTT
| || ||||||||||||| ||||||| ||||||||||| | |||| |||
595 CGTATATTAAAGTTGTTGCCGTTAAAAAGCTCGTAGTCGAACTTCGGCCTTTGCCGCCC.
713 GATTCGGGACACTGGGTCAGCTGCTCTTCTCCAAGAGCGCGCCAACTACTGATGATAGGG
|||| || | | | ||| | ||||| |
654 ..............GGTCCGCCTATTT.......GGGCGTG.....TACTGG.....AGC
773 GACGTCGTCAATCGTGCCCTGGGCTGTCTCCCCCCCGGGGGAGTCACAGGGTCGTTCAG
| | || | | | || | | | | | | || |||| |
683 GGTGGAGGCTTACCTCGTGGTGAACGGCCATGCTCT........TTACTGGGT......G
833 CGGTCTTCGCGATCGCGGTTCGGCTCGGCTCGGGGTACCAATCACCATGATTAAACCGTA
|||| | | | | | | || | | ||| | || | ||| |
729 TGGTCCGAG.AACCATGACT....TTTACTTTGAAAA..AATTAGAGTGTTCAAAGCA..
893 GTGACCAAAGCACGTCTTTAGACGGGCACGGCACAGCATGGGACGAAACGCACCGGGCTC
| | | || || | | | ||| || | | || | ||| | | ||
780 ..GGCTTACGCCCGAAT..ACATTAGCATGGAATA..ATAAAATAGGACGTGCGGTTCTA
953 GCCTTTTTTTTGCGGGGGCGTGACTCGGTAAAAGCGAAAGGGAT.GTTCGAGGGTGACCG
| || || | || || | | | |||||| ||| | ||| ||
834 TTTTGTTGGTTTCTAGGATCG...CCGTAATGATTAATAGGGATAGTTTGGGGGCATTCG
1012 AATTGCTGGGCGAGTGGTGAAATACGTTGACCCTAGCAAGTCGACCAAAGGCGTAAGCAG
||| || || |||||||| | | || ||| ||| | | ||| |||||
891 TATTCAATTGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACGAACTACTGCGAAAGCAT
1072 TCATCAAGGGCATTCCCGTTGATCAAGAGCGAAAGTTAAGGGTTCGAAGACGATCAGATA
| ||||| || | |||||||||| |||| |||| ||| ||||| |||||||||||
951 TTGCCAAGGATGTTTTCATTGATCAAGAACGAAGGTTAGGGGATCGAAAACGATCAGATA
1132 CCGTCGTAGTCTTAACTATAAATGATGCAGACCAGGGATAGGAC.AGTGTCCATCTCGAC
|||| ||||||||||| |||| ||||| ||| |||||| |||| || | | |||
1011 CCGTTGTAGTCTTAACAGTAAACGATGCCGACTAGGGATCGGACGAGGATTTTTAATGAC
1191 TCTTCCGGACCTTG..GAGAAATCACGAGTCTATGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAA
|| | ||| | || |||||||| | | ||||| |||||||||||||||||||
1071 TCGTTCGGCACCTGAAGAGAAATCTTTAAGTC.TAGGTTCGGGGGGGAGTATGGTCGCAA
1249 GGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCAC.ACAAAGAGTGGAACCTGCGGCTTAAT
||||||||||||||||||||||||||||||||| || | | ||||| |||||||||||||
1130 GGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGTGTGGAGCCTGCGGCTT AT
1308 TTGACTCAACACGGGAAAACTCACCAGGTCCGGATACACGTATGAAAGTCAAGCTGAAAG
||||||||||||||| ||||||||||||||| || || | || | || ||| ||
1190 TTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACGACAAGGATTGACAGATTGATAG
1368 ACTTTACTCAATGATGTAAGTGGTGGTGCATGGTCGTTCTTAGTTC TG A TG TTGT
|| || || || ||||||||||||| ||||||||||| ||||| ||||||||
1250 CTCTTTCTTGATTTCGTGGTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGT
1428 CTGGTTTATTCCGATAACGAGCGAGACCCCGGCGTTCCTAATAGGGGTGGCAGCCA.GAC
|||||| ||||||||||||| ||||||| | | | | |
1310 CTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACCTTATCCTGCTAAATAGCCCGGCCGACTTTGGT
1487 CGGTCGCAAGACAGGTTAGCTCGCCACCTGAAGTTATGCTTCTTAGACGTATCAGAGCCG
|||||| | | |||| | | ||| ||| | | | ||| |
1370 TGGTCGCT.GGCTTCTTAGAGG A ATCAGCGTTTAGCTGATGGAA...GTTTGAGGCA
1547 ATAAGGTTCTTGAAATG
|||| || |||
1426 ATAACAGGTCTGTGATG
[REFERENCES]
Bruns T D, White T J, Taylor J W, et al. 1991. Fungal molecular systematics. Annu Rev Ecol Syst, 22: 525~564
Castlebury L A, Domier L L, 1998. Small subunit ribosomal RNA gene phylogeny of Plasmodiophora brassicae . Mycologia,
90 (1): 102~107
Förster H., Coffey M D, Elwood H, et al . 1990. Sequence analysis of the small subunit ribosomal RNAs of three zoosporic fungi
and implications for fungal evolution. Mycologia, 82 (3): 306~312
2期 刘淑艳等：大粉瘤菌小亚基 rDNA 片段的克隆测序 251
Gunderson J, Elwood H, Ingold A K, et al. 1987. Phylogenetic relationships between Chlorophytes, Chrysophytes and Oomycetes.
Proc Natl Acad Sci USA, 84: 5823~5827
Hendriks L, De B R, Van de P, et al . 1991. The evolutionary position of the rhodophyte Porphyra umbilicalis and the
Basidiomycete Leucosporidium scottii among other eukaryotes as deduced from complete sequences of small ribosomal
subunit RNA. J Mol Evol, 32: 167~177
Hendriks L, Goris A, Neefs J, et al. 1989. The nucleotide sequence of the small ribosomal subunit RNA of the yeast Candida
albicans and the evolutionary position of the fungi among the eukaryotes. System Appl Microbiol, 12: 223~229
Hibbett D S, 1992. Ribosomal RNA and fungal systematics. Trans Mycol Soc Japan, 33: 533~556
Hibbett D S, Pine E M, Langer E, et al . 1997. Evolution of gilled mushrooms and puffballs inferred from ribosomal DNA
sequences. Proc Natl Acad Sci USA, 94: 12002~12006
Johansen T, Johansen S, Haugli F B et al . 1988. Nucleotide sequence of the Physarum polycephalum small subunit ribosomal RNA
as inferred from the gene sequence: secondary structure and evolutionary implications. Curr Genet, 14: 265~273
Mitchell J I, Robert P J, Moss S T, et al . 1995. Sequencing or structure? A short review on the application of nucleic acid
sequence information to fungal taxonomy. Mycologist 9 (2): 67~75
Rusk S A, Spiegel F W, Lee S B, et al. 1995. Design of polymerase chain reaction primers for amplifying nuclear ribosomal DNA
from slime molds. Mycologia, 87(1): 140~143
Silva-Hanlin D M W, Hanlin R T, 1999. Small subunit ribosomal RNA gene phylogeny of several loculoascomycetes and its
taxonomic implications. Mycol Res, 103 (2): 153~160
Sogin M L, Elwood H J, Gunderson J H, et al. 1986. Evolutionary diversity of eukaryotic small-subunit rRNA genes. Proc Natl
Acad Sci USA, 83: 1383~1387
Sogin M L, Gunderson J H, Elwood H J, et al. 1989. Phylogenetic meaning of the kingdom concept: an unusual ribosomal RNA
from Giardia lamblia. Science , 243: 75~77
Vossbrinck C R, Maddox J V, Friedman S, et al., 1987. Ribosomal RNA sequence suggests microsporidia are extremely ancient
eukaryotes. Nature , 326: 411~414
Ward E, Adams M J, 1998. Analysis of ribosomal DNA sequences of Polymyxa species and related fungi and the development of
genus-and species-specific PCR primers. Mycol Res, 102 (8): 965~974
White T J, Bruns T, Lee S, Taylor J, 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.
In: PCR Protocools: A Guide to methods and application.(ed. by M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, T. J. White),
315~322. Academic Press, San Diego, California.
Woese C, 1987. Bacterial evolution. Microb Rev, 51: 221~271
Woese C, Kandle, O, Wheelis M, et al ., 1990. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria,
and Eucarya. Proc Natl Acad Sci USA, 87: 4576~4579
[附中文参考文献]
黄原, 1998. 分子系统学: 原理、方法及应用. 北京: 中国农业出版社. 1～372
金冬雁, 黎孟枫等译. 1995. 分子克隆实验指南. 北京: 科学出版社. 1～1026
CLONING AND SEQUENCING OF THE 19S rDNA
OF LYCOGALA FLAVOFUSCUM
LIU Shu-Yan LI Yu
(Section of Plant Pathology, College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118)
ABSTRACT: The 19S rDNA region of Lycogala flavofuscum was cloned and sequenced. The length of the
sequence is 1443bp. The sequence was compared with that of Physarum polycepharum. The results showed that
the homology of these two species is 58.16%.
KEY WOEDS: Lycogala flavofuscum, 19S rDNA, cloning, sequencing