全 文 :基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金(2012211A073)
作者简介:袁 爽(1984-),女,在读硕士,研究方向:心血管病中医药研究。
通信作者:辛效毅,男,博士,教授,主任医师,博士生导师,研究方向:心血管病中医药研究,E-mail:xinxy2005@126.com。
·维医维药·
复方唇香草颗粒干预As斑块炎症反应
信号通路的实验研究
袁 爽,伍 倩,陈 悦,辛效毅
(新疆医科大学第一附属医院中医内科,乌鲁木齐 830054)
摘要:目的 探讨以维吾尔药为主的复方唇香草颗粒对Apo-E基因敲除小鼠动脉粥样硬化(As)斑块IκK-β/
IκB-α/NF-κB信号通路的影响及其稳定As斑块作用的可能机制。方法 选择70只6~8周龄 Apo-E基因敲除
小鼠,予高脂饮食喂养12w后,随机处死10只,取主动脉根部,HE染色普通光镜下观察并确定As形成,其余小鼠
随机分为模型组(生理盐水)、中药对照组(血脂康)、西药对照组(辛伐他汀)及复方唇香草颗粒高、中、低剂量组,每
组10只,给药12w后处死,采用原位杂交法检测小鼠斑块内IκK-β、IκB-α和NF-κB mRNA表达。结果 与模型
组比较,中药对照组、西药对照组及复方唇香草颗粒高、中、低剂量组IκK-β和 NF-κB mRNA的表达降低 (P <
0.01),IκB-αmRNA的表达增高 (P<0.05);而西药对照组与复方唇香草颗粒高、中剂量组比较,差异均无统计学
意义 (P>0.05)。结论 复方唇香草颗粒具有抗As的作用,其机制可能与调控IκK-β/IκB-α/NF-κB信号通路的
活动而抑制炎症反应有关。
关键词:动脉粥样硬化;IκK-β;IκB-α;NF-κB;复方唇香草颗粒
中图分类号:R29 文献标识码:A 文章编号:1009-5551(2014)10-1269-03
doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2014.10.006
Experimental study on compound ziziphora clinopodioides lam granule
intervening as plaque inflammation signaling pathways
YUAN Shuang,WU Qian,CHEN Yue,XIN Xiaoyi
(Department of Traditional Chinese Medicine,The First Affiliated Hospital,
Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China)
Abstract:Objectives To discuss the influence of compound Ziziphora clinopodioides Lam granule aortic
atherosclerotic plaques IκK-β/IκB-α/NFκB signaling pathway of Apo-E Knockout mice and the possible
mechanism in stabilizing As plaque.Methods 70 6-8week-old Apo-E knockout mice were given a high-
fat diet for 12weeks,then 10were randomly kiled and their aortic root were taken,the formation of As
was observed with HE staining ordinary light microscope.The remaining mice were randomly divided into
6groups,namely,model group(saline group),traditional Chinese medicine control group(xuezhikang
group),western medicine control group(simvastatin group),and the experimental groups(compound Ziz-
iphora clinopodioides Lam granule high,medium and low dose groups).10mice in each group were kiled
after 12weeks′dosing.The expression of IκK-β,IκB-αand NF-κB mRNA in mice plaque was detected with
situ hybridization method.Results Compared with model group(saline group),traditional Chinese medi-
cine control group(xuezhikang group),western medicine control group(group simvastatin),the experi-
mental groups(compound Ziziphora clinopodioides Lam granule high,medium and low dose groups)could
reduce the IκK-βand NF-κB mRNA expression(P<0.01)and increase the IκB-αmRNA expression(P<
0.05).The western medicine control group(simvastatin group)and the experimental groups(compound
第37卷 第10期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Vol.37 No.10
2014年10月 Journal of Xinjiang Medical University Oct.2014
Ziziphora clinopodioides Lam granule high,medium dose groups)showed no significant differences(P>0.
05).Conclusion Compound Ziziphora clinopodioides Lam granule has the function of against sclerosis of
arterial congee appearance,its mechanism may be related to regulate the IκK-β/IκB-α/NF-κB signaling
pathway activity and inhibit the inflammatory response.
Key words:atherosclerosis;IκK-β;IκB-α;NF-κB;compound ziziphora clinopodioides lam granule
近年来心脑血管疾病已成为人类的第一杀手,
而动脉粥样硬化(As)又是多数心脑血管疾病发生
的前期病理基础。As的病理实质是一种炎症反
应[1],是斑块不稳定、发生破裂的中心环节[2]。目前
通过抑制炎症反应来延缓患者 As的发生发展,特
别是稳定斑块、防止破裂,已经成为医学领域的重要
研究方向。以维吾尔药为主的复方唇香草颗粒是新
疆医科大学第一附属医院中医科根据新疆地域特点
和新疆心脑血管疾病发病学特点总结出的经验方,
临床疗效显著。本研究通过复方唇香草颗粒对
Apo-E基因敲除小鼠 As斑块内IκK-β/IκB-α/NF-
κB信号通路的影响,探讨其稳定As斑块作用的可
能机制。
1 材料与方法
1.1 动物 6~8周龄Apo-E基因敲除小鼠(品系
C57BL/6J,北京大学实验动物中心自美国Jackson实
验室引进并培育)70只,均为雄性,体质量18~20g,
饲以含脂肪15%、胆固醇2%的高脂饲料(60钴γ灭菌
照射处理),饲养条件为2级,室温保持在22℃~
24℃,相对湿度为50%,光照时间为北京时间07∶00
~19∶00。
1.2 药物、试剂与仪器 复方唇香草颗粒(唇香草、
脱力草、苦参、红景天、汉防已、葛根)由新疆医科大
学第一附属医院制剂室制备,根据临床人拟用量与
小鼠剂量转换因子转换的使用剂量为:高剂量组
0.318g/20g,中剂量组0.159g/20g,小剂量组
0.080g/20g,用蒸馏水配制成0.84g/mL浓度混
悬液;血 脂 康 片 (规 格:0.30g/粒,国 药 准 字
Z10950029,北大维信生物科技有限公司),用蒸馏
水配制成0.2mL/20g;辛伐他汀片(规格:20mg/
粒;,国药准字 H10970385,由默沙东制药有限公司
提供),用蒸馏水配制成1mL/mg;IκK-β原位杂交
试剂盒(北京新生命生物制药有限公司),IκB-α原
位杂交试剂盒(北京新生命生物制药有限公司),
NF-κB原位杂交试剂盒(北京新生命生物制药有限公
司),浓缩型胃蛋白酶液,3% 柠檬酸溶液,DAB显色
剂;OLYMPUS BH2光学显微镜(日本OLYMPUS公
司),LKB-V切片机(瑞典LKB公司),SN-695型γ测
量仪(上海核子所,日环光电仪器厂),ABI-7300型
Real-time检测仪(美国ABI公司)。
1.3 方法
1.3.1 模型的建立 Apo-E基因敲除小鼠饲以含
脂肪15%、胆固醇2%的高脂饲料(60钴γ灭菌照射
处理),12w后,随机处死10只,取主动脉根部,HE
染色普通光镜下观察,确定As形成。
1.3.2 分组及标本处理 其余小鼠随机分为6组:
模型组(生理盐水组)、中药对照组、西药对照组及复
方唇香草颗粒高、中、低剂量组,每组各10只。根据
成人每日用药临床推荐的常用量,按体质量系数比
折算成小鼠用量,药物溶于蒸馏水,灌胃给药,每日
1次。喂养12w后,处死全部小鼠,取出腹主动脉
生理盐水冲洗后,立即置入4%多聚甲醛(含0.1%
的DEPC)固定液固定48h,待其有一定硬度后,取
出动脉,标本按照梯度酒精脱水、浸蜡、包埋,沿横切
面将标本连续切片。
1.4 原 位 杂 交 法 检 测 IκK-β、IκB-α 和 NF-
κBmRNA的表达 按照试剂盒说明书进行原位杂
交,杂交后细胞核进行常规苏木素染色;石蜡切片常
规脱蜡入水;3% 过氧化氢室温反应10min;3% 柠
檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶室温消化15min;预杂交
液37℃反应2~4h;杂交液37℃过夜;封闭液37℃
反应30min;生物素化鼠抗地高辛37℃反应60
min;SABC37℃反应20min;生物素化过氧化物酶
37℃反应20min;DAB显色5~10min,必要时苏
木素复染,充分水洗;酒精梯度脱水,二甲苯透明,封
片。原位杂交阳性细胞计数:在光学显微镜400倍
视野下,分别在内膜、肩区、纤维帽和基底部各选取
2个阳性表达比较集中的视野,进行阳性细胞计数,
求其平均值。
1.5 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行
统学计分析。计量资料采用均数±标准差 (-x±s)
表示,实验数据经正态性、方差齐性检验符合条件
后,实验组组间比较用单因素方差分析(One-way
ANOVA)及LSD检验;当实验数据不符合正态性、
方差齐性时,采用秩和检验,进行组间两两比较。等
级资料组间比较采用 Kruskal-Walis H 秩和检验
分析,两组间比较采用 Mann-Whitney U秩和检验
分析,检验水准α=0.05.
2 结果
2.1 确定As斑块的形成 高脂喂养12w后,HE
染色显示小鼠主动脉根部已形成明显的 As斑块,
内膜明显增厚,内皮下、斑块内有胆固醇结晶,纤维
帽形成,确定动脉粥样硬化斑块已形成。
2.2 各给药组对小鼠斑块内 NF-κBmRNA、IκK-
0721 新 疆 医 科 大 学 学 报 第37卷
βmRNA、IκB-αmRNA表达的影响 与模型组比较,
中药对照组、西药对照组及复方唇香草颗粒高、中、
低剂量组IκK-β和 NF-κB mRNA的表达降低 (P
<0.01),IκB-αmRNA的表达增高 (P <0.05);而
西药对照组与复方唇香草颗粒高、中剂量组比较,差
异均无统计学意义 (P>0.05),见表1。
表1 各给药组对小鼠斑块内 NF-κBmRNA、IκK-β、
IκB-αmRNA表达的影响(-x±s)
组别 n NF-κB IκK-β IκB-α
模型组 10 10.03±3.73 11.63±4.23 6.63±4.09
中药对照组 10 7.59±4.12# 9.19±3.84# 9.58±4.96#
西药对照组 10 5.19±2.26#*▲ 6.35±3.61#*▲ 13.57±6.78#*▲
复方唇香草颗粒
低剂量组 10 7.47±3.83# 9.07±3.79# 9.36±4.85#
中剂量组 10 5.21±2.32#*▲ 6.41±3.21#*▲ 13.51±6.83#*▲
高剂量组 10 5.25±2.3#*▲ 6.45±3.27#*▲ 13.55±6.88#*▲
注:与模型组相比,#P<0.01;与中药对照组相比,*P<0.05;与复方
唇香草颗粒低剂量组相比,▲P<0.05。
3 讨论
陈孝东等[3]报道As是一种多发性动脉内膜慢
性炎症性疾病。斑块内脂质的沉积可抑制细胞外基
质合成、促进斑块内血管新生,在炎症介质诱导下导
致斑块破裂出血[4-7]。
NF-κB作为一种转录因子,存在于单核细胞、
血管内皮和血管平滑肌细胞中,是调节细胞基因转
录的关键因子之一,参与许多与炎症反应有关的基
因的表达调控,从而加速了 As的发生发展。IκK
是通过激活 NF-κB的抑制蛋白IκB的降解而激活
NF-κB的上游激酶。当细胞受到上游刺激因子作
用时,NF-κB诱导激酶(NIK)可被激活,NIK 激活
IKB激酶(IKK)进一步致使IKB分子磷酸化降解,
NF-κB与IKB三聚体解离释放NF-κB,激活NF-κB
信号途径。IκK-β/IκB-α/NF-κB信号通路是促炎症
基因表达的枢纽之一。NF-κB及IκK-β被激活后,
将导致炎症相关因子的过度表达,引起明显的炎症
反应。而IκB-α在动脉壁内的含量高低则决定NF-
κB及IκK-βmRNA的表达,IκB-α可以抑制 NF-κB
及IκK-βmRNA的表达,反之则促进其表达,正确
调整主动脉壁IκK-β/IκB-α/NF-κB mRNA的表达
可有效降低动脉粥样硬化的发生发展,从而降低心
脑血管疾病的死亡率。
复方唇香草颗粒是新疆医科大学第一附属医院
中医科根据新疆地域特点和新疆心脑血管疾病发病
学特点经过几代中医人总结出的以维吾尔药、地产
药为主的经验方,在临床上获显著疗效。复方唇香
草颗粒中的维吾尔药唇香草又名苏则,维医用于治
疗心脏病、胃病等,具有芳香开泄、舒展清阳、强心利
湿、理气化痰等功效,唇香草能抑制脂质在动脉内壁
的沉积,从而有效地抑制内皮细胞黏附分子-1的表
达,具有抑制NF-κB mRNA表达的作用;脱力草又
名仙鹤草,具有活血、散痞、强心、活化PPAR-γ的
作用;苦参清热燥湿、利尿,有降血脂、抗炎作用;红
景天有补气养血、和血化瘀之功,可抑制血管细胞粘
附分子-1(ICAM-1)的表达,抑制血管壁炎症细胞的
释放;汉防己具有抗心律失常、降血压、抗心肌缺血
之功,可活化PPAR-γ,减少炎症介质和细胞因子的
产生和释放;葛根具有扩张血管、促进血液循环和降
压、降脂作用。诸药合用共奏益气活血、升阳利湿、
祛瘀化浊之功,减缓动脉粥样硬化炎症反应程度,降
低心脑血管事件的发生率。
本研究显示,与模型组相比,复方唇香草颗粒
高、中、低剂量组及西药对照组、中药对照组小鼠主
动脉壁IκK-β及 NF-κBmRNA的阳性表达均有不
同程度的降低;与中药对照组及复方唇香草颗粒低
剂量组相比,复方唇香草颗粒中剂量组、高剂量组及
西药对照组有不同程度的降低,提示复方唇香草颗
粒和辛伐他汀抗动脉粥样硬化作用可能是通过抑制
主动脉壁IκK-β、NF-κB mRNA的表达来实现的;复
方唇香草颗粒中、高剂量组及西药对照组小鼠主动
脉壁IκB-αmRNA的阳性表达有不同程度的升高,
提示复方唇香草颗粒和辛伐他汀均可促进主动脉壁
IκB-α水平,从而抑制主动脉壁NF-κB mRNA的表
达,发挥其抗动脉粥样硬化作用。
综上所述,复方唇香草颗粒具有抗动脉粥样硬
化的作用,其机制可能与抑制NF-kB与IκK-β、提高
IκB-αmRNA的表达、调控IκK-β/IκB-α/NF-κB 信
号通路的活动而抑制炎症反应有关。
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[收稿日期:2014-07-30]
(本文编辑 周芳)
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