全 文 ：2011 年 7 月 第 13 卷 第 7 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Jul. 2011 Vol. 13 No. 7
△［基金项目］ 国家 863 项目(2008AA10Z323)
［通讯作者］ * 王金辉，E-mail:tcm_shz@ yahoo. cn
阿魏侧耳多糖酶水解制备工艺研究
△
王莹1，李国玉1，黄健2，魏秀岩2，马跃平2，高建波1，王金辉1，2，3*
(1. 石河子大学药学院，新疆 石河子 832002;
2. 沈阳药科大学中药学院，辽宁 沈阳 110016;
3. 教育部省部共建新疆特种植物药资源重点实验室，新疆 石河子 832002)
［摘要］ 目的:采用蛋白酶水解法提取制备阿魏侧耳多糖。方法:采用硫酸 －苯酚显色测定多糖的含量，采
用 UV法测定蛋白质的含量。研究不同蛋白酶在不同条件下对阿魏侧耳多糖提取率和除蛋白效果的影响。结果:最
佳酶底比为 8 mg·g －1，温度 60 ℃，最适 pH值为 6. 0，最佳酶解时间为 90 min。结论:采用蛋白酶水解法可以制得
纯度很高的阿魏侧耳多糖。
［关键词］ 蛋白酶水解法;阿魏侧耳多糖;提取制备工艺
阿魏侧耳 Pleurotus ferulae Lanzi又名阿魏菇，是
一种新疆特色的食、药两用大型真菌，因寄生或腐
生在药用植物阿魏上而得名［1］。试验研究表明阿魏
侧耳多糖(Pleurotus ferulae polysaccharide，PFP)对 γ
辐射产生的自由基所造成的鼠肝线粒体细胞膜伤害
具有抗氧化抑制效果［2］。巨噬细胞吞噬作用试验、
迟发型变态反应试验、白细胞介素 － 2(IL-2)的诱
生与检测试验测得阿魏侧耳粗多糖具有免疫增强活
性［3］。同时，还发现阿魏菇多糖具有明显的抗氧
化［4］、延缓衰老［5］、抗肿瘤［6-11］、抑制核糖核酸
酶［12］等作用。
阿魏侧耳多糖的提取方法研究，多简单采用热
水浸提的方法 ［3，12-14］。笔者研究表明，阿魏侧耳多
糖提取过程中，蛋白质类成分干扰很大，采用常规
的离子交换色谱法、溶剂法(Sevage 法)除蛋白的
过程复杂，并且容易引进有机溶剂等杂质，严重影
响阿魏侧耳多糖的质量。因此，本研究采用蛋白酶
水解的方法，建立了阿魏侧耳多糖的高效的提取纯
化方法。
1 仪器与试药
1. 1 仪器
Sartorius B P211 D型电子分析天平(北京赛多利
斯仪器系统有限公司) ，SK 5200 HP 型超声波清洗
机(上海科导超声有限公司) ，UV-2409 型紫外分光
光度计，DZKW 型电热恒温水浴锅(北京市永光明
医疗仪器厂) ，791 型磁力加热搅拌器(南汇电讯器
材厂) ，EYBLA 旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公
司) ，SHZ-D9(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪
器有限责任公司) ，DzF 型真空干燥箱(上海市精密
实验设备有限公司)。
1. 2 试药
阿魏侧耳购于新疆石河子市，经石河子大学谭
勇博士鉴定为阿魏侧耳 Pleurotus ferulae Lanzi。标本
号为 No. 20071002001，保存在石河子大学药学院。
葡萄糖、苯酚、无水乙醇、浓硫酸等均为分析纯，
水为二重蒸馏水。
2 方法与结果
2. 1 利用文献硫酸 －苯酚法［12］测定多糖的含量
2. 1. 1 苯酚溶液制备 苯酚 5 g，用少量水溶解，转
移至 100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成苯酚
溶液。
2. 1. 2 标准曲线的绘制 称取烘干至恒重的无水葡
萄糖 0. 101 1 g，溶于 100 mL 蒸馏水中，配成
1. 011 mg·mL －1的标准溶液。然后分别取标准溶液
0. 2，0. 3，0. 4，0. 6，0. 8 mL 置 5 只试管中，加蒸
馏水至 1. 0 mL，加入硫酸 －苯酚显色液(加 1 mL苯
酚溶液和 5 mL 硫酸) ，沸水浴 30 min，放至室温，
在 490 nm处，测其吸光度 A。用同样处理的蒸馏水
做空白对照，以吸光度 A 为纵坐标，糖浓度为横坐
标绘制标准曲线，得回归方程 Y = 1. 429 3X －
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DOI:10.13313/j.issn.1673-4890.2011.07.002
2011 年 7 月 第 13 卷 第 7 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Jul. 2011 Vol. 13 No. 7
0. 044 5，r = 0. 999 8，表明多糖在 0. 028 89 ～
0. 115 5 mg·mL －1具有良好的线性关系。
2. 1. 3 测定法 样品加 1 mL苯酚溶液和 5 mL硫酸，
沸水浴 30 min，冷却至室温，490 nm 处测吸光度
A，利用标准曲线法，计算，即得。
2. 2 多糖提取条件正交试验优化
2. 2. 1 因素水平设计 选取影响多糖提取的 3 个主
要因素:温度(A)、时间(B)、料液比(C) ，采用
L9(3
4)进行了正交试验，以多糖得率为指标，优选
最佳工艺。为了提高统计分析的可靠性，每一条件
下都作了重复试验(n = 3) ，测定结果取其平均值。
因素水平表见表 1。
表 1 阿魏侧耳多糖提取正交试验因素水平表
水平 温度(A) /℃ 时间(B) /h 料液比(C)
1 70 2 1∶20
2 80 3 1∶30
3 90 4 1∶40
2. 2. 2 正交试验结果及分析 试验设计及结果见表
2，方差分析结果见表 3。
表 2 阿魏侧耳多糖提取正交试验设计及结果
试验号
温度
(A)
时间
(B)
料液比
(C)
误差
(D)
多糖得
率 /%
1 1 1 1 1 15. 15
2 1 2 2 2 17. 17
3 1 3 3 3 19. 84
4 2 1 2 3 15. 12
5 2 2 3 1 19. 17
6 2 3 1 2 14. 37
7 3 1 3 2 20. 06
8 3 2 1 3 12. 73
9 3 3 2 1 15. 59
K1 17. 57 16. 78 14. 087 16. 64
K2 16. 22 16. 537 16. 14 17. 38
K3 16. 127 16. 6 19. 69 15. 897
R 1. 443 0. 243 5. 603 1. 483
表 3 方差分析表
方差来源 偏差平方和 n F比 F临界值 P
A 3. 914 2 2. 305 6. 94
B 0. 096 2 0. 057 6. 94
C 48. 216 2 28. 396 6. 94 ＜ 0. 05
误差 3. 4 4
表 2 直观分析可知，RC ＞ RA ＞ RB，即影响阿魏
菇多糖提取率的诸因素的主次关系依次是料液比
(C) ＞浸提温度(A) ＞浸提时间(B)。
表 3 方差分析表明，最佳工艺条件为 A1B1C3。
即浸提温度 70 ℃，浸提时间 2 h，料液比 1∶40。
2. 3 阿魏侧耳多糖木瓜蛋白酶解纯化工艺的考察
2. 3. 1 最适酶用量的确定 取 7 个具塞锥形瓶，每
瓶加入阿魏侧耳提取液 20 mL(0. 556 8g·mL －1) ，分
别加入木瓜蛋白酶(酶与底物质量比)0，2，4，6，
8，10，12 mg·g －1，用 HCL调 pH 6，50 ℃水浴 2 h
后沸水浴 10 min 使酶灭活，冷却至室温，3 000 r·
min －1离心 5 min，取上清液加 95 %乙醇至醇浓度
80 %，3 000 r·min －1离心 10 min取沉淀，同法洗涤
沉淀 3 次，测多糖得率，结果见表 4，确定最佳酶
底比为 8 mg·g －1。
表 4 最适酶用量考察结果
酶底比
/mg·g － 1
0 2 4 6 8 10 12
酶质量 /mg 0 22. 27 44. 56 66. 84 89. 12 111. 40 133. 70
多糖得率 /% 1. 96 2. 04 2. 61 2. 75 2. 98 2. 53 2. 07
2. 3. 2 最适酶解时间的确定 取 7 个具塞锥形瓶，
每瓶加入阿魏侧耳提取液 20 mL(0. 556 8 g·mL －1) ，
分别加入木瓜蛋白酶 89. 12 mg 用 HCL 调 pH 6，分
别 50℃水浴 0，30，60，90，120，150，180 min 后
沸水浴 10 min 使酶灭活，冷却至室温，3 000 r·
min －1离心 5 min，取上清液加 95 %乙醇至醇浓度 80
%，3 000 r·min －1离心 10 min 取沉淀，同法洗涤沉
淀 3 次，测多糖得率，结果见表 5，确定最佳酶解
时间为 90 min。
表 5 最适酶解时间考察结果
水浴时间 /min 0 30 60 90 120 150 180
酶底比 / mg·g － 1 8 8 8 8 8 8 8
多糖得率 /% 1. 91 2. 26 2. 28 3. 04 2. 94 2. 87 2. 79
2. 3. 3 最适 pH值的确定 取 3 个具塞锥形瓶，每瓶
加入阿魏侧耳提取液 20 mL(0. 556 8 g·mL －1) ，分
别加入木瓜蛋白酶 89. 12 mg用 HCL分别调 pH为 3、
4、5、6、7、8、9，分别 50 ℃水浴 90 min 后沸水
浴10 min使酶灭活，冷却至室温，3 000 r·min －1离
心5 min，取上清液加 95 % 乙醇至醇浓度 80 %，
3 000 r·min －1离心 10 min 取沉淀，同法洗涤沉淀 3
次，测多糖得率，结果见表 6，确定最佳酶解 pH值
为 6。
表 6 最适酶解时间考察结果
pH值 3 4 5 6 7 8 9
酶底比 /mg·g － 1 8 8 8 8 8 8 8
多糖得率 /% 1. 48 1. 94 1. 87 3. 02 2. 56 2. 34 2. 45
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书2011 年 7 月 第 13 卷 第 7 期 中国现代中药 Modern Chinese Medicine Jul. 2011 Vol. 13 No. 7
2. 3. 4 最适酶解温度的确定 取 7 个具塞锥形瓶，
每瓶加入阿魏侧耳提取液 20 mL(0. 556 8 g·mL －1) ，
分别加入木瓜蛋白酶 89. 12 mg用 HCL分别调 pH为
6，分别 30，40，50，60，70，80，90 ℃ 水浴 90
min后沸水浴 10 min使酶灭活，冷却至室温，3 000
r·min －1离心 5 min，取上清液加 95 %乙醇至醇浓度
80 %，3 000 r·min －1离心 10 min取沉淀，同法洗涤
沉淀 3 次，测多糖得率，结果见表 7，确定最佳酶
解温度为 60 ℃。
表 7 最适酶解温度考察结果
酶解温度 /℃ 30 40 50 60 70 80 90
酶底比 /mg·g － 1 8 8 8 8 8 8 8
多糖得率 /% 1. 46 1. 57 2. 94 3. 12 2. 60 1. 78 1. 88
2. 3. 5 工艺验证 取 3 个具塞锥形瓶平行做 3 组，
每瓶加入阿魏侧耳提取液 20 mL(0. 556 8g·mL －1) ，
分别加入木瓜蛋白酶 89. 12 mg用 HCL分别调 pH为
6，60 ℃水浴 90 min后沸水浴 10 min 使酶灭活，冷
却至室温，3 000 r·min －1离心 5 min，取上清液加 95
%乙醇至醇浓度 80 %，3 000 r·min －1离心 10 min取
沉淀，同法洗涤沉淀 3 次，测多糖得率分别为
3. 11 %，3. 15 %，3. 09 %，RSD =0. 8 %(n = 3)。
3 讨论
影响阿魏侧耳多糖提取工艺的各因素重要程度
依次为料液比、浸提温度、浸提时间，且料液比对
阿魏侧耳多糖提取有显著性影响。正交分析得到的
阿魏侧耳多糖提取工艺最佳参数为浸提温度70 ℃，
浸提时间 2 h，料液比 1∶40。
阿魏侧耳中含有大量的蛋白质成分，采用传统
的除蛋白质的方法其过程复杂、效率低，并且容易
引进有机溶剂等杂质，严重影响阿魏侧耳多糖的质
量。本研究采用蛋白酶水解的方法，选用木瓜蛋白
酶，因其具有较宽的底物特异性，对底物特异性要
求不严格，对多糖成分中的杂蛋白脱除效果较好，
能得到纯度较高的阿魏侧耳多糖。木瓜蛋白酶对阿
魏侧耳多糖酶解纯化最佳工艺参数为酶底比
8 mg·g －1，酶解时间 90 min，pH 值 6，酶解温度
60 ℃。
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(收稿日期 2010-09-10)
Study on Extraction of Polysaccharide of Pleurotus ferulae
WANG Ying1，LI Guo-yu1，HUANG Jian2，WEI Xiu-yan2，MA Yue-ping2，GAO Jian-bo1，WANG Jin-hui1，2，3
(1. School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi 832002，China;
2. School of Traditional Chinese Materia Medica，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China;
3. Key Laboratory of Phytomedicine Resources ＆ Modernization of TCM，Shihezi 832002，China)
［Abstract］ Objective:Enzymatic hydrolysis processes of polysaccharides from Pleurotus ferulae were investigated.
(下转第 51 页)
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(收稿日期 2010-05-15
檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿
)
(上接第 44 页)
Methods:Enzymatic hydrolysis processes were developed by determination the concentration of the polysaccharides
from Pleurotus ferulae by using UV spectrophotometry method. Results:The enzyme concentration (8 mg·g －1) ，time
(60 ℃) ，pH 5. 0，and temperature (120 min)of hydrolysis processes，was developed. Conclusion:Enzymatic
hydrolysis is powerful for extracting the polysaccharide from Pleurotus ferulae.
［Key words］ Enzymatic hydrolysis;Pleurotus ferulae polysaccharide;Extraction processes
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