全 文 ：环氧橙皮油素对平滑肌肌球蛋白功能及肌球蛋白轻链激酶表达量的
影响
林桂梅， 杨静娴， 侯 影， 尹丽波， 贾天柱*
(辽宁中医药大学药学院 辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连 116600)
收稿日期:2011-11-25
基金项目:国家发改委行业专项“中药麸制及有毒中药炮制技术与原理研究”(200807039)
作者简介:林桂梅 (1982—) ，女，博士，讲师，从事中药炮制研究。Tel:(0411)87586114，E-mail:linguimei1982@ 163． com
* 通信作者:贾天柱 (1951—) ，男，教授，从事中药炮制研究。Tel:(0411)87586499，E-mail:jiatz@ lnutcm． edu． cn
摘要:目的 研究环氧橙皮油素对平滑肌肌球蛋白功能及肌球蛋白轻链激酶表达量的影响。方法 考察在钙离子存在
的条件下，环氧橙皮油素对 20 kDa肌球蛋白轻链的钙离子依赖性磷酸化反应的影响;用孔雀绿法测定环氧橙皮油素
对肌球蛋白 Mg2 + -ATPase活性的影响;采用蛋白免疫印迹方法考察环氧橙皮油素对平滑肌细胞中肌球蛋白轻链激酶的
表达量影响。结果 环氧橙皮油素在 20 ～ 320 μmol /L范围内剂量依赖性抑制肌球蛋白轻链磷酸化，在 5 ～ 20 min范围
内时间依赖性抑制肌球蛋白轻链磷酸化;在 5 ～ 20 min时间范围内，随着环氧橙皮油素用药浓度增加，呈现剂量依赖
性抑制肌球蛋白 Mg2 + -ATPase活性;在 40 ～ 320 μmol /L范围内剂量依赖性抑制肌球蛋白轻链激酶表达，在 0 ～ 96 h范
围内时间依赖性抑制肌球蛋白轻链激酶表达。结论 环氧橙皮油素可通过抑制平滑肌肌球蛋白功能及肌球蛋白轻链激
酶表达量，抑制胃肠道平滑肌的收缩。
关键词:环氧橙皮油素;肌球蛋白轻链;肌球蛋白轻链激酶;平滑肌
中图分类号:R285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2012)10-1852-05
Effects of epoxyauraptene on smooth muscle myosin and expression of myosin
light chain kinase
LIN Gui-mei， YANG Jing-xian， HOU Ying， YIN Li-bo， JIA Tian-zhu*
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning Provincial Traditional Chinese Medicine Engineering Research Center，Dalian 116600，
China)
ABSTRACT:AIM To investigate the effects of epoxyauraptene on the function of smooth muscle myosin and the
expression of myosin light chain kinase． METOODS The effect of epoxyauraptene on myosin was measured by
the use of activities of 20 kDa myosin light chain (LC20)phosphorylation in the presence of Ca
2 + -calmodulin and
the determination of myosin Mg2 + -ATPase activity by Malachite green method． The effect of epoxyauraptene on my-
osin light chain kinase (MLCK)expression was measured by western blot． RESULTS Epoxyauraptene inhibited
the phosphorylation of MLCK in the rang of 20 － 320 μmol /L in dosage response mode at 5 － 20 min intervals in
time response mode，and inhibited myosin Mg2 + -ATPase activity at 5 －20 min intervals and MLCK expression in the
range of 40 －320 μmol /L at 0-96 h intervals in time response mode． CONCLUSION Epoxyauraptene could inhibit
the gastrointestinal smooth muscle contraction by inhibition of the smooth muscle myosin and MLCK expression．
KEY WORDS:epoxyauraptene;myosin light chain;myosin light chain kinase;smooth muscle
枳实来源于芸香科柑橘属干燥幼果［1］，有文
献报道称，柑橘属植物中所含有的香豆素类化合物
有抗癌［2］，抗凝血［3］，抗炎和抗病毒［4］的作用，
其中一些香豆素类衍生物还被用作冠脉扩张药［5］。
从麸炒枳实中分离得到一个单体化合物，经查
阅1H-NMR、13C-NMR 数据与文献一致［6］，故鉴定
此化合物为香豆素类化合物环氧橙皮油素 (ep-
oxyaurapten)。目前国内外关于环氧橙皮油素药理
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作用的研究报道较少，更未见此化合物对平滑肌作
用的研究报道。肌球蛋白的磷酸化程度及 Mg2 +
-ATPase活性可以反映平滑肌组织的收缩性能［7］，
而肌球蛋白轻链激酶 (MLCK)又是平滑肌细胞收
缩的关键调节蛋白［8］。本实验为了探讨环氧橙皮
油素对平滑肌的作用特征，选择了离体肠平滑肌收
缩活动、肌球蛋白磷酸化以及肌球蛋白 Mg2 + -AT-
Pase活性等为指标进行研究。为了进一步探讨环
氧橙皮油素可能的作用机理，采用 western blot 法
检测了 epoxyaurapten 对平滑肌细胞中 MLCK 表达
量的影响。
1 材料
1. 1 仪器 DYY—12 型电泳仪 (北京六一仪器
厂) ，DYCP—40C 半干半转印槽 (北京六一仪器
厂) ，TGL—16C 型离心机 (上海安亭科学仪器
厂) ，InnovaU570 型 － 80℃冰箱 (美国 NBS公司) ，
UV—1800 型紫外可见分光光度计 (北京瑞利分析
仪器公司)。
1. 2 试药 环氧橙皮油素 (实验室自制，纯度 ＞
98%) ;苯甲基磺酰氟 (PMSF) ，二硫苏糖醇
(DTT)及抗 MLCK 抗体购自 sigma 公司;乙二醇
二乙醚二胺四乙酸 (EGTA)购自 wako 公司;
DMEM培养基，标准胎牛血清 (FBS)和青链霉素
溶液购自 Gibco公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗
兔 IgG购自河北博海生物工程有限公司;蛋白提取
试剂盒，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，Braford 蛋白
含量检测试剂盒，蛋白分子量 Marker，加强型 ECL
检测试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限
公司。
1. 3 实验动物 BALB /C 小鼠，雌雄兼用，体质
量 18 ～ 22 g，由大连医科大学实验动物中心提供，
合格证号:SCXK (辽)2008-0002。
2 实验方法
2. 1 蛋白纯化 实验中所用肌球蛋白和肌球蛋白
轻链激酶是从新鲜鸡胃部平滑肌中提取、纯化
而来［9］。
2. 2 磷酸化反应 平滑肌肌球蛋白轻链的 Ca2 +依
赖性磷酸化的条件为 20 mmol /L Tris-HCl (pH7. 4)
缓冲液中含有 1 mmol /L DTT，5 mmol /L MgCl2，
60 mmol /L KCl，0. 1 mmol /L CaCl2，0. 6 mmol /L钙
调蛋白，4 μmol /L肌球蛋白和 2 mmol /L ATP。
20 kDa肌蛋白轻链 (LC20)磷酸化后，含有
溴酚蓝和甘油的样品与固体尿素混合，上样，采用
10%的甘油酰胺凝胶电泳测定 LC20磷酸化水平。采
用 Scoin图像处理软件分析 LC20磷酸化百分比，其
中把单磷酸化的 20 kDa 肌球蛋白轻链选定为阳性
对照，设为 100%［10］。
2. 3 Mg2 + -ATPase 活性测定 肌球蛋白 Mg2 + -
ATPase活性测定采用孔雀绿法 (Malachite green) ，
测定游离磷的量。测定条件为 20 mmol /L Tris-HCl
(pH7. 4)缓冲液中含有 1 mmol /L DTT，5 mmol /L
MgCl2， 60 mmol /L kCl， 0. 1 mmol /L CaCl2，
0. 6 mmol /L钙调蛋白，4 μmol /L 肌球蛋白和
0. 5 mmol /L ATP。25 ℃孵育 10 min。以未磷酸化
肌球蛋白的 Mg2 + -ATPase 活性为 100%，其余与其
相比得相对值［11］。
2. 4 细胞培养 BALB /C 小鼠短颈处死，取小肠，
冷 PBS液洗净肠内容物，迅速将肠管移入试管中，
剪碎肠管 (2 mm × 2 mm) ，加胰酶适量，试管反
复吹打，后置水浴锅中，37 ℃消化 15 min。取出
试管，1 500 r /min 离心 10 min，弃上清。沉淀如
上重复操作一次，弃上清。沉淀中加入细胞培养
液，反复吹打，过 70 μm 细胞筛网，收集滤液，
1 500 r /min离心 10 min，弃上清。沉淀中再次加
入细胞培养液，重复上述操作两次。最终加入定量
细胞培养液 (DMEM 培养液中含有 10% FBS 和
1%的青链霉素) ，以 1. 5 × 106 细胞数分装到细胞
培养板中，放入 CO2 培养箱中孵育
［12］。
2. 5 western-blot实验 取已经传 3 ～ 4 代的平滑肌
细胞放在含 10% FBS 和 1%青链霉素细胞培养基
中，加入不同浓度的环氧橙皮油素样品孵育 (或
相同浓度环氧橙皮油素不同孵育时间)。孵育结束
后，收集细胞，离心，弃上清，沉淀加入 PBS，反
复吹打，离心，弃上清液，沉淀中加入细胞裂解
液，离心，吸取上清，测定蛋白量。每组上样量为
20 μg，进行 SDS-PAGE 及 western-blot 实验。采用
Scoin图像处理软件分析条带。
2. 6 统计学分析 实验结果以均值 ± 标准差
(x ± s)表示，t检验，P ＜ 0. 05 有显著性差异，具
有统计学意义。
3 实验结果
3. 1 不同浓度环氧橙皮油素对肌球蛋白磷酸化的
影响 不同浓度环氧橙皮油素对平滑肌肌球蛋白轻
链的 Ca2 +依赖性磷酸化程度，由 20 μmol /L 时的
(98. 9 ± 6. 0)%，与阳性对照组比较无显著性差
异，到环氧橙皮油素浓度为 40 μmol /L 时的
(56. 1 ± 7. 6)%，80 μmol /L时的 (51. 4 ± 4. 0)%，
160 μmol /L时的 (40. 0 ± 5. 5)%和 320 μmol /L 时
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的 (16. 7 ± 6. 4)%。随着环氧橙皮油素用药浓度
的增加，肌球蛋白磷酸化的程度呈现逐渐降低的趋
势。见图 1。图 1A为平滑肌肌球蛋白轻链的 Ca2 +
依赖性磷酸化甘油 －聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，其
中 LC20代表 20 kDa肌球蛋白轻链，p － LC20代表单
磷酸化的 20 kDa 肌球蛋白轻链，LC17代表 17 kDa
肌球蛋白轻链。0 ～ 6 分别为阴性对照组，阳性对
照组，20、40、80、160、320 μmol /L 环氧橙皮油
素组。图 1B为 Scoin 图像处理软件扫描肌球蛋白
磷酸化统计结果柱状图，完全单磷酸化记为
100%，其他数值均为与其百分比值。
图 1 不同浓度环氧橙皮油素对肌球蛋白磷酸化的
影响 (x ± s，n =6)
Fig. 1 Effect of LC20 phosphorylation by MLCK at
different epoxyaurapten concentrations
3. 2 环氧橙皮油素对不同孵育时间肌球蛋白磷酸
化的影响 实验中选择 80 μmol /L环氧橙皮油素作
为样品量，考察了孵育时间分别为 5、10 和 20 min
时间内，环氧橙皮油素对肌球蛋白磷酸化的影响。
孵育时间分别为 5、10 和 20 min 时，肌球蛋白磷酸
化程度分别为 (82. 9 ± 5. 2)%，(65. 9 ± 5. 1)%和
(51. 6 ± 2. 7)%。实验结果表明，随着孵育时间的
延长，肌球蛋白磷酸化程度逐渐降低。见图 2。图
2A为平滑肌肌球蛋白轻链的 Ca2 +依赖性磷酸化甘
油 － 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，其中 LC20代表
20 kDa肌球蛋白轻链，p － LC20代表单磷酸化的
20 kDa肌球蛋白轻链，LC17代表 17 kDa 肌球蛋白
轻链。0 ～ 4分别为阴性对照组，阳性对照组，5、
10、20 min 孵育时间组。图 2B 为 Scoin 图像处理
软件扫描肌球蛋白磷酸化统计结果柱状图，1 为阳
性对照组，2 ～ 4 为 5、10、20 min孵育时间组。
3. 3 环氧橙皮油素对肌球蛋白 Mg2 + -ATPase 活性
的影响 由图 3 可见，孵育时间为 5 min 时，环氧
橙皮油素浓度在 40 ～ 320 μmol /L 之间，肌球蛋白
Mg2 + -ATPase活性由 (225. 5 ± 25. 7)%降低到后来
图 2 环氧橙皮油素对不同孵育时间肌球蛋白磷酸
化的影响 (x ± s，n =6)
Fig. 2 Effect of epoxyaurapten on LC20 phospho-
rylation by MLCK at different
incubation time
的 (104. 67 ± 7. 39)%;孵育时间为 10 min 时，环
氧橙皮油素浓度在 40 ～ 320 μmol /L 之间，肌球蛋
白 Mg2 + -ATPase 活性由 (295. 7 ± 38. 8)%降低到
后来的 (128 ± 7. 1)%;孵育时间为 20 min 时，环
氧橙皮油素浓度在 40 ～ 320 μmol /L 之间，肌球蛋
白 Mg2 + -ATPase 活性由 (324. 2 ± 42. 1)%降低到
后来的 (144. 3 ± 5. 2)%。由此结果可以看出，随
着环氧橙皮油素用药浓度的增加，Mg2 + -ATPase 活
性呈逐渐降低状态。
图 3 环氧橙皮油素对肌球蛋白 Mg2 + -ATPase 活性的影响
(x ± s，n =6)
Fig. 3 Effect of different concentrations epoxyaurapten at
different incubation time on myosin Mg2 + -
ATPase activity
3. 4 不同浓度环氧橙皮油素对肌球蛋白轻链激酶
(MLCK)表达水平的影响 实验采用 western-blot
法，观察不同浓度环氧橙皮油素作用下肌球蛋白轻
链激酶表达水平，结果见图 4。图 4A 为不同浓度
环氧橙皮油素作用下肌球蛋白轻链激酶表达 west-
ern-blot图谱，其中 1 为空白组，2 ～ 5 为 40、80、
160、320 μmol /L环氧橙皮油素组。图 4B 为 Scoin
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图像处理软件处理出来的光密度值经过统计分析结
果柱状图。图 4A直观的展现了实验结果，随着环
氧橙皮油素用药浓度的增高，肌球蛋白轻链激酶条
带越来越弱。实验中选择环氧橙皮油素用药浓度分
别为 40、80、160、320 μmol /L，由 Scoin 图像处
理软件处理出来的光密度值经过统计分析，结果为
(69. 0 ±3. 9)%，(58. 1 ± 4. 6)%，(25. 3 ± 5. 5)%，
(20. 0 ± 4. 2)%。由实验结果可见，环氧橙皮油素
用药浓度越高，越能抑制肠管平滑肌细胞肌球蛋白
轻链激酶表达。
图 4 不同浓度环氧橙皮油素对肌球蛋白轻链激酶
(MLCK)表达水平的影响 (x ± s，n =6)
Fig. 4 Western-blots depicting the effect of differ-
ent epoxyaurapten concentrations on ML-
CK expression
3. 5 环氧橙皮油素对不同孵育时间肌球蛋白轻链
激酶 (MLCK)表达水平的影响 80 μmol /L 环氧
橙皮油素在不同孵育时间下对肌球蛋白轻链激酶表
达水平的影响，结果见图 5。图 5A 为相同浓度环
氧橙皮油素对肠平滑肌细胞不同孵育时间作用下肌
球蛋白轻链激酶表达 western-blot 图谱。图 5A 中
1 ～ 6 分别为空白组、12、24、48、72、96 h 孵育
时间组。图 5B 为 Scoin 图像处理软件分析出来的
光密度值经过统计分析结果柱状图。实验中选择环
氧橙皮油素用药浓度为 80 μmol /L，孵育时间分别
为 12、24、48、72、96 h，由 Scoin 图像处理软件
处理出来的光密度值经过统计分析，结果为
(86. 8 ±6. 0)%、(73. 5 ± 8. 7)%、(55. 0 ± 4. 2)%、
(30. 1 ± 4. 9)%、 (21. 3 ± 5. 4)%。由统计结果可
见，在环氧橙皮油素作用下，随着细胞孵育时间延
长，肌球蛋白轻链激酶表达水平逐渐降低。
4 讨论
实验结果表明，在纯化的肌球蛋白反应体系
图 5 环氧橙皮油素对不同孵育时间肌球蛋白轻
链激酶 (MLCK)表达水平的影响 (x ± s，
n =6)
Fig. 5 Western-blots depicting the effect of ep-
oxyaurapten on MLCK expression at dif-
ferent incubation time
中，环氧橙皮油素能够在 Ca2 +依赖性磷酸化肌球
蛋白条件下抑制 LC20磷酸化程度和肌球蛋白 Mg
2 + -
ATPase活性。这一结果表明环氧橙皮油素可通过
抑制平滑肌肌球蛋白的功能，对肠平滑肌的收缩性
显示出抑制作用。MLCK 表达量的多少直接影响
LC20磷酸化程度和肌球蛋白 Mg
2 + -ATPase 活性，通
过 western blot实验结果显示，环氧橙皮油素能够
抑制平滑肌细胞中 MLCK 的表达，随着环氧橙皮
油素用药浓度的加大以及孵育时间延长，MLCK 表
达量呈现逐渐降低的趋势。本实验结果表明，环氧
橙皮油素对抑制平滑肌收缩的作用机理与抑制 ML-
CK的表达相关。
有关环氧橙皮油素药理研究的报道相对较少，
这一实验结果，为以后深入探讨环氧橙皮油素对平
滑肌收缩作用机制以及其临床应用提供了重要的信
息。对环氧橙皮油素的研究，下一步的实验将主要
从病理模型入手，考察环氧橙皮油素对疾病模型的
治疗作用，为其临床应用提供一定的药理依据。
参考文献:
［1］ 辛 然，陈 彦，贾晓斌，等． 枳实中黄酮成分及其提取
物大鼠肠吸收特征研究 ［J］． 中国中药杂志，2010，35
(14) :1850-1854.
［2］ Hirata T，Fujii M，Akita k，et al． Identification and physiologi-
cal evaluation of the components from Citrus fruits as potential
drugs for anti-corpulence and anticancer ［J］． Bioorg Med
Chem，2009，17 (1) :25-28.
［3］ Manolov I，Topashka-Ancheva M，Klouchek E． The synthesis，
toxicological and comparative cytogenetic characteristics of the
anticoagulant warfarin ［J］． Eksp Med Morfol，1993，31 (3-
5581
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第 34 卷 第 10 期
中 成 药
Chinese Traditional Patent Medicine
October 2012
Vol． 34 No． 10
4) :49-60.
［4］ 张 红，孙明江，王 凌． 枳实的化学成分及药理作用研
究进展 ［J］． 中药材，2009，32 (11) :1787-1790.
［5］ 胡 静，廖茂梁，韦 玮，等． 枳实中辛弗林的固相萃取
-HPLC 测 定 ［J］． 中 国 中 药 杂 志， 2010， 35 (6) :
736-738.
［6］ 杨武亮，陈海芳，余宝金，等． 枳壳活性化学成分研究．
中药材 ［J］． 2008，31 (12) :1812-1815.
［7］ 徐志立，唐泽耀，林 原． 小檗碱对平滑肌肌球蛋白功能
及胃肠平滑肌收缩性的影响 ［J］． 现代生物医学进展，
2009，9 (7) :3216-3218.
［8］ Olson N J，Pearson R B，Needleman D S，et al． Regulatory
and structural motifs of chicken gizzard myosin light ［J］． Proc
Natl Acad Sci USA，1990，87 (6) :2284-2288．
［9］ 杨静娴，韩国柱，李淑媛，等． 非钙依赖性调节肌球蛋白
活性对维持平滑肌张力的影响 ［J］． 中国临床康复，2005，
9 (6) :133-135.
［10］ Yang J X，Wang X M，Tang Z Y，et al． The characterization of
myosin light chain phosphorylation by the constitutively active
fragment of MLCK ［J］． Chin Med Sci J，2003，18 (4) :
206-212.
［11］ Zhang H L，Tang Z Y，Yang J X，et al． Bi-directional regula-
tion of emodin and quercetin on smooth muscle myosin of gizzard
［J］． FEBS Lett，2006，580 (2) :469-473.
［12］ 崔魏巍，梁朝朝，叶元平，等． 大鼠前列腺平滑肌细胞的
培养及其电压依赖性钙通道的表达 ［J］． 中国男科学杂
志． 2009，23 (1) :19-22．
复方新蒿颗粒抗菌及提高免疫力作用研究
张兰兰1， 孙玉华1， 吴丽艳2， 靳洪涛3， 徐 磊1， 哈木拉提1， 刘晓燕1
(1. 新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆 乌鲁木齐 830000;2. 新疆维吾尔自治区人民医院，新疆 乌鲁
木齐 830004;3. 中国医学科学院药物研究所，北京 100050)
收稿日期:2012-01-11
作者简介:张兰兰 (1983—) ，女，助理研究员，硕士，从事药理毒理学研究。Tel: (0991)2320296，E-mail:zhanglanlan_ 83@ yahoo．
com． cn
摘要:目的 通过药理学试验评价复方新蒿颗粒抗炎、抗菌、提高免疫力的作用。方法 观察新蒿颗粒对小鼠血清溶
血素含有量和 B细胞增殖的影响;采用平皿法和液体稀释法对新蒿颗粒进行体外抗菌实验研究;体内抗菌实验以新蒿
颗粒和阳性药物组灌胃给药 3 d，小鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌和大肠杆菌造成感染，观察记录感染 7 d 内各组小鼠
的死亡情况。结果 复方新蒿颗粒中剂量、高剂量可以提高正常小鼠血清溶血素水平介于 0. 005 ～ 1 mg /mL促进小鼠
B淋巴细胞体外增殖;复方新蒿颗粒对金黄色葡萄菌和大肠杆菌均有抑制作用，其 MIC均为 500 mg /mL，其 ED50均为
19. 5 g /kg。结论 复方新蒿颗粒具有一定的抗菌以及提高免疫力的作用。
关键词:新蒿颗粒;抗炎;抗菌;免疫作用
中图分类号:R285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2012)10-1856-06
Effects of Compound Xinhao Granules on anti-bacterium and stimulating immunity
ZHANG Lan-lan1， SUN Yu-hua1， WU Li-yan2， JIN Hong-tao3， XU Lei1， Hamulati1，
LIU Xiao-yan1
(1. Xinjiang Institute of Materia Medica，Urumqi 830000，China;2. The Peopel’s Hospital of Xinjiang，Urumqi 830004，China;3. Institute of Materia
Medica，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China)
ABSTRACT:AIM To explore the pharmacology test evaluation of Compound Xinhao Granules on anti-
inflammation，anti-bacterium and improving immunity function． METHODS Hemolysin content and B cell prolif-
eration in mice fed with Compound Xinhao Granules were observed． Cultured dish and liquid dilution were applied
to in vitro and in vivo anti-bacterium test of Compound Xinhao Granules． The latter mice took Compound Xinhao
Granules by intragastric administration three days and were injected with Staphylococcus aureus and Escherichia coli
to observe the fatality rate of mice within seven days． RESULTS Compound Xinhao Granules in middle and high
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