全 文 ：遗 传 学 报 , t s ( 2 ) : 1 0 2一 1 1 0 , 1 9 8 8
通以。 `油. . 时e o s 耐“
具有原核基因启动子活性的蓖麻蚕
染色体 D N A 片段
刘小明 沈绿萍 李载平
(中国科学院上海生物化学研究所 )
利用大肠杆菌启动子克隆载体 p H SE , 研究了蓖麻蚕染色体的 所记川 酶解片段在大肠
杆菌中作为四环素坑性基因启动子的功能作用 。 蓖麻蚕染色体的 角耐 11 片段与 州 5E 重
组 ,在大约 1 .0 个重组于中获得 95 3 株启动子重组体 。 测定了这些含有宜组质拉的菌株抗四
环素能力 ,其中有 。 株在平板上抗四环素水平超过 2” 微克 /毫开 。 对其中 户 R 2P 01 的插人
片段进行了限制性图谱分析和启动子活性区域的缺失定位 , 证 明了 p人 R卜 D B (由 p A RP 20 ,
衍生而来 )中的约 0 . s k b的外源擂入片段具有完整的原核启动子功能 。 我们分析了这段 D N A
的部分核昔酸顺序 ,发现它与原核基因启动子极其相似 。
关健调 : 蓖麻蚕染色体 ,大肠杆菌启动子克隆载休 , 四环素抗药性 , D N A 顺序
在基因工程操作中 , 要使目的基因高效表达 , 启动子的选择和使用极 为重 要。 为
了广泛地收集高效启动子 , 弄清它们的结构与功能关系 , 专门构建了许多启动子克隆载
体吻 ,.3 ” 。 这些载体质粒上虽然具有抗四环素基因的编码顺序 ,但由于启动子已经被切除 ,
整个基因不能表达 , 其宿主菌在四环素培养基上不能成活。 若在 四环素抗性基因之前擂
人新的启动子 , 可以使四环素抗性得到恢复 , 以此可以对各种启动子进行筛选 。 已有的报
道指出 ,这样的启动子克隆载体不仅能探查原核染色体中的启动子山 , 而且发现在某些真
核生物的染色体 D N A 中 , 存在着一些具有原核启动子功能的 D N A 片段氏 ` ,10 .13 ,。
我们利用大肠杆菌启动子克隆载体 pH E S叫 , 克隆并分离出许多蓖麻蚕染色体 D N A
的 H细 d n l 片段 ,它们具有原核基因的启动子活性。 通过抗四环素能力测定 、 活性片段
的缺失定位及其 D N A 核昔酸序列分析 , 证明我们所克隆到的活性片段具有原核基因启
动子的典型结构和高效的活力。 本文的结果有助于加深我们对原核启动子与真核启动子
相互关系的认识 , 指出了这一筛选模型对于获得高效启动子的有效性 , 对这一工作的理论
意义和应用前景进行了讨论 。
材 料 与 方 法
(一 ) 质拉 D N A 、 染色休 D N A 的制备 质粒 D N tA ` , 和大肠杆菌染色体 D N A山 l
的制备均按文献报道的方法进行 。 制备大分子量的蓖麻蚕染色体 D N A 参考 R e e d e r山 i
的方法。
本文于 19 8 6年 12 月 1 1 日收到 , 1 9 8 7 年 今月 10 日修回 。
2期 刘小明等 : 具有原核基因启动子活性的蓖麻蚕染色体 DN ^片段
(二 ) 酶制剂及其作用条件 、大肠杆菌转化按文献 〔9 ] , 琼脂糖凝胶电泳和缺 口翻译按
文献【1 1 方法进行。 D N A 墨迹转移杂交按文献 L1 9] 进行。
限制性内切酶和 T 4 D N A 连接酶由我组工具酶小组提供 。 蛋白酶 K 和碱性磷酸醋
酶为 B R L 公司产品 , RN as e A 和 D N as e l 为东风生化试剂厂产品 , D N A 聚合酶和多
核昔酸激酶为中科院生物物理所制品 。 同位素试 剂 卜少 lP dA T P 、 a[ 一匀P] dC T P 和
[下一勺 ] A T P 均为 A M E R s H A M 产品 。 酶反应的条件采用 B R L 公司推荐条件进行 。 其
它操作条件见参考文献。
(三 ) 不同菌株抗四环素能力的测定 将含四环素 25 微克 /毫升的 L B 平 板 上 生
长出的抗性转化子 ,用牙签分别接种到一系列四环素浓度更高的平板上 , 37 ℃ 培养 24 小
时 , 观察有无菌落生成 。 重组子恰能生长的平板上四环素的浓度就是固体培养基中的抗
四环素上限 。 用液体培养的测定方法是将含有不同质粒的过夜培养菌液 , 以 .0 5肠 接种
t 接人含不同浓度四环素的 L B 培养基中 , 四环素浓度为 0一 1 0 微克 /毫升 , 37 ℃ 振荡
培养 5 小时 , 在波长 6 0 o n m 处光吸收的强弱表示细胞的生长情况 。
(四 ) D N A 核昔酸顺序分析 质粒 P A R P一 D B 用 ( l ) P , 2 1 作用或 ( 2 ) H i , d 111
作用 , 磷酸酶脱去 5 `一磷酸基团 , 用 T 4 多核昔酸激酶以 [了 一 J牛 } A T P 标记 D N A 的 夕-
末端 ,再用 刀9 2 1一 作用 , 电泳展开并回收约 0 . , k b的标记片段 , 按 M a ` a m 一G il b e r t L, , , 化学
降解法测定核昔酸顺序 。
结 果
(一 ) 具有原核启动子活性的 D N A 片段的克隆和表达
质粒 p H E S 是由 p B R 32 2 衍生而来的 , 具有氨苯青霉素抗性的筛选标记 。 虽然质
粒上也有四环素抗性的结构基因 , 但 由于这个基因的启动子已经被切除 , 携带 p H ES 的
菌株在四环素培养基 ( 25 微克 /毫升 )上是不能成活的网。 当 p H ES 的 H份 dl u 切点处
插人外源启动子后 , 便能使携带这种质粒的菌株恢复对四环素的抗性 。 利用这一特点 ,我
们用 H坛 dl l 分别酶解蓖麻蚕染色体 D N A 和质粒 p H SE D N A , 载体经碱性 磷酸酶
脱去 5’ 一末端磷酸基团后 , 休外重组 , 转化 ca 升 处理过的大肠杆菌 c 6 0 0 , 在含有 50 微
克 /毫升氨苯青霉素和 25 微克 /毫升 四环素的 L B 培养基平板上筛选 , 如图 1 所示 , 共获
得 9” 株抗药性菌落。 将平板中四环素浓度逐步提高 , 存活的转化子数量明显减少 , 在
1 0` 个氨苯青霉素抗性转化子中 ,有 20 株四环素抗性基因的表达极强 , 它的平板抗 四环素
水平超过 20 0 微克 /毫升 (表 1 ) 。
p H SE 质粒转化株在含 25 微克 /毫升四环素平皿上是不生长的 , 为了筛选具有原核
基因启动子的蓖麻蚕染色 D N A 片段 , 避免人为的四环素诱发的因素 , 在实验设计上 , 我
们分两批进行。第一批得 5 01 个抗药性菌落 ( 25 微克 /毫升四环素浓度 ) , 然后以 5 0 、 10 、
12 .5
· · …微克 /毫升递增 ,得到相应这些浓度菌落数。 第二批实验是在 25 微克 /毫升四环
素平皿上得 4 52 个抗药性菌落 , 并直接转接于 1 0 0 、 1 25 、 ……微克 l毫升四环素平皿 , 得相 、
应菌落数与第一批一致 (表 l ) 。 因此我们认为这些耐高浓度四环素菌落基本上是由于具
有原核基因启动子活性的蓖麻蚕染色体 D N A 片段插人所致 。
(二 ) , 组质粒的抗四环素能力
遗 报10 弓 传 学 . 15 卷
场矛n
转化 , 垫体曲.E c o il C 60 。
寸r an s f e mr a iot n , 丑 `口花 C eo o as a h o s t
1
T c 葬脂帅选
叙卜c 石o n On cT 一agr 少est
图 l 用 p H E S 克陇具有原核启动子活性的蓖麻蚕染色体 D N A 片段
F i g
. 砚 C l o n i . g o f t h o D N A f r a g m e n t . h a v i n g P r o k . r萝 o t i e p r o m o : 。 r . e t i v i t i。 一 1.
p H E , f r o m t h o e h r o m o . o m 。 , D N A o f s i l k钾 o r 口 滩 . r州 叮 .
狡 l 不同四环工浓 度下的转化子 .
T
. b l e 1 N u 口 b e r o f t r一 n * f o r m o d e o l o n i e s 1 0 d if e r e n t e o n e o n仁r a t i o n o f r e七r a c犷e l i n .
转化于数 四环素的浓度阿u m b e r o f t r a n s f o r m e d C o n e o n t r . t i o n o f t e t r . c y c l i n e (尸` l m l )
c o l o n i e . 2 , S0 10 0 12 5 1 50 1 7 5 2 0 0 22 , 2 , 0
实脸 l 5 0 1 1 9 3 4 9 30 l 9 1 5 12 3 0
E x P
.
I
实验 1 4 52 N D , 5 3 l l 4 9 8 I 0
E x P
.
11
合计 9 5 3 N D 1 0 4 6 l 3 3 2 4 2 0 月 0
T o t a l
为了更精确地测定重组质粒的抗四环素能力 , 我们对抗性最强的几个重组子进行了
液体培养四环素抗性测定 。 若以不含四环素时细菌生长的光密度为百分之一百 , 将不同
抗菌素浓度下细菌生长的光密度下降的百分数与四环素浓度的关系作图 , 部分结果见图
2期 刘小明等 : 具有原核基因启动子活性的蓖麻蚕染色体 DN A 片段
/ \沐毛
、
龟
l
` 气
1
、
、
、
、
龟
}
_ 必些
卜“p日
如
0468C
七塌云p匀召兮眉器.”石心。.已。吕翔
ǎ欲à赞众世恤卜侧御积
C o n e e n r ta询n
圈环素浓度 `
o fe tr tac y e断e (脚 g/功珍
图 2不同四环素浓度中含重组质校菌株的生长情况
F i二 2G r o w th o f乙 `讨` 一l r a i一 ha r b o r i n ` d i f fe r e n r p l一 sm i d si n d i f fe r e n t
te tr 一c 萝e l i o e e o n c e n r r . ti o n .
o 2如取光密度下降 50 肠 时的四环素浓度表示细菌的抗药水平 ,在我们的条件下 , 带有质
拉 p A R2P 01 和 p A R P一 D B 的菌株抗四环素能力约为 25 微克 /毫升 , 而克隆载体 p H E ,
菌在相同条件下还不到 2微克 /毫升 ,在四环素存在下完全丧失生长能力。
(三 ) 皿组质粒 p A R P 2 01 的限制性陇切图讼和 p A R P 一 D B 的构珍
用 H i o d l l l 分别作用 p A R P Z o l 、 p A R P 2 0 5 、 p A R P 3 2 4 和 p A R P 4 0 2 (这 4 个重组
质粒的抗四环素能力最高 , 在 2 5 微克 /毫升四环素的琼脂上能够生长 ) , 切出外源插人
片段 , 以 几 D N A /H份 dl n 片段为分子量标准 ,确定了各重组质拉插人片段的大小分别是
1
.
9
、
5
.
8
、
4
.
1 、 1
.
6 k b
, 如图 3 a 所示 。 对插人片段只有 1 . g k b 的 P A RP 2 0 1 作 7 种大切口
酶 ( B a , H l 、 B gl l 、 cE o R l 、 K娜 I、 p , t l 、 S a l l 、 X b a l ) 的酶切试验 , 发现 B gl l 和
几 , I 在这个外源插人片段上各有 1个切点 , 再经 凡 , I 和 B a m 印 的联合酶切分析 (图
3 b )
, 确定 了重组质粒 p A R P 2 01 的限制性图谱 (图 4 a ) 。 为了定位 p A R P 2 01 中外源插
人片段中启动子活性区域 , 利用载体上和插人片段上各自存在的 B gl n 切点 , 去除了这
段 2 . s k b 的 B g l 11 片段 (其中含有 1 . I k b 长的载体 D N A ) , 环化后形成 P A R P 一 D B ( 见
图 4 b) 。 与 p A R P 20 1 比较 , 四环素抗性未受影响 (图 2 中已有比较 ) 。 这说明 p A R P一 D B
10 6通 传 学 报 15 卷
图 3 。 不同质拉经 i H, dl l 作用后的电泳结果
F i g
.
3 a 它l e e t r o P h o r e o i : o f t h e 阶 n d l l l d ig e s t e d D N A f r a g m e n t s f r o m d i f fo r e n t P 一` , . i d `
1
.
p A R P 2 0 1 ; 2
.
p A RI, 2 0, 忿 3
.
p A R P 3 2 4幕 4 。 p A RP 4 0 2 ; 5 . 浇D N A /付 I n d l l L
图 3 b p A RP 2 01 限制酶切产物的琼脂塘凝胶电泳图
P 19
·
3 b E l e e r r o p h o r e s i s o f t h e r e s t r i e t i o n f r a g m e n t s o f p A RP 2 0 I w i ht d i f f
。 , e n t
e n d o n u c l e a 昌e s
1
.
B。 , H l ( 8
一
7 k b ) ; 2
· 忍门 R I ( 8· 7 k b ) ; 3 · B窟 1 11 ( 2 · s k b , 6 . 2 k b ) ; 4 · s a l l ( 8 · 7 k b ) ;
5
·
K P o l ; 6
一几` I ( 3 · 6 k b , 5 · I k b ) ; 7 . 大b a l ; 8 .月 i n d 111 ( 1 . g k b , 6 · s k b ) ; 9 · B a . H l +
tP l ( 0
·
4 k b
,
3
·
Z k b
,
,
·
I k b )
·
中长约 .0 , k b的插人片段具有很强的原核启动子功能。
(四 ) p A R-P D B 质粒 O N A 的核昔酸顺序具有原核启动子的典型绝构特征
用 M ax o m一 G ib o r t 化学降解法测定了质粒 p人 R P一 D B 中插人片段的部分核苔 酸顺
序 。 图 a5 中的这段顺序紧接在载体 p H E S 四环素结构基因的 5’ 一上游 , 具有非常明显
的原核基因启动子结构特征 : ( 1) 第 85 一 90 位的 T A A A A T 顺序与原核启 动 子 中的
P r ib
n o w B o x 相对应 ; ( 2 ) 第 6 2一 6 7 位的 T T G c c T 顺序与原核启动子中一 3 5 位 的
顺序相一致 ; ( 3) 这两段顺序之间正好夹有 1 7 b p 的核昔酸长度 , 如图 5b 所示 。 另外 ,我
们发现所侧的 D N A 顺序中 A T 含量极为丰富 ,前 50 个核昔酸 ( 1一 50 ) 和后 50 个核昔
0 16通 传 学 报 5 1卷
图 3。 不同质拉经 Hi , dl l 作用后的电泳结果
F i g
.
3 a 它l e e t r o P h o r e o i : o f t h e 阶 n d l l l d ig e s t e d D N A f r a g m e n t s f r o m d i f fo r e n t P 一` , . i d `
1
.
p A R P 2 0 1 ; 2
.
p A RI, 2 0, 忿 3
.
p A R P 3 2 4幕 4 。 p A RP 4 0 2 ; 5 . 浇D N A /付 I n d l l L
图 3 b p A RP 2 01 限制酶切产物的琼脂塘凝胶电泳图
P 19
·
3 b E l e e r r o p h o r e s i s o f t h e r e s t r i e t i o n f r a g m e n t s o f p A RP 2 0 I w i ht d i f f
。 , e n t
e n d o n u c l e a 昌e s
1
.
B。 , H l ( 8
一
7 k b ) ; 2
· 忍门 R I ( 8· 7 k b ) ; 3 · B窟 1 11 ( 2 · s k b , 6 . 2 k b ) ; 4 · s a l l ( 8 · 7 k b ) ;
5
·
K P o l ; 6
一几` I ( 3 · 6 k b , 5 · I k b ) ; 7 . 大b a l ; 8 .月 i n d 111 ( 1 . g k b , 6 · s k b ) ; 9 · B a . H l +
tP l ( 0
·
4 k b
,
3
·
Z k b
,
,
·
I k b )
·
中长约 .0 , k b的插人片段具有很强的原核启动子功能。
(四 ) p A R-P D B 质粒 O N A 的核昔酸顺序具有原核启动子的典型绝构特征
用 M ax o m一 G ib o r t 化学降解法测定了质粒 p人 R P一 D B 中插人片段的部分核苔 酸顺
序 。 图 a5 中的这段顺序紧接在载体 p H E S 四环素结构基因的 5’ 一上游 , 具有非常明显
的原核基因启动子结构特征 : ( 1) 第 85 一 90 位的 T A A A A T 顺序与原核启 动 子 中的
P r ib
n o w B o x 相对应 ; ( 2 ) 第 6 2一 6 7 位的 T T G c c T 顺序与原核启动子中一 3 5 位 的
顺序相一致 ; ( 3) 这两段顺序之间正好夹有 1 7 b p 的核昔酸长度 , 如图 5b 所示 。 另外 ,我
们发现所侧的 D N A 顺序中 A T 含量极为丰富 ,前 50 个核昔酸 ( 1一 50 ) 和后 50 个核昔
1 . 8遗 传 学 报 l, 卷
图 6 s o u t h e r n 杂交 目显影
将 甘 . r讨奋染色休 O N A (1 ) 和蓖麻蚕染色体 D N A ( 2 ) 进行 iH n dl l 醉解并电泳展开 , 转移
到硝酸 ,纤维素膜上 , 与标记的 p A R P 2 0I 插人片段探针杂 交。
F i g
.
6 H y b r i d i名 一 t i o n o f H诊. d l l l一 d i g e s t e d e h r o m o . o m a l D N A 份 i t h
” p 一 l o b户 Ie d 卜 g k b f r a g . 户 n t f r o m p A R P 2 0 1
1
.
k
.
r o , D N A j } I r d l l l : 2
. 刁 . , , c’ n t D N A / H ` , , d ll L
休 , 我分1又作了 5 0[ , t h e r n 杂交 炙俭。 用缺 口翻译方法标记质粒 p A R P 2 01 中的外源插
人片段 , 与转移到硝酸纤维素膜上的蓖 沫笠染色体 D N A 的 H 。` dl n 酶解产物杂交 , 同
时以大肠杆菌染色体 D N A 的 H 份 d 川 酶解产物作对照 。 结果见图 6 , 这一探针专一地与
蓖麻蚕染色体 D N A 的 H汤 dl n 酶解产物形成杂交条带 。 这就证明了 p A R P 2 0 1 ( p A R P -
D B ) 中的插人片段确实来自于真核蓖麻蚕染色体 D N A。
另外 , 由于这一插人片段能使 p H SE 上的四环素抗性基因高效表达 , 所以它的结构
应该与高活力的原核启动子的结构相似 。 我们测定了 p A R P一 D B ( p A RZP O)I 中四环素
抗性基因的 5’ 一上游插人片段的 1 30 个核昔酸序列 , 虽然还不能排 除在 更远端 处 的 约
3 0 0 b p 核昔酸中存在另外的高活性启动子结构 , 但从所测顺序的结构和重组质粒中启 动
子的高活性等结果来看 , 靠近四 环 素抗性 基 因 的 “ T T G C C T一 1 7 b p一A T T A A A A护
( 62 一 90 )最可能是这一高效启动子的关键部位 。
(二 ) 启动子片段在染色体中的功能
原核基因的启动子的结构与真核基因启动子的结构有非常明显的差异 , 这不仅表现
在它们的启动子核昔酸顺序不同 , 还表现在启动于 与转录起始 点 的 相 对 距 离 不 一
样以刀司。 所以在一般情况下 , 原核启动子与真核启动子是不能相互替代的。 在一些特殊
的例子中 ,有些真核基因的启动子被证明能在原核系统中行使启动子功能。
M ist ial is 等人 t1’ 对鸟肿瘤病毒长末端重复顺序 ( L T R ) 的研究指出 , 它不仅能作 为
原核启动子指导抗四环素基因的表达 , 而且还能在真核 D N A 聚合酶 n 的离体反应中发
挥启动子的作用 。 eJ kn isn 等人网则证明 , s V 40 病毒早期和晚期转录单位的两个启 动
子都可以在大肠杆菌中起启动子作用 。 敖世洲等囚把筛选到的具有原核启动子活性的酵
母染色体 D N A 片段放回到酵母细胞 ,证明他所克隆到的酵母染色体 D N A 片段同时具
2 期 刘小明等 : 具有原核基因启动子活性的蓖麻蚕染色体 D ^ N片段 1 0,
. 2 启动子活性 , 组子在 , 姐子总盆中的比们
T . b l . 2
`
r b e p r o p o r t i o o o f rh e p r o口 o t e r一 e t i v e r e e o m b i n一 nt s t o ht e t o t一 r e e o m bi n一 nt .
D N A 来源 ( D N A s o u r e e一 )
B
.
c时 , b a e t e r i o P h a g e T 4
B ct 人` r扮 h`口 `以`
B口 c ` I之t’ ` r , bt il 行
R人“ o b i , 一附 r a 闪月介 ,’ 份
召 g l e . 口 e h lo r o p la o t
S口 c c八a r o份 y c “ c e r e 砂 r“ a `
T ct r口人梦份 ` n 口 t h` r 动口 P h日f a
N 己 .` , “ 户口护“ c r a “ a
D 犷“ o P人心口 功 el a n go a st ` ,
几f亡衬口` i l . a ` c a l a 护打
N P V
粗 ,
刁一名 , ` , ` 护 ,c , n , . ,
2 5
.
3 , 2` 。 2
2 9
。
3
2 5
。
0
9
。
8
3 3
。
0
2 7
.
4 , 2 8
。
4
7
。
5 7
4
。
7 4 , 4
.
6 ,
0
.
77
, 0
.
8 4
0
。
2 3
4 4
.
0
0
。
0 9 弓
1 ) 筛 选时四环素浓度以 20 微克 ,毫升 为标准 ,
p e r m l
.
2 ) 筛选时四环素浓度以 2 5 微克 ,毫升为标准 。
P e r m l
T e t r ` e v e l i n e 仁 o n C七 n t f ` t 1 0 n
C O O C e n t t盆 t! o n
f o r
: e l e ct i o 。 三5 2 0 m i e r o g r a .
. t r a c y c一 I n e f o r s e l e c t i。 , 15 2 5 m 一 e r o g r . 口
有原核基因启动子活性和真核基因启动子的活性。 从我们对高等真核生物蓖麻蚕的实验
结果来看 , 所测的 D N A 顺序 中 , 第 83 到第 90 位的核昔酸顺序 A T T A A A A T 与原核启
动子的 P r ib n o w B o : “ T A T A A T , 和真核启动子的 H o g n e s 、 B o 、 “ T A T A A A A T ” 都很
相似 , 所以 , 这段蓖麻蚕染色体 D N A 片段有可能既是真核基因的启动子 , 又能在原核细
胞中代替原核启动子行使功能 。 在这方面作进一步地研究 , 把我们克隆到的具有高度原
核 启动子活性的蓖麻蚕染色体 D N A 片段 , 通过蓖麻蚕核多角体病毒 ( A r N P v ) 导人蓖
麻蚕细胞 ,研究它们在蓖麻蚕细胞中的功能情况 , 将能更加深人地揭示高等真核生物与原
核生物间基因启动子的结构与功能关系 。
(三 ) 启动子片段在蓖麻蚕染色体 O N A 中的比例
在真核染色体 D N A 中 , 具有原核启动子活性的 D N A 片段毕竟是极少数 。 如果假
设蓖麻蚕染色体 D N A 的所有 H份 dl l 片段都以同等效率被重组到 p H SE 的 H份 dl l
切点中去 , 那么 , 具有启动子活性的重组子出现的频率约为 0 . 1佑 ( 95 3 A rP T cr 八0’ A 护
T c
,
)
。
N e v e 等人 〔1,1 曾用这 种方法比较过一些原核和真核生物 D N人 中具有启动子活性
重组子出现的频率 , 其中以 E u g l e n a 叶绿体 ( E u g l e n a C h lo r o p l a : t ) 的频率为最高 (达
3 呱 ) 。 果蝇等昆虫的染色体 D N A 的频率在 l关 以下 , 与我们的蓖麻蚕染色体 D N 人
的结果相当 (见表 2 ) 。
本文的结果已经证明 , 原核启动子克隆载体 p H SE 能有效地被用 来探查蓖麻蚕染色
体中具有原核启动子功能的 D N A 片段以及它们的启动子强度分布情况 。 、真核基 因 组
具有非常庞大的特点 , 提供了大量筛选具有高效原核启动子活性的 D N A 片段的丰富资
源 。 研究这些启动子强度分布特点 、 D N A 顺序结构 , 以及在原核和真核系统中的功能
关系 , 开辟了一条研究基因表达调控和调控基因进化的新途径 , 对于人工合成高效启动
1 10 遗 传 学 报 l , 卷
、 真核一原核两用启动于都有指导意义 。 另外 , 把由此获得的高效启动子装人表达载
, 直接用于经济效益高、 生产价值大的酶基因 、激素基因 、 抗生素基因等外源基因的表
, 将有巨大的生产潜力。
参 考 文 献
子休达
1 1 1 吴祥甫等。 19 8 3。 遗传学报 , z。 ( 3 ) : 17 5一 17 9 0
[ 2 1 忻纪厚等。 19 8` 。 中国科学 , B 辑 , 第四期 , 35 9 一 , 9 5。
[ 3 ] 敖世洲等。 一9 85。 生物工程学报 , l : 49一 5 3 0
[ 呼 1 B o e k in g h a m , K
.
: 1 9 8 2
.
T五。 C o l l N “ c l , : v o l . X o d . p P . 2 10一 2 16 .
[ 5 ] B
o n o i s t
,
G
.
e t a l
.
: 19 8 1
.
N a : , r 。
,
2 90 : 3 0 4一 3一0 .
[ 6 1 B i
r n d o i m
,
H
.
C
.
e t a l
.
: 19 79
.
N cu l
. 才 c i沙s R , s , 7 : 1 5 13 .
[ 7 I aC
: a d a b a n
,
M
.
J
.
e t a l
.
: 19 8 0
.
J
.
M
o l
.
B i
o l
. ,
13 8
:
17 9一 20 7 .
r 8 1 c i l i be
r r o , C : I 。 ; C u r r 。口 t 孔p ie s 10 oe v e l o pm e n o a l B i o lo gyf VO I . 25 , p p . , ,一 8 8 .
[ 9 I oC 卜e n , 5 . N . e t a l . : 19 7 2 . P r oc 、 N a : 1. A c a d . S c云 U S才 , 6 9 : 2 1 10一 2 11 4 .
[ 1 0 1 J
o n k i n s
,
F
.
J
.
e t a l
.
: 19 8 3
,
J
.
V i r o l
, 4 5 : 4 7 8 e 呼8 1 .
[ 1 11 M
a n i a t io
.
T
.
e t a l
.
: 19 8 2
.
M o l , c二 l a r C l o n i o g
,
Pp
.
15 0
.
[ 12 ] M
a x a二 , A . M二 t a l . : 1 9 80 . A, “ 汤o d , i , 石。 z ,。 o l o g y, 6 , : 4 9 9 .
[ 13了 M c k n i g五t , .T D . e t a l . : 19 8 1 . J . F介。 1 . , 3 7 : 6 7 3一 68 2 .
[ 14 1 M i
t s i a l i。 , 5 . A . e t . 1 . : I 9 8 1 . G , 。 , , 1 6 : 2 17一2 2 5 .
[ 1 , ] N
o v e , R
.
L e t . 1
.
: 197 9
.
N a r , r 。 , 2 7 7 : 3 24 - 3 2 5
.
[ l` ] P r ib n o , , D . e t a l . : 1 97 5 . J . M o l . iB o l . , 99 : 呼19 e 月4 3 .
f 17 1 R e ed e r
.
R
.
H
.
e t a l
.
: 1 9 8 2
.
oC ld Sp
r i 二 9 H a r吞o r S y o P. Qu a 二 r . B i o l . , 6 7 : 8 67一87 1 .
[ 18 1 5面 r卜, M . G二 t a l . : 材“ 无。山 i二 E 。 : y脚 0 10 言热 12 ( a ) : 弓4亏·
[ 19 ] S
o u t卜e r n , E . M . : 19 7 5 . J . M o l . B i o l . , 9 8 : 50 3 .
[ 2 0 1 W
e s t , R
.
W
.
et . 1
.
: 19 7 9
.
G e , e
,
7 : 27 1一 2 8 8 .
tA t
a e ua
r i e i n i C hr om
o s o m a l D N A F r a g m e n t s A e t i v e .a
rP ok ar y
o t i e P r om
o t er o i n EB
e h e r i e h i a e o l i
L i u X i a o m i n g Sh e n L u P i n g L i Z a i p i n g
( S孟a , 君几。` I二 , r i x o z。 o f B i o c 入e , i , r r , , 才c a d 。 。 : 。 S , 。 i` a )
A B S T R A C T
仆 e H t’n d II I f r a gm e n t s o f lA r a c盯 r i c i n i e }】r o m o s o m a , D N , 、 , w hi c h w o r ke d a s Pr o m o : e r
f o r t h e t e t r a e y c l i n e r e s七ra n e e g e n e i n th e P r om o t e r c lo n i n g P la sm id PH E S o f E : c h o r i c hi a c o l i
,
w e r e s t u d i e d
.
T he e o l o n y d is r r i b u t io n o f t e r r a e y c l i n e r e s i s t a n e e w a s d o r e r m i n e d T w e n t y c l o
-
n e s s h o w e d a h i g l
l le v e l o f t e t r a e y e l i n e r e s i s t a n e e ( o v e r 2 0 0 m i c r o g r a m t e t r a e v e l i n e P e r m l )
.
o n e o f t h e s e h i g h 7’: P la s m id s , r h e P A R P 2 0 1, w a s f u r t h e r e h a r a e t e r i z e d ; n d e t a il . A f t e r r e s -
t r ie t io n m a P P i n g
,
m o s t P a r t o f i t s 1
.
9 k b i n s e r t e d f r a g m e n t w a s r e m o v e d w i r h t h e a id o f B g l l l
.
T h e r e n l a i n e d 0
.
5 k b f o r e i g n f r a脚 e n r i n th e p A R P 20 1刁 e r i v e d p la s m id , p A R P一 D B , s h o w e d
f u l l e a p a c i t y a s a p
l
·
o m ot o r c o m p a r e d w i t h th e o r ig i n a l w h o l e i n s e r t
.
p a r t i a l s e q u e n e i n g o f t h is
f r a g m e n t s h o w de t h a t it be a r s a g o o d r e
s em b la n c e t o p r o k a r y o t ie p r o m o t e r m o d e l
K e y w o r d s : A zt
“ c ,` , ; i c i月 1 e h r o m o 、 o m e , P r o m ot e r c l o n i n g p l a s m i d o f E
.
c o l ,
,
T e t r a e y c l i n e
r e s i s t a n e 护 , D N A , e q ue n e e
R亡 e e i v 七d D e c e m be r 1 1
, 1 98 ` .