全 文 ：凉血散血方对免疫性血小板减少症
模型大鼠 CD40L表达的影响
〔摘要〕 目的 探讨凉血散血方对免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia，ITP)模型大鼠白细胞抗原分化群
40 分子配体（cluster of differentiation 40 ligand，CD40L）表达变化与作用机制。 方法 将大鼠随机分为空白组、模型组、
强的松组、凉血散血方高、中、低剂量组，用腹腔注射兔抗大鼠血小板血清（APS）法造 ITP 模型，用酶联免疫吸附法
（ELISA）测定大鼠外周血 CD40L 的变化，造模前后及给药后检测 ITP 模型大鼠血小板数值变化。 结果 模型组 CD40L
水平明显高于空白组，血小板计数明显低于空白组，两组相比较差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，各治疗组
CD40L 水平降低(P<0.01 和 P<0.05)，血小板数值升高 (P<0.01)；中药高剂量组与强的松组比较差异无统计学意义（P>
0.05）。 结论 凉血散血方能使 ITP 模型大鼠外周血小板破坏减少，其作用机制可能与下调 CD40L 水平有关。
〔关键词〕 免疫性血小板减少症；凉血散血方；白细胞抗原分化群 40 分子配体；大鼠；水牛角；生地黄
〔中图分类号〕R285.5 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2013.11.009.032.04
Effects of Liangxue Sanxue Formula on CD40L expression
in rats with immune thrombocytopenia
ZHANG Minyu1, PENG Sujuan2, YANG Lin3, NIE Tian1, LI Shineng1, HU Ni1,
TAN Jing2, JIANG Wenming1*
(1. College of Integrated Chinese and Western Medicine, Hunan University of CM, Changsha, Hunan
410208, China;
2. Second Affiliated Hospital, Hunan University of CM, Changsha, Hunan 410005, China;
3. First Affiliated Hospital, Hunan University of CM, Changsha, Hunan 410007, China)
〔Abstract〕 Objective To investigate the effects and mechanism of Liangxue Sanxue Formula
on the changes of cluster of differentiation 40 ligand (CD40L) of leukocyte antigen of peripheral
blood in immune thrombocytopenia (ITP) rat model. Methods The rats were randomly divided into
blank group, model group, prednisone group, Liangxue Sanxue Formula high, medium and
low dose group. ITP rat model was made by intraperitoneal injection with rabbit anti-rat platelet
serum (APS). The changes of CD40L in peripheral blood were determined by enzyme linked im-
munosorbent assay (ELISA), the platelet number was detected before and after modeled, and after
treatment. Results Compared with blank group, the level of CD40L was significantly higher while
the platelet number was significantly lower in model group. There were statistical significances in
张旻昱 1，彭素娟 2，杨 琳 3，聂 甜 1，李仕能 1，胡 妮 1，谭 晶 2，蒋文明 1*
（1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学附属二医院，湖南 长沙 410005；
3.湖南中医药大学附属一医院，湖南 长沙 410007）
〔收稿日期〕2013－09－17
〔基金项目〕湖南省中医药管理局重点基金项目（600010393）；湖南省研究生科研创新基金项目（CX2012B340）。
〔作者简介〕张旻昱（1984-），女，湖南长沙人，在读博士研究生，研究方向：中西医结合血液病学。
〔通讯作者〕*蒋文明，男，教授，博士研究生导师，E-mail：2839040380@qq.com。
2013 年 11 月第 33 卷第 11 期
Nov． 2013 Vol． 33 No． 11
湖 南 中 医 药 大 学 学 报
Journal of Hunan Univ． of CM32
these indices between the two groups (P <0.01). Compared with the model group, the levels of
CD40L were decreased (P <0.01 or P <0.05), and the platelet numbers were increased in treat-
ment groups (P <0.01). There were no statistical significances between Liangxue Sanxue Formu-
la medium dose group and the prednisone group(P>0.05). Conclusion Liangxue Sanxue Formula can
reduce peripheral platelet destruction in ITP rats, which may be related to the down-regulation of
CD40L levels.
〔Key words〕 immune thrombocytopenia; Liangxue Sanxue Formula; cluster of differentiation 40
ligand of leukocyte antigen; rats; cornu bubali; Radix Rehmanniae
免疫性血小板减少症（ITP）是由血小板抗体和
细胞介导导致血小板的破坏及抑制血小板的生产而
引起血小板数量减少， 可能会引起出血的一种自身
免疫综合征 [1]。 实验组采用免疫造摸的方法 [2]复制
ITP 大鼠模型， 通过检测大鼠血浆白细胞抗原分化
群 40 分子配体（CD40L）的表达，以及 ITP 模型大鼠
血小板数值变化，以探索 CD40L 表达变化在 ITP 发
病中的作用机制， 了解中药复方凉血散血方治疗
ITP的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物 清洁级 SD 大鼠 60 只，雄性，体质量
180～220 g， 购自湖南斯莱克景达实验动物有限公
司，动物许可证号：SCXK(湘)2009-0004。
1.1.2 药物 （1） 凉血散血方药物组成： 水牛角
30 g，生地黄 30 g，茯苓 10 g，牡丹皮 10 g，白芍
15 g，仙鹤草 40 g，石斛 10 g，麦冬 10 g，甘草 3 g，
黄芪 30 g。 （2）强的松片（醋酸泼尼松），由浙江仙琚
制药股份有限公司生产，规格：5 mg×100 片，批号：
H33021207。
1.1.3 主要试剂 大鼠可溶性 CD40 配体（CD40L）
酶联免疫试剂盒（Rat sCD40L ELISA Kit），购自上
海江莱生物科技有限公司，批号：EIA05971。 兔抗大
鼠血小板血清（APS），于湖南中医药大学附属一医
院中心实验室制备，抗血清活性的测定为阳性。
1.1.4 仪器 L-550 型离心机， 长沙湘仪医疗设备
厂；Sysmex XT-1800i 型全自动血细胞计数仪，日本
东亚 Sysmex公司；WD-2102A 型酶标仪， 长沙晶格
生物技术有限公司；FYL-YS-100L 型 37 ℃恒温培
养箱，北京福意电器公司。
1.2 实验方法
1.2.1 APS 制备 采集大鼠全血于乙二胺四乙酸
（EDTA） 抗凝管中 ， 离心分离血小板 ， 然后用
0.01 mol/L pH7.4 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 （Phosphate
Buffered Saline，PBS） 液洗涤 3 次并混悬血小板至
109/L，将血小板悬液与等量完全弗氏佐剂混合直至
形成乳白色黏稠乳剂为佐剂抗原。 向每只新西兰兔
两后肢足垫及背部多点注射致敏。 于首次注射后第
1、2、4 周分别取 109/L 血小板悬液与等量不完全弗
氏佐剂混合为佐剂抗原。 向每只新西兰兔两后肢足
垫及背部多点注射加强免疫。 末次加强免疫后 1周
心脏采血，37 ℃温育后分离血清， 并用洗涤过的大
鼠红细胞(1∶1)及洗涤过的大鼠淋巴细胞(1∶1)各吸附
2 次，分离血清，贮存在-20 ℃冰箱中备用。 抗血清
活性的测定(ELISA法)：将新西兰兔全血采集于 ED-
TA抗凝管中，分离血小板，用 0.01 mol/L pH7.4 的
PBS洗涤 3次，将血小板调至一定浓度加入 40 孔反
应板，每孔 0.1 mL，4 ℃冰箱过夜。反应板洗涤 3次，
分别加入 1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32 等浓度的抗血清
0.1 mL， 放入 37 ℃温箱孵育 1 h， 以 0.01 mol/L
pH7.4的 PBS 洗涤 3 次分别再加入适当浓度的酶联
葡萄球菌 A蛋白，放入 37 ℃温箱 1 h，再 37 ℃温箱
反应 30 min，加入 2 mol/L H2SO4终止反应，用酶标
比色计测定 OD值，若大于对照 2倍 OD值为阳性。
1.2.2 ITP大鼠动物模型的复制 采用 APS法造模[2]，
每日腹腔注射 1∶4 稀释的兔抗大鼠血小板血清 APS
(0.7 mL/200 g)1 次，连续 3 d，再分别于第 5、7、9、
11、13天注射 APS，以维持血小板的持续降低。 首次
注射后 24 h 血小板降至原水平的 30%， 反复注射
APS使血小板在 7 d内维持在原水平的 30%～50%，
即为模型复制成功。
1.2.3 药物制备 （1）凉血散血方汤剂由湖南中医
药大学第一附属医院制剂室用韩国东华 DHJ-102
煎药机制备。 所有药物均先用冷水浸泡 30 min，其
中水牛角先煎 30 min，再将压力排出，打开盖子，将
其余药物放入，煎煮 60 min。真空包装，150 mL/袋，
每剂两袋。 拆开包装后倒入蒸发皿中浓缩， 凉血散
血方低、中、高剂量组给药剂量分别按“人和动物体
表面积折算的等效剂量比率表” 折算成临床成人用
药剂量的 1、2、4 倍 ， 均煎成浓缩剂含生药 0.63、
1.26、2.52 g/mL。 分装后的中药汤剂放入 4 ℃冰箱
保存。 （2）强的松混悬液：先将片剂研细粉，用蒸馏
水配成 100%的混悬液待用。
张旻昱，等 凉血散血方对免疫性血小板减少症模型大鼠 CD40L 表达的影响第 11 期 33
表 2 凉血散血方对ITP 大鼠血浆 CD40L 表达的影响
注：60 只大鼠， 造模给药过程中死亡 2 只。 与 K 组比较▲▲P<
0.01；与 M 组比较○○P<0.01，●P<0.05；与 Q 组比较☆☆P<0.01；
与 G 组比较 ##P<0.01。
组别
K 组
M 组
Q 组
D组
Z 组
G 组
n
10
9
10
9
10
10
CD40L（x±s，ng/L）
2 289.54±198.68
3 237.79±252.38▲▲
2 453.27±162.68○○
3 005.60±246.85●☆☆##
2 919.18±229.41●☆☆##
2 541.91±155.25○○
表 1 凉血散血方对ITP 大鼠血小板计数的影响（x±s，×109/L）
注：60 只大鼠， 造模给药过程中死亡 2 只。 与 K 组比较▲▲P<
0.01；与本组造模前比较■■P<0.01；与 M 组比较○○P<0.01；与 Q
组比较★★P<0.01；与 G 组比较 ##P<0.01。
组别
K 组
M 组
Q 组
D组
Z 组
G 组
n
10
10
10
10
10
10
造模前
1 300.10±88.41
1 247.20±80.71
1 328.60±92.75
1 181.80±99.92
1 281.60±84.94
1 146.60±78.69
n
10
9
10
9
10
10
造模后
1 294.10±106.56
652.33±112.37▲▲■■
585.70±210.90▲▲■■
631.30±137.33▲▲■■
629.78±199.97▲▲■■
630.60±189.58▲▲■■
给药 8 d 后
1 355.80±79.65
613.33±102.76▲▲
1 094.30±66.93○○
807.33±53.65○○★★##
829.70±63.26○○★★##
992.70±61.01○○★★
1.2.4 动物分组 60只 SD大鼠， 适应性饲养 1 周
后，随机数字表法分成 6组，每组 10只，分别为空白
组(以下简称 K 组)、模型对照组(以下简称 M 组)、强
的松组(以下简称 Q 组)、凉血散血方低剂量组（以下
简称 D 组）、凉血散血方中剂量组（以下简称 Z 组）
和凉血散血方高剂量组 （以下简称 G 组）。 除 K 组
外，余 5 组大鼠给予腹腔注射 APS 法造模 [2]，K 组予
腹腔注射生理盐水。 于造模开始第 7天灌胃给药，K
组和 M 组均予以生理盐水 1.0 mL/次，2 次/d；Q 组
予以强的松混悬液， 按 5.4 mg/kg 体质量灌服；D
组、Z 组、G 组予以凉血散血方汤 1.0 mL/次，2 次/d，
连续 8 d。 灌胃第 8天处死全部大鼠。
1.2.5 标本采集 造模前后采用断尾采血法， 每次
每只大鼠采血约 0.5 mL，处死前各组大鼠采用 10%
水合氯醛腹腔注射麻醉后，心脏采血 2~3 mL，均为
EDTA抗凝。
1.2.6 检测指标 （1） 血浆 CD40L 的检测 血液
EDTA 抗凝后， 混合 10~20 min，2 000 r/min 离心
20 min，收集上清液，ELISA 法检测 ITP 模型大鼠血
浆 CD40L。 取出酶标板，设标准品孔 10孔，在第一、
第二孔中分别加标准品 100 μL，然后在第一、第二
孔中加标准品稀释液 50 μL，混匀；稀释后各孔加样量都为
50 μL， 浓度分别为 3 600、2 400、1 200、600、300 ng/L。
分别设空白孔、待测样品孔。在酶标板上待测样品孔
中先加样品稀释液 40 μL， 然后再加待测样品
10 μL（样品最终稀释度为 5倍），轻轻晃动混匀。 用
封板膜封板后置 37 ℃温育 30 min。 洗涤机清洗 5
次，每次静置 30 s。 每孔加入酶标试剂 50 μL，空白
孔除外。37 ℃温育 30 min。洗涤机清洗 5次，每次静
置 30 s。 每孔加入酶标试剂 50 μL，空白孔除外。 每
孔先加入显色剂 A 50 μL，再加入显色剂 B 50 μL，
轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色 15 min。 每孔加终止
液 50 μL，终止反应。 （2）血小板检测 造模前后及
处死前各测 1次血小板， 用全自动血细胞计数仪检
测血小板数值变化。
1.3 统计学分析
采用SPSS 19.0 软件分析数据，计量资料用“x±
s”表示，所有资料进行正态性检验；多组计量资料采
用单因素方差分析， 组内比较采用配对 t 检验，P<
0.05表示差异有统计学意义。 两个随机变量的关联
程度采用相关性分析，当相关系数 r<0 时，称为负相
关。
2 实验结果
2.1 凉血散血方对 ITP大鼠血小板计数的影响
（1）造模后 M 组及各药物组血小板计数均明显
低于 K 组（P<0.01），且各组间血小板计数比较无统
计学意义（P>0.05），表明 APS 能引起大鼠血小板下
降，ITP 大鼠模型是成功的。 （2）K 组造模前后血小
板计数比较无显著性差异(P>0.05)，表明本研究中大
鼠不会发生自发性血小板减少。 （3）用药 8 d后，与
M 组比较， 各药物组血小板计数均明显升高 （P<
0.01），差异有统计学意义，表明各药物组均有效对
抗 APS引起的血小板下降。 （4）与 Q 组比较，各浓度
凉血散血方血小板计数均明显升高（P<0.01），各组
血小板计数按浓度递增，G 组较 Z、D 组升高更明显
（P<0.01）。 结果见表 1。
2.2 凉血散血方对 ITP大鼠血浆 CD40L表达的影响
（1）M 组与 K 组比较，表达水平增高明显 (P<
0.01)， 差异有统计学意义。 提示建模后大鼠血浆
CD40L表达水平显著升高。（2）与 M组比较，Q、G 组
表达水平显著下降(P<0.01)，Z、D 剂量组的表达水平
下降(P<0.05)；提示药物干预后，中西药均能下调大
鼠血浆 CD40L 的表达， 各浓度凉血散血方均有效。
（3）与 Q 组比较，Z、D 组表达水平明显高于 Q 组(P<
0.01)； 中药各组比较，G 组较 Z、D 组的表达水平降
低更明显(P<0.01)，Z、D 组间比较差异无统计学意义
(P>0.05)。 提示 G 组下调 CD40L 作用与 Q 组相似，
优于 Z、D组。 结果见表 2。
湖南中医药大学学报 2013 年第 33 卷34
2.3 ITP大鼠 CD40L表达与血小板计数的关系
经相关性分析 ，ITP 大鼠 CD40L 表达与给药
8 d 后血小板计数之间为负相关 （r=-0.966，P﹤
0.01），即 CD40L 表达上调时，血小板破坏增加，表
现为血小板计数减少；CD40L 表达下调时， 血小板
破坏减少，表现为血小板计数增加。 结果见表 1~2。
3 讨论
现代医学关于 ITP 的发病机制尚未完全阐明，
T、B淋巴细胞的克隆增殖以及免疫失耐受， 可以促
进血小板抗体产生， 导致 ITP 大鼠的起病与发展，
而 T、B 细胞的活化需要共刺激分子 (co-stimulato-
ry molecules)参与。 CD40L属于共刺激分子中一员，
是由 261 个氨基酸组成的 II 型跨膜蛋白，属于肿瘤
坏死因子家族。 主要表达于活化的 T 细胞、血小板
及内皮细胞 [3]。 CD40L 存在于静息状态的血小板胞
浆之中，血小板活化时可迅速易位到膜表面，并被
剪切脱落到血浆，成为可溶性 CD40L(sCD40L)，血
浆中 CD40L 约 95%来自血小板 [4]。 现普遍认为 T
细胞表达 CD40L 由 T 细胞（抗原）受体（T cell re-
ceptor，TCR）介导并依赖 Ca2+，可引起诱导 B 细胞
表达 B7 分子等进一步改变，在 B 细胞生长和分化
中起着关键的作用， 能够使刺激 B 细胞活化的抗
原阈值降低 [5]。 另一方面，白细胞抗原分化群 40 分
子 （CD40）、CD40L 的相互作用可能通过 CD40L 传
导信号， 对 T 细胞产生直接的活化作用， 并诱导 T
细胞因子的产生[6]。 综上所述，CD40L的表达以及结
构与功能的正常，与 T、B 细胞的活化密切相关。 在
ITP 发病过程中， 可能由于固有免疫细胞如吞噬细
胞、树突状细胞、自然杀伤细胞等的活化，诱导共刺
激分子表达，启动特异性免疫应答产生。 CD40L 的
过度表达可以刺激自身反应性 T、B 细胞的活化，增
加自身血小板抗体的产生，使血小板破坏增多[7]。
本研究之凉血散血方源于唐代孙思邈 《备急千
金要方》之犀角地黄汤，具有清热解毒、凉血散瘀之
功效， 主治热入血分证。 清代叶天士又善用该方治
疗温热病热入血分证，并提出“凉血散血”的概念：
“入血就恐耗血动血，直须凉血散血，如生地、丹皮、
阿胶、赤芍等物”。 凉血散血方在犀角地黄汤的基础
上加减，具有凉血散血、益气养阴之功效，在临床治
疗 ITP过程中取得了较好的疗效。 方中水牛角清热
解毒、凉血止血，其水解物静脉给药具有快速止血作
用，止血作用与诱导血小板聚集有关[8]。 生地黄清热
生津、滋阴养血，其药效活性物质大多存在于乙醇部
位，可能有皮质激素样免疫抑制作用[9]。 牡丹皮清热
凉血、活血散瘀，对体液及细胞免疫均有增强作用，
同时具有护肝作用， 可减轻药物对肝脏的损伤 [10]。
黄芪益气摄血，黄芪多糖可以从多层次发挥免疫调
节作用，可直接影响细胞内的代谢，诱导机体细胞产
生相关的因子，又能增强机体的特异和固有免疫 [11]。
本实验中，ITP大鼠模型组 CD40L表达异常增高，经
不同浓度凉血散血方干预后均有一定程度下调，且
各组 CD40L 表达与血小板计数呈负相关，表明凉血
散血方可能通过下调 CD40L的过度表达， 抑制 ITP
大鼠特异性免疫应答，抑制自身反应性 T、B 细胞的
活化，减少血小板抗体产生，使血小板破坏减少，对
ITP起到治疗作用。
综上所述， 本实验研究中 ITP大鼠存在 CD40L
的异常高表达， 表明 ITP发病与自身免疫功能紊乱
相关。 我们将继续深入研究， 进一步探讨共刺激分
子 CD40L 在 ITP 发病中的作用， 完善 CD40/CD40L
信号通路相关因子分析研究， 探索该信号通路是否
为 ITP 发病的必经通路，以及其作用强度等，为 ITP
的靶向性治疗提供新思路。
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（本文编辑 徐爱良）
张旻昱，等 凉血散血方对免疫性血小板减少症模型大鼠 CD40L 表达的影响第 11 期 35