全 文 ：收稿日期:2006-04-28
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30371694)
作者简介:金圣煊(1976-), 男(汉族),浙江三门人 , 博士研究生;毕殿洲(1933-),男(汉族), 辽宁大连人 , 教授 ,主要从
事缓控释制剂和鼻黏膜给药系统的研究 , E-mail bidianzhou@126.com。
文章编号:1006-2858(2007)04-0226-03
RP-HPLC法测定齐多夫定肉豆蔻酸酯脂质体
药物含量及包封率
金圣煊 , 王艳芝 , 胡会国 , 邓意辉 , 毕殿洲
(沈阳药科大学 药学院 ,辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 建立齐多夫定前体药物—齐多夫定肉豆蔻酸酯脂质体含量及包封率的测定方法。方
法 采用 RP-HPLC 法。色谱柱为 DiamonsilTMODS C18(4.6 mm×200 mm , 5 μm),流动相为甲醇-水
(体积比为 95∶5),流速为 1.0 mL·min-1 ,紫外检测波长为 265 nm;采用超速离心法分离齐多夫定
肉豆蔻酸酯脂质体中的游离药物。结果 在上述色谱条件下辅料和试剂对药物的测定无干扰 , 齐多
夫定肉豆蔻酸酯浓度在 1.05×10-5 ～ 6.28 ×10-5mol·L-1内与峰面积的线性关系良好(r =
0.999 9),回收率在 99.4%～ 102.0%之间 ,日内及日间 RSD 均小于 2%(n=5)。结论 RP-HPLC
法可用于齐多夫定肉豆蔻酸酯脂质体含量及包封率的测定。
关键词:齐多夫定;齐多夫定肉豆蔻酸酯;脂质体;包封率;反相高效液相色谱法
中图分类号:R 927.2　　　文献标志码:A
　　齐多夫定(zidovudine ,AZT)是第一个被批准
用于临床治疗艾滋病感染的逆转录酶抑制剂 ,现
在仍是鸡尾酒疗法中基本的组合成分 ,可口服或
静脉注射给药 。AZT 的主要临床局限性在于剂
量依赖性的特异性不良反应 ,如骨髓抑制等;另
外 ,AZT 的血浆半衰期短(t 1/ 2=1.1 h),需频繁
给药[ 1-2] 。为解决此问题 ,国外研究人员将其制
成脂质体 ,用于静脉注射给药 ,能明显降低骨髓毒
性 、提高药物的生物利用度 、增强抗病毒作
用[ 3-4] 。但由于齐多夫定是一个两亲性药物 ,存
在包封率低 、贮存过程中易泄漏等缺点[ 4] ,限制
了其进一步开发和应用。鉴于此 ,作者合成了齐
多夫定的酯化前体药物齐多夫定肉豆蔻酸酯(zi-
dovudine my ristate ,AZT-M),并制备了齐多夫定
肉豆蔻酸酯脂质体(AZT-M 脂质体),使其包封率
达到 98%以上 ,同时消除生产 、贮存 、使用过程中
药物的泄漏 。AZT-M 脂质体的研究国内外未见
报道。为了控制所制脂质体的质量 ,作者采用反
相高效液相色谱法(RP-HPLC),测定 AZT-M 脂
质体的含量及包封率。实验结果表明 ,该法灵敏
度高 、专属性好 、方便快捷 ,为制剂的质量评价 、质
量控制提供了依据。齐多夫定肉豆蔻酸酯的结构
式见图 1。
Fig.1　structure of zidovudine myristate
1　仪器与材料
　　Agilent 1100 系列高效液相色谱仪(Agilent
自动进样器 、Agilent 1100 系列紫外可变波长检
测器 、Agilent 色谱工作站 ,美国 Agilent 公司),
Hitachi GS-120 型超速离心机(日本 Hitachi 公
司)。
AZT-M 对照品(自制 ,经高效液相面积归一
化法测定齐多夫定肉豆蔻酸酯的含量质量分数为
99.12%),AZT -M 脂质体(自制 ,批号:2002618 、
2002619 、2002620),甲醇为色谱纯(天津康科德化
学试剂有限公司),水为重蒸水(自制),其他所用
试剂均为色谱纯。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
色谱柱:DiamonsilTMODS C18柱(4.6 mm ×
第 24 卷 第 4 期
2 0 0 7 年 4 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol.24 　No.4
Apr.2007 p.226
200 mm , 5 μm), ODS 预柱(4.6 mm ×10 mm ,
10μm),流动相:甲醇-水(体积比为 95∶5),柱温:
室温 ,流速:1.0 mL·min-1 ,检测波长:265 nm ,进
样量:20 μL ,采用外标法测定含量 。
2.2　检测波长的选择
取AZT-M 对照品适量 ,用甲醇制成 2.09×
10
-5
mol·L-1的溶液 ,以甲醇为空白 , 在 200 ～
400 nm波长内进行扫描。结果 AZT-M 溶液在
211 nm和 265 nm 处有最大吸收 , 因此选择
265 nm作为检测波长。
2.3　色谱行为
取空白脂质体破乳溶液 、AZT-M 对照品溶液
和AZT-M 脂质体破乳溶液各 20 μL 进样分析 ,
得色谱图 1 。由图可见在此色谱条件下 ,辅料和
试剂对药物测定无干扰 ,AZT-M 峰的保留时间约
为 6.8 min。
Fig.2　The chromatograms of blank liposomes(a),AZT-M solution(b)and AZT-M liposomes(c)
2.4　线性关系
精密称取 AZT-M 对照品 10.00 mg , 置于
100 mL 量瓶中 ,加甲醇适量 ,水浴超声处理 ,使主
药溶解 ,摇匀 ,放冷至室温 ,加甲醇至刻度 ,摇匀。
精密吸取上述溶液 0.5 、1.0 、1.5 、2.0 、2.5 、
3.0 mL ,分别置于 10 mL 容量瓶中 ,加甲醇稀释
至刻度 ,摇匀 ,吸取该溶液各 20 μL 测定 2次 ,记
录色谱图 。取平均峰面积 A 对浓度 c(mol·L-1)
进行回归 , 得线性方程为:A =1.18 ×107c +
3.25 , r =0.999 9 , 线性范围为 1.05 ×10-5 ～
6.28×10-5mol·L-1 。
2.5　精密度
按“2.4”条方法配制 AZT -M 对照品溶液
1.05×10-5 、3.15×10-5 、5.23 ×10-5 mol·L-1
低 、中 、高 3 种浓度 ,于 2 、4 、6 、8 、10 h测定 ,计算
日内精密度 , 结果日内 RSD 分别为 0.80%、
0.65%、0.54%;于 1 、2 、3 、4 、5 d 测定 ,计算日间
精密度 ,结果日间 RSD 分别为 1.1%、1.0%和
0.8%。
2.6　回收率
精密称取 9.90 mg AZT-M ,置于 100 mL 量
瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀。取该溶液
0.5 、1.5 、2.5 mL 于 10 mL 容量瓶中 ,加入处方
量的空白脂质体 ,用甲醇稀释至刻度 ,配成1.06×
10-5 、3.11×10-5 、5.18×10-5mol·L-1低 、中 、高
3种浓度 ,分别进样 20 μL ,测定峰面积 ,代入标准
曲线计算实际浓度 ,计算回收率 ,结果见表 1。
Table 1　The recovery of AZT-M in blank liposomes(n=5)
c added/(mol·L-1)(×10-5) cfound/(mol·L-1)(×10-5) Recovery/ % Average/ % RSD/ %
1.06 1.05 99.1
3.11 3.17 102.0 100.7 1.3
5.18 5.22 100.9
2.7　检测限和定量限
将AZT-M 对照品溶液稀释成不同浓度进行
HPLC分析 ,测得其检测限(S/ N =3)为 1.0 ng ,
定量限(S / N=10)为 4.0 ng 。
2.8　样品测定
精密吸取 AZT-M 脂质体 0.25 mL(含 AZT-
M 约 1 mg)于 50 mL 量瓶中 ,加流动相溶解并稀
释至刻度 ,摇匀 ,滤过 ,取续滤液作为供试品溶液 ,
进样 20μL ,测定峰面积;另取 AZT -M 对照品适
量 , 用流 动相 制 成含 AZT - M 为 4.19 ×
10-5 mol·L-1的溶液 ,按“2.4”条方法测定 ,用外
标法计算出供试品中 AZT-M 的含量 ,测定结果
见表 2。
2.9　包封率的测定
量取 AZT-M 脂质体混悬液 1.0 mL ,置于离
心管中 ,在超速离心机上以 30 000 g 、4 ℃条件下
227第 4 期 金圣煊等:RP-HPLC 法测定齐多夫定肉豆蔻酸酯脂质体药物含量及包封率　　　
超速离心 1 h 。在此条件下 ,脂质体保持混悬状
态 ,而游离的AZT-M 则沉淀出来 ,达到与脂质体
分离的目的 。按“2.8”条测定离心前后脂质体中
的药物浓度 ,按公式:包封率=(c包/ c总)×100%
计算包封率 ,其中 c包 为离心后脂质体中 AZT-M
的浓度 , c总 为离心前脂质体中 AZT-M 的浓度。
结果 3批样品的包封率分别为 99.4%、100.1%、
98.6%。
Table 2　The contents of AZT-M among three batches
(n=5)
Sample(batch) w/ % RSD/ %
2002618 98.5 1.3
2002619 99.6 1.5
2002620 101.4 1.1
3　讨论
作者首次建立了 AZT-M 脂质体含量和包封
率测定的 RP-HPLC 方法。AZT-M 为脂溶性药
物 ,在水中不溶 ,而易溶于甲醇 、乙醇等有机溶剂。
以体积分数为 95%的甲醇溶液为流动相 ,保留时
间适宜 ,辅料和试剂对 AZT-M 的测定无干扰。
AZT-M 在 1.05×10-5 ～ 6.28×10-5mol·L-1内
线性关系良好 ,回收率高 ,重现性好 ,能准确快速
地进行含量测定。ODS 预柱的采用 ,可以减少磷
脂对色谱柱的吸附 ,延长色谱柱的寿命 。
包封率是脂质体制剂的一个重要指标 。《中
华人民共和国药典》2000年版规定包封率不得小
于80%,这对于一些包封率低的药物来说 ,是一
个严峻的挑战。将药物进行亲脂性衍生化是提高
包封率和制剂贮存稳定性的一个有效方法[ 5] 。
常用于分离脂质体制剂中游离药物的方法
有:凝胶柱色谱法 、离心法和透析法等。作者曾试
用透析法 、葡聚糖凝胶(G50)柱过滤法 、微柱离心
法和大孔树脂吸附法 ,但由于 AZT-M 不溶于水 ,
均无法完全分离游离药物 。最后用低温超速离心
法 ,利用药物与脂质体在分散介质中的密度差 ,选
择合适的转速和离心时间 ,可有效分离游离药物 ,
获得较为准确的包封率数据 ,有利于脂质体的处
方筛选和质量评价。将两亲性的 AZT 制成亲脂
性的前药 AZT-M 后 ,药物的包封率由原来的
3.6%[ 4]提高到 98%以上 ,说明以亲脂性前药包
裹于脂质体双分子层中 ,确实是解决一些低包封
率药物制剂问题的一个有效方法。
参考文献:
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RP-HPLC determination of the content and entrap-
ment efficiency of zidovudine myristrate liposomes
JIN Sheng-xuan , WANG Yan-zhi , HU Hui-guo , DENG Yi-hui , BI Dian-zhou
(School of Pharmacy , Shenyang Pharmaceut ical Universi ty , Shenyang 110016 , China)
(下转至第 231页)
228 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 24卷
　　按“2.3”条方法制备 5个批号的六味木香胶囊
的样品溶液 ,按“2.6”条方法进行测定 ,以峰面积按
回归方程计算木香烃内酯的含量 ,结果见表2。
Table 2　The content of costunolide in the sample(n=4)
Ba tch w/ % RSD/ %
050502 0.232 0.81
050603 0.243 0.75
050306 0.234 0.84
050908 0.251 0.78
051011 0.247 0.69
3　讨论
作者尝试了超声提取法和回流提取法 ,结果
发现 ,2种提取方法均可将六味木香胶囊中的木
香烃内酯提取完全 ,但因前者操作简捷 ,因此作者
选择它作为提取方法 。
作者所建立的方法具有操作便捷和经济实用
的特点 ,该法适用于六味木香胶囊中木香烃内酯
的含量测定。
参考文献:
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Content determination of costunolide in Liuwei
muxiang capsule by RP-HPLC
LIU Ying-chun1 , WANG Shao-ning1 , ZHANG Ying1 , LIU Gao-feng1 , LUO Cai-zhuan1 , LI
Zhun
2
(1.School of Pharmaceut ical Engineering , Shenyang Pharmaceut ical University , Shenyang 110016 , Chi-
na;2.Dalian Luming Science & Technology Group , Dalian 116025 , China)
Abstract:Objective To establish the content determination method of costunolide in Liuwei muxiang cap-
sule(t raditional Chinese medicines).Methods A reversed-phase high performance liquid chromatog raphic
method w as used.The measurement conditions w ere as follow s:kromasil C18 column (4.6 mm×200 mm ,
5μm);detection w avelength:225 nm;mobile phase:methanol-water(V∶V =65∶35);f low rate :1.0 mL·
min
-1.Results The linear ranges of costunolide w as 22.5-180.0mg·L-1(r=0.999 9).The mean recov-
ery was 98.3%,RSD=0.7%(n =9).Conclusions The method is suitable fo r content determination of
costunolide in Liuw ei muxiang capsule.
Key words:Liuw ei muxiang capsule(t raditional Chinese medicines);costunolide;RP- HPLC;content de-
termination
(上接第 228页)
Abstract:Objective To establish a RP -HPLC method fo r content and entrapment ef ficiency determinat ion
of zidovudine my ristrate liposomes.Methods The separation w as performed with a Diamonsil TM ODS C18
column(4.6 mm×200 mm ,5μm)using methanol-water(V∶V=95∶5)as the mobile phase and detect-
ed at 265 nm .The flow rate was 1 mL·min-1 and 20μL sample solution w as injected for each time.Results
The calibration curve w as linear w ithin the range of 1.05×10-5-6.28×10-5 mol·L-1(r=0.999 9), the
int ra-day RSD and inter-day RSD were less than 2%, and the average recovery w as betw een 99.38%-
101.95%(n =5).Conclusions The method is simple , accurate , sensitive and applicable for determination of
content and entrapment efficiency of zidovudine myristrate liposomes.
Key words:zidovudine;zidovudine myristrate;liposome;entrapment efficiency ;RP-HPLC
231第 4 期 刘迎春等:RP-HPLC 法测定六味木香胶囊中木香烃内酯含量