全 文 ：遗 传 学 报 , 2. “ ) : 3 0 0一 3 0今, x s , s
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蓖麻蚕核型多角体病毒多角体蛋白基因的
克隆和核普酸序列分析` ’
胡建新 丁红珍 吴样甫
(中国科学院上海生物化学研究所 2 0妙 l)
苗麻蚕 ( t^ t“ .u r让 in i) 是我国特有蚕种 , 以其核多角体病毒 ( A : N Pv ) 为载体有可能
发展成为新的基因工程表达系统 ,我们建立了 r^ N P v 基因库 ,并亚克隆了含多角体蛋白 ( p ` )
基因 D N A 片段 。 对该 1 . I k b 全长 D N 人 片段进行序列分析 ,确定 A : N P v p ` 结构基因全
长 7 3 5 b p , 与首猪尺嫂 N p v ( A c N v v ) 、 家蚕 N p v ( B m N p v ) 同源性 分 别 为 7`肠和 8 1肠 ,
^ r N p v s
` 端调控结构 R o h r 二 . n n b o x 与各类 N Pv 的 ” 基因相似 ,但 3’ 下游序列几无 同
源 ,显示了 rA N p v ” 基因结构的特征性 。 同时 , 我们还对 件 基因启动于的其它结构特点
作了剖析 。
关 . 佣 蓖麻蚕核型多角体病毒 ,核多角体蛋白荃因 ,核昔酸序列
核型多角体病毒 ( N u c l e a r P o l y h e d r o s i s v i r u s N p v )的核多角体蛋 白 ( p o l y h e d r i n ,
P的 基 因具有很强的启动子 , 该启动子和结构基因部分核昔酸序列高度保守。 利用首信
尺蟆 N P V ( A u t o g r a ph a c a l i f o r n i c a N p v , A c N p v )和家蚕 N p V ( B o m b y x m o r i N p V ,
Bm N P V ) 等的 尸h 基因的启动子 ,组建了多种表达载体 , 高效表达了近 2 0 种外源基因
产物 ,成为当前很有前途的新的表达系统 .t21 。 我们曾组建了 A c N P v 表达载体田 ,并用重
组 N PV 表达了多种外源基因。 一气
蓖麻蚕是我国特有的驯养蚕种 ,个体大 , 对食物的专一性要求低 , 适合工厂化生产 。克
隆并分析蓖麻蚕 N P V 的 P h 基因及其启动子 ,不仅可将其与各类 N P V 的 P h 基因及
启动子作一比较 , 而且为以后构建 A rN P V 转移载体 , 建立一个新的载体表达系统打下
基础 。
材 料 和 方 法
1
. 主要化学试剂 、 酶及来源 所有使用的限制性内切酶和 T 4 D N A 连接酶均 为
B R L 公司产品 , R a n d o m P r i n e d D N ^ L a b e l i n g K i t 购自 b o e h r i n g e r 公司 , s e q u e n a s亡
K i : 为 u s B 公司产品 , ” s 一 a 一 d A T P 及 ” P一 a 一 d C T p 均购自 A m e r s h a m 公司 。
2
. 蓖麻蚕 D N A 制备
蓖麻蚕病毒由镇江蚕业研究所惠赠 , A r N P v D N A 的制备参照忻纪厚等报道 的 方
法国 。
3
. 重组 D N A 操作按 M a in at is 等实验手册方法 , 略作修改 “气
本文于 1 9 , 1年 6 月 10 日收到 。
l) 中国农业科学院镇江蚕业研究所黄可威先生提供 A r N PV 病毒 ,特此致谢。
期 胡建新等 :蓖麻蚕核型多角休病毒多角体蛋白基因的克隆和核普酸序列分析 , 01
4
. 探针及 A r N PV P h 基 因定位 采用王晰等构建的 BP N 61 质拉 l’1 中 S al l 酶切
片段 一 6 5 k b (含 B m N P V P h 基因 )为探针 ,体外用 R a n d o m P r i m e d D N A L a b e l i n g K i t
进行同位素标记 。 用多种限制性内切酶分别作用于 A r N P v D N A , 酶切片 段 Sou ht 。 r n
转移至硝酸纤维素膜 , 与该探针杂交 。
5
. 克隆与亚克隆 以 J M 1 03 菌为宿主菌 , p u cl g 为载体鸟枪法克隆 P’ tI 酶切产
生的全部片段 ,建立 了 A r N P v 基 因库。 以上述探针进行原位杂交 , 从基因库中筛选出阳
性克隆子 。 酶切结果表明该克隆子所含外源基因片段为 3 . Okb 大小 。 将该 3 . o kb 片段转
移克隆到 pB R 32 2 sP lt 位点上 , 通过作物理图谱 , 将 A r N P v P h 基因更精确地定位于
p “ u l l 1 . 1 k b 片段上 。
6
. 序列分析 将含 A r N p V p h 基因的 l . xk b P , , 11 片段克隆到 M 1 3 m p l s s m a l
位点 , 用 S e q u e n a s e K i t 从二端进行序列测定 , 并利用片段内部 B a o H I 、 衬 `, c l l 位点
进行亚克隆 ,分别测定顺序 ,双向阅读校正 , 完成了该 1 . I K b片段全部核昔酸序列测 定 。
结 果 与 讨 论
1
.
A rN P V P h 基因定位和核昔酸序列 : 由 A r N P v D N A P , r l 酶切后 以 B m N P V
p 人 基因作探针 , s o u r h e r n 杂交图谱 (图 l )显示 , A r N p v p人基因定位于 户: r l 3 . o k b条
带 , 进一步可确定于 P , 讨 1 1 . I kb 片段上 。 将测得的该 1 . kI b D N A 序列及基因特征结
构与 A e N p V 、 B m N P v 的 P h 基因核昔酸序列比较 , 列于图 2 ( Rh r m a n n b o x 、 起始
码和终止码均以黑线画出 ,框出的序列为 S u m m e r : 估计的 T A T A b ox 位置 ) 。
k b
2 3
.
1一
9 4一
6
.
6 一扣
4 4 ~
2
.
3
2
.
0
爵、 着犷
冬一攘
图 1 A . A r N P V D N A 限制性内切酶片段图谱 ; B . S o u th e r n
杂交图 ,探针为 B m N P V P为 基因 。
F i g一 A . R . * t r i c t i o n P a t t e r n o f ^ r N P v ; B . S o u t h e r n b lo t t i n 叮.
B m N P V P h g e n e a s a P r o b e
.
1
. 分子 t 标准 又D N A / H ` , d l l l ( M o l e e o l a r w e i g h t m a r k 又n N ^ l
H i
, d 111 ) , 2
.
P s , I ; 3
.
B ,川 ; 4 . B a 二 H l ; , . H i o d l l l番 6 . E c o R I .
2
.
R o h r m a n n阂 比较了 9 种 N P V 的 7 种 P h 基因和 z 种 P: 。 基因 , 发现在 A T G 上
游一 , o b p附近都有下列 14 b p 保守序列 (括号中的数字表示 9 种 N P v 基因中该碱基出现
的次 数 ) :
32 0遗 传 学 报 1 0卷
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4期 胡建新等 :苗麻蚕核型多角休病毒多角体蛋 白基因的克隆和核昔酸序列分析 3 J3
A( 5) T( 5) T( 5) T( 7 )
T( 8 ) T( 3) A( 7 )立工立立夕 G( 2) A A( 3) T A( 2) T
A( l) C( 1) T( 2) A( l) C( 一 )
C( l)
其中核心序列为 ^ TG A A。 P os oe e和 H owa r d“ , , 指出在 A e N p V P h 基因 A T G 上游
一 7 , b p 以前的缺失对启动活性无影响 ; Q in 等 `川对 A c N P v 汽。 基因作类似实验 , 发现在
A T G 上游一 7 o b p 以前的缺失对启动子活性也无影响 。这些结果表明昆虫杆状病 毒( I n s e o t
ab o lu o v i r su ) p h 基因的高效表达与一 s o b p 两侧的 1 4b p 保守序列有关 , 这一区域可能是昆
虫杆状病毒迟晚期基因启动子的必须结构 「, .lJ , 该 1 4b p 特征性保守序列被称为 R o h r m o n
b o x “ , , 。 A r N p V p h 基因 A T G 上游 一 5 0 b p 两侧的 一4 b p序列为 A T A A T A A e T A e A T T ,
与图 2 所列其它 N P V 很接近 , 人 r N P v P h 结构基因顺序与 A c N P V 、 B m N P v 同源性
分别为 76 外和 81 肠 ,说明该序列保守性很强 。 S u m m er : 等山 ,曾分析 了 A c N P v P h 基因
夕 上游 T A T A b ox 可能位置 , 但在 A r N P V 尸h 基因 5’ 端并未发现类似序列 。 S u m m e sr
推钡寸的 P h 基因启动子的 T A T A 序列可 能不具有普遍意义 。 此外 , A r N P V P h 基因 3,
端下游序列与 A c N PV 和 B m N P v 几无同源 , 显示了它的种属专一性 。
3
. 以重组 N P v 表达外源基因 , 由于其超强表达 , 产物天然性好 , 是很有发展潜力的
基因工程表达新系统 。 一般来说 ,感染虫体表达量远高于感染昆虫细胞 , 因而以虫体为宿
主 更为理想和经济门 。 现国外少数实验室和我们实验室已建立了家蚕宿主系统 , 其它昆
虫因难以驯养或虫体太小而很难成为基因工程生产的宿主 。 蓖麻蚕是我国特有的驯养产
丝蚕 ,个体大 ,病毒感染后发病较缓慢 , 可以允许重组病毒有充分时间积累外源基因表达
产物 , 可能优于家蚕的宿主。 目前国内外对蓖麻蚕 N P v 基因尚未见报道 。 对 A r N P V
的研究 , 期望能建立我国自己的以昆虫为宿主的基因工程新系统 。
参 考 文 献
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I七h e d a n A r N P V g e n e lib r a r y . T h e 1 . 1 k b D N A f r a g m e n t e o n t a i n i n g A r N I , v P人 g e n e w a 。
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d o w n s t r e a m s e q
u e n e e h a s a l m os t n o hom
o lo g萝 w i th t h os e o f A c N PV a n d B m N P V , d e m o n s t r a t in g
t h e e h a r a e t e r is t ie P r o伴 r ry o f t h e s t r u e r u r e o f A r N P V P h g e n e . Ot h e r s t r u e t u r a l f e a t u r e s o f
t h e P h ge n e P r o m o t e r a r e a l s o d i s c us s e d i n rh i s P a ep r
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K e y w o r d日 ^ t t a c u s r i e i n i n u c l ea r p o l yh e d r os i s v i r us , p o l y he d r i n g e n e , N u e le o t id e
` e q u e n c .
R e e e i
v e d J u n e 10
, 19 9 1
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