全 文 ：中国农业科学 2014,47(18):3577-3587
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.18.006

收稿日期：2014-03-19；接受日期：2014-04-25
基金项目：国家高技术研究发展计划（2011AA10A203）、国家自然科学基金（31070006）
联系方式：徐妙，E-mail：xm0305@126.com。通信作者夏立秋，Tel：0731-88872298；E-mail：xialq@hunnu.edu.cn


环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长
和多杀菌素合成的影响
徐 妙，邬 洋，杨 燕，夏立秋
（湖南师范大学生命科学学院/微生物分子生物学国家重点实验室培育基地，长沙 410081）

摘要：【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白（cyclic AMP receptor protein，Crp）基因在刺糖
多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）中的过量表达，研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响，促进多杀菌
素的生物合成。【方法】PCR 扩增环腺苷酸受体蛋白基因（crp），通过限制性酶切、连接方法构建中间载体
pOJ260-cm-PermE-crp，使 crp 置于红霉素增强型启动子 PermE的控制下；PCR 扩增 PermE-crp 基因片段，利用 Red/ET
同源重组技术将 PermE-crp 亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体 pUC-spn 上，构建成 Crp 表达载体
pUC-spn-PermE-crp。然后，采用接合转移方法将重组载体 pUC-spn-PermE-crp 导入野生型刺糖多孢菌中，通过单交换
同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上，以染色体上整合了原始质粒 pUC-spn 的刺糖多孢菌作为对照菌株。利
用 PCR 扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子；观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基
中的生长及菌落形态差异，同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况，测定生长曲线。借用扫描
电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态；采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物
合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了 Crp 重组表达载体 pUC-spn-PermE-crp，并通过接合转移导入到
刺糖多孢菌中；PCR 检测结果显示，工程菌株作为模板扩增出长约 2 kb 的 cm-PermE-crp 目的条带，说明 crp 已成
功整合到刺糖多孢菌染色体上，并且获得的重组工程菌株S. spinosa-Crp 遗传性能稳定。在BHI 培养基和ISP-2 培
养基上，工程菌株S. spinosa-Crp 孢子萌发及形成速率与对照菌株 S. spinosa-1 相比均有所延迟，但在R6培养基
上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株 S. spinosa-1 相比，液体培养基中工程菌株 S. spinosa-Crp
二次生长现象消失，且生物量略高于 S. spinosa-1。扫描电子显微镜结果显示工程菌株菌丝片段化程度较高，分
支较少，有利于提高工程菌株 S. spinosa-Crp 发酵过程中的溶氧水平。摇瓶发酵结果表明，工程菌株中的多杀菌
素产量与对照菌株相比提高了 128%。【结论】crp 的过量表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长产生一定影响，并有
效促进刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成，为通过其他正调控基因的超量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了基础。
关键词：刺糖多孢菌；环腺苷酸受体蛋白；过量表达；多杀菌素；Red/ET 重组

Impact on Strain Growth and Spinosad Biosynthesis by
Overexpression of Cyclic AMP Receptor Protein Gene
in Saccharopolyspora spinosa
XU Miao, WU Yang, YANG Yan, XIA Li-qiu
(College of Life Science, Hunan Normal University/State Key Laboratory of Breeding Base of Microbial Molecular Biology,
Changsha 410081)

Abstract:【Objective】The objective of this study is to promote spinosad biosynthesis in Saccharopolyspora spinosa and to
3578 中 国 农 业 科 学 47 卷
study the effects on aspects of strain growth and morphological development through overexpression of Streptomyces global
regulatory factor cyclic AMP receptor protein gene (crp). 【Method】 crp was amplified by PCR, and an intermediate vector
pOJ260-cm-PermE-crp was constructed by restriction enzymes digestion and ligation, in which crp was placed under the control of
erythromycin enhanced promoter PermE. The PermE-crp frangment was amplified from pOJ260-cm-PermE-crp and subcloned into
Escherichia coli-Streptomyces shuttle vector pUC-spn stored in authors’ lab by Red/ET homologous recombination technology,
generating Crp expression vector pUC-spn-PermE-crp. Then, The vector pUC-spn-PermE-crp was introduced into S. spinosa by
conjugal transfer, and integrated into the chromosome via single-cross homologous recombination, and the strain whose chromosome
was integrated by original plasmid pUC-spn was used as control strain in this study. The apramycin resistant gene and the target gene
were amplified by PCR to confirme positive transconjugants. The morphological comparison of the engineering strain S. spinosa-Crp
and the control strain S. spinosa-1 on different media were observed. Growth curves were compared between S. spinosa-Crp and S.
spinosa-1 in liquid medium. The mycelial morphologies between S. spinosa-Crp and S. spinosa-1 were observed by scanning
electron microscopy and the spinosad production of S. spinosa was detected by high performance liquid chromatography.【Result】A
vector pUC-spn-PermE-crp expressing Crp was constructed successfully by molecular biology method, and was transferred into S.
spinosa by conjugation. PCR detection results exhibited that the 2 kb long target band cm-PermE-crp could be amplified in engineering
strain S. spinosa-Crp, suggesting that crp was integrated into chromosome of S. spinosa successfully. The recombinant engineering
strain S. spinosa-Crp abtained was genetically stable. On BHI and ISP-2 media, the spore germination and formation rate of
engineering strain S. spinosa-Crp delayed compared to the control strain S. spinosa-1, however, the spore germination and formation
rate didn’t show significant difference between S. spinosa-Crp and S. spinosa-1 in R6 medium. Compared to the control strain of S.
spinosa-1, the secondary growth phenomenon of engineering strains S. spinosa-Crp disappeared cultured in liquid medium, and its
biomass became higher. Under the scanning electron microscopy it was showed that the engneering strain had a higher degree of
mycelial fragments and less branches, which can improve the level of dissolved oxygen in S. spinosa-Crp in the process of
fermentation. Shaking flask fermentation results revealed that spinosad yield of the engineering strain increased by 128% than that of
the control strain.【Conclusion】Overexpression of crp had a certain effect on the mycelial morphology and growth of S. spinosa, and
effectively promoted the biosynthesis of spinosad, which lay an important foundation for improvming spinosad production by
overexpression of other positive regulatory genes.
Key words: Saccharopolyspora spinosa; cyclic AMP receptor protein; overexpression; spinosad; Red/ET recombination
0 引言
【研究意义】多杀菌素（spinosad）是土壤放线菌
刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）经有氧发酵
产生的一类新型大环内酯类农用抗生素，在功能上具
有杀虫活性，应用极为广泛[1]。多杀菌素杀虫机理独
特，其作用靶标主要是烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）
和 γ-氨基丁酸受体（GABARs），能有效防治鳞翅目、
双翅目和缨翅目等多种害虫，对靶标害虫表现出快速
触杀及摄食毒性的双重作用[2]。随着化学农药带来严
重环境问题，多杀菌素因其具有对害虫广谱高效、易
生物降解，对非靶标动物、农作物和环境极为安全等
优点，已被广泛用于农业害虫与动物寄生虫病的防治，
成为当前国际上最具发展前景的“绿色”生物杀虫剂[3]。
目前中国多杀菌素的研究仍处于起步阶段，野生型刺
糖多孢菌的多杀菌素生物合成量很低、发酵周期长是
限制多杀菌素大面积推广应用的主要因素[4]，因此，
寻求提高多杀菌素产量的方法是生物农药生产的迫切
需要。【前人研究进展】链霉菌中次级代谢产物的合
成受多个调控因子的调控，已有研究报道，采用基因工
程技术加倍与过量表达链霉菌中与次级代谢相关的正
调控功能基因，能有效提高目标次生代谢物的产量[5-6]；
Bruheim 等在变铅青链霉菌中引入途径专一性激活基
因 actII-ORF4 或多效性调节基因 afsR，激活了放线紫
红素的合成[7- 8]；Wu 等通过超量表达 S-腺苷甲硫氨酸
合成酶（SAM-s）基因，显著提高了红色糖多孢菌中
红霉素 A 的产量[9]。前期对刺糖多孢菌进行菌株改良
提高多杀菌素产量的方法研究主要包括：传统的理化
诱变结合高通量筛选[10]、原生质体融合及再生[11]、多
杀菌素生物合成相关基因加倍等方法[12-13]。然而，迄
今未见通过遗传操作刺糖多孢菌调控功能基因来促进
多杀菌素生物合成的相关报道。环腺苷酸受体蛋白
（cyclic AMP receptor protein，Crp）是细菌中的正转
录调控因子，在链霉菌中高度保守，属于 CRP/FNR
调控家族成员，通过与环腺苷酸（cAMP）相互作用
影响细胞的形态与生长发育[14]，并对次级代谢起全局
性调控作用[15]。敲除 crp 的天蓝色链霉菌突变株表现
出明显的发育缺陷，如孢子萌发延迟、营养生长受阻
18 期 徐妙等：环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响 3579
与孢子形成加速等[16]。Gao 等报道，Crp 是链霉菌中
抗生素产生的关键调控因子，对前体物质从初级代谢
到次级代谢的流向起协调作用，链霉菌中 crp 的过量
表达可导致相应抗生素生物合成增加或新的代谢物产
生[17]。【本研究切入点】虽然多杀菌素生物合成基因
簇与合成途径已有报道[1]，但其生物合成相关调控基
因的研究仍属空白，利用刺糖多孢菌中正调控因子的
过量表达促进多杀菌素生物合成的研究更是未有报
道。因此，本研究选取了一个链霉菌中的正调控因子
环腺苷酸受体蛋白基因进行克隆，并在刺糖多孢菌中
过量表达，以期提高多杀菌素的产量。【拟解决的关键
问题】采用基因工程技术，构建环腺苷酸受体蛋白基因
表达载体 pUC-spn-PermE-crp，将其整合至野生型刺糖多
孢菌染色体上，实现 crp 在刺糖多孢菌中的过量表达，
以期通过提高正调控基因的表达量，影响刺糖多孢菌中
次级代谢产物的产生，从而促进多杀菌素的生物合成。
1 材料与方法
试验于 2013—2014 年在湖南师范大学微生物分
子生物学国家重点实验室培育基地完成。
1.1 菌株与质粒
本研究所用菌株、质粒与引物见表 1。

表 1 本研究所用菌株、质粒和引物
Table 1 Strains, plasmids and primers used in this study
相关特征 Relative description 来源 Source
菌株 Strains
E. coli GB2005 克隆宿主 Cloning host 本实验室 Lab store
E. coli GB05-red 含 Redα/Redβ 重组酶 Containing Redα/Redβ recombinant enzyme 本实验室 Lab store
E. coli S17 接合转移供体菌，含有 Str 和 Trime 抗性 Donor of conjugation, containing Str and Trime resistance 本实验室 Lab store
S. coelicolor 天蓝色链霉菌，基因组上含有 crp Containing crp in its chromosome 本实验室 Lab store
S. spinosa 笔者实验室筛选的刺糖多孢菌 Wild-type spinosad-producing strain isolated by authors’ lab 本实验室 Lab store
S. spinosa-1 刺糖多孢菌染色体上整合了原始质粒 pUC-spn 的对照菌株
Original plasmid pUC-spn was integrated to the chromosome of S. spinosa
本研究 This work
S. spinosa -Crp 刺糖多孢菌染色体上整合了 crp 的工程菌株 crp integrated to the chromosome of S. spinosa 本研究 This work
质粒 Plasmids
pOJ260 含 reppUC18、oriT、阿伯拉霉素抗性基因 Containing pUC18 replicon, oriT, ApraR 本研究 Lab store
pOJ260-cm-PermE 含 reppUC18、oriT、红霉素强启动子、氯霉素抗性基因、阿伯拉霉素抗性基因
Containing pUC18 replicon, oriT, CmR, ApraR and PermE promoter
本研究 This work
pOJ260-cm-PermE-crp crp 通过 Hind III 和 EcoR V 双酶切后插入 pOJ260-cm-PermE 质粒，并置于 PermE 启动子下
crp inserted into pOJ260-cm- PermE by EcoR V and Hind III and under control of PermE
本研究 This work
pUC-spn 含 pUC 复制子、spn、oriT、ΦC31 int-attp 及阿伯拉霉素抗性基因
Containing pUC18 replicon, spn, oriT, ΦC31 int-attp and ApraR
本实验室 Lab store
pUC-spn-PermE-crp 置于强启动子 PermE 下的 crp 片段通过 Red/ET 同源重组亚克隆至 pUC-spn 质粒上
crp under the control of PermE promoter subcloned to pUC-spn by Red/ET homologous recombination
本研究 This work
引物 Primers
Crp-F 5′- CCCAAGCTTGTGGACGACGTTCTGCGGCG-3′ 本研究 This work
Crp-R 5′- CCGAGATATCTCAGCGGGAGCGCTTGGCCA-3′
Crp-F/Crp-R 用于扩增 crp（下画线部分为酶切位点） Crp-F/Crp-R were used in PCR amplification of crp (the
underlined bases indicate the enzyme restriction site sites)
本研究 This work
cm-PermE-crp-F 5′-caagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgaATCTAAAGGAAGCGGATGTGAC-3′ 本研究 This work
cm-PermE-crp-R 5′-gacttcgcggagctggtgaagtacatcaccgacgagcaaggcaagaccgaAGCGGATAACAATTTCACACAG-3′
cm-PermE-crp-F/cm-PermE-crp-R 用于扩增 cm-PermE-crp 基因片段（小写部分为同源臂，大写部分为引物）
cm-PermE-crp-F/cm-PermE-crp-R were used in PCR amplification of cm-PermE-crp gene fragment (the homologous
arms were shown with lower case letters, the amplified prime were shown with capital letters)
本研究 This work
Apra-F 5′-GTCCAATACGAATGGCGAAAAGC-3′ 本研究 This work
Apra-R

5′-ATAACATTCTTCGCATCCCGCC-3′
Apra-F/Apra-R 用于扩增阿伯拉霉素抗性基因 Apra-F/Apra-R were used in PCR amplification of the ApraR
本研究 This work
3580 中 国 农 业 科 学 47 卷
1.2 培养基与培养条件
大肠杆菌（Escherichia coli）培养采用 LB 液体
或固体培养基，培养温度为 37℃；刺糖多孢菌种
子活化培养采用 CSM 培养基，转接采用胰蛋白酶
大豆肉汤培养基（tryptic soy broth），培养温度为
30℃。刺糖多孢菌发酵培养基配方及培养条件参照
文献[13]。
1.3 工具酶、试剂、抗生素及使用浓度
LA Taq DNA 聚合酶、PrimeSTAR® HS DNA 聚
合酶、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶等购自大连宝
生物工程有限公司。质粒 DNA 小量提取试剂盒、细
菌基因组提取试剂盒购自上海生工生物有限公司。
PCR 引物合成及测序由生工生物有限公司完成。抗生
素均购自 Sigma 公司，工作浓度分别为：阿伯拉霉素
（apramycin，Apra） 在大肠杆菌中的使用浓度为 20
mg·L-1，在刺糖多孢菌中的使用 50 mg·L-1；氯霉素
（chloramphenicol，Cm）25 mg·L-1；萘啶酮酸（nalidixic
acid，NA）25 mg·L-1。
1.4 基因技术基本操作
大肠杆菌感受态制备、质粒提取、酶切、连接、
转化、PCR、电泳等常规技术操作见《分子克隆实
验指南》[18]。Red/ET 重组原理及步骤参照文献[19]。
刺糖多孢菌基因组 DNA 的提取按照试剂盒说明操
作。大肠杆菌和刺糖多孢菌属间接合转移参照文献
[20-21]。
1.5 pUC-spn-PermE-crp 的构建
质粒 pUC-spn-PermE-crp 构建流程见图 1。首先
通过酶切、连接的方法构建了一个含有红霉素强启
动子 PermE 的质粒 pOJ260-cm-PermE。然后以天蓝色
链霉菌基因组为模板 PCR 扩增 crp，经 Hind III/
EcoR V 双酶切后连接至同样双酶切后的 pOJ260-
cm-PermE 载体片段，得到质粒 pOJ260-cm-PermE-crp。
以该质粒为模板，PCR 扩增带同源臂的 cm-PermE-crp
基因片段，在 Red/ET 重组酶的作用下，将 cm-PermE-
crp 基因亚克隆到载体 pUC-spn 上，获得最终质粒
pUC-spn-PermE-crp。

P
ermE
P
erm
E
Am
R
Am
R
Am
R
A
m
R
A
m
R
CmR
CmR
cr
p


图 1 重组质粒 pUC-spn-PermE-crp 的构建流程图
Fig. 1 The constructing process of plasmid pUC-spn-PermE-crp
18 期 徐妙等：环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响 3581
1.6 工程菌株 S. spinosa-Crp 的构建
将 重 组质粒 pUC-spn-PermE-crp 及原 始 质 粒
pUC-spn 分别电转入接合转移供体菌 E. coli S17，经
Apra、Str、Trime 三抗筛选阳性转化子，提取质粒酶
切鉴定，获得转化子 E. coli S17（pUC-spn-PermE-crp）
及 E. coli S17（pUC-spn）。通过接合转移将原始质粒
及重组质粒分别导入野生型刺糖多孢菌中。筛选具有
阿伯拉霉素抗性的菌落，同时以 Apra-F/Apra-R 为引
物 PCR 扩增 Apra 抗性基因，以 cm-PermE-crp-F/cm-
PermE-crp-R 为引物扩增 cm-PermE-crp 基因片段，以鉴定
正确转化子。将基因组上整合了 crp 的刺糖多孢菌命
名为工程菌株 S. spinosa-Crp，整合了原始质粒的刺糖
多孢菌命名为对照菌株 S. spinosa-1。
1.7 crp 过量表达对刺糖多孢菌生长及菌株形态的
影响
刺糖多孢菌液体培养基中生长曲线的测定采用光
密度（A600）法：按 1%接种量接种活化好的菌种于
装量为 50 mL CSM 液体培养基的 300 mL 摇瓶中，
30℃，220 r/min 培养 5 d，分别定期取样测定光密度
值 OD600，制作生长曲线，试验重复 3 次。将对照菌
株和工程菌株 40 μL菌液分别涂布于 BHI、R6 和 ISP-2
固体培养基上[18]，30℃倒置培养 72 h，观察不同平板
上菌落生长情况。接种等量的对照菌与工程菌至 20
mL TSB 液体培养基中，30℃，220 r/min 振荡培养 48
h，利用扫描电子显微镜（SEM）观察菌体形态[22]。
1.8 工程菌株S. spinosa-Crp多杀菌素产量变化分析
分别取相同发酵条件下工程菌株 S. spinosa-Crp
和对照菌株 S. spinosa-1 的发酵液 500 μL，与等体积
丙酮混匀，室温避光静止 1—2 h，9 000 r/min 离心 10
min，吸取上清，经 0.22 μm 滤膜过滤，滤液经安捷伦
1290 液相色谱仪检测分析多杀菌素含量，色谱柱为
SB-C18，4.6*150 mm，5-Micron，流动相：甲醇/乙腈
/2%醋酸（v/v/v）=45/45/10，流速 1.0 mL·min-1，紫外
检测波长 250 nm，进样体积 1 μL。每个菌株 3 个重复，
经该系统自带的分析软件计算得到多杀菌素 A、D 响
应峰面积，通过与标准品比对计算得到发酵液中多杀
菌素的含量。
1.9 工程菌株 S. spinosa-Crp 遗传稳定性检测
将 S. spinosa-Crp 菌株的-80℃保藏液用不加抗生
素的 CSM 液体培养基活化 48 h，梯度稀释后涂布于
无抗生素的 BHI 平板，30℃培养 5 d；挑取 50 个单菌
落转接于含 Apra（50 mg·L-1）的 BHI 平板上，30℃培
养 3 d，计数抗性克隆数；并从中随机挑取 20 个单菌
落，于无抗生素的 CSM 中活化 48 h 后做菌液 PCR 扩
增检测 Apra 抗性基因。以此方法 5 次传代培养，考察
工程菌株的遗传稳定性。
2 结果
2.1 质粒 pUC-spn-PermE-crp 的构建及鉴定
以天蓝色链霉菌基因组为模板，利用引物 Crp-F
和 Crp-R，PCR 扩增 crp（图 2-A）。PCR 片段经 Hind III/
EcoR V 双酶切及 DNA 回收试剂盒回收此片段后，与

M 1 M 1 M 1 2
5000
3000
2000
1500
1000
750
500
250
100
bp
5000
3000
2000
1500
1000
750
500
bp 23130
9416
6557
4301
2322
bp
A B C

A：crp 的 PCR 扩增（M：DNA Marker；1：crp 的 PCR 扩增产物）；B：质粒 pOJ260-cm-PermE-crp 的酶切检测（M：DNA Marker；1：EcoR V/Hind
III双酶切质粒）；C：重组载体 pUC-spn-PermE-crp的酶切分析（M：DNA Marker；1：Xba I酶切原始质粒 pUC-spn；2：Xba I酶切重组质粒 pUC-spn-PermE-crp）
A: The PCR products of crp (M: DNA Marker; 1: crp PCR product); B: Enzyme digestion detection of plasmid pOJ260-cm-PermE-crp (M: DNA Marker; 1:
Plasmid digested with EcoR V and Hind III); C: Enzyme analysis of the recombinant vector pUC-spn-PermE-crp (M: DNA Marker; 1: Control plasmid pUC-spn
digested with Xba I; 2: Recombinant plasmid pUC-spn-PermE-crp digested with Xba I)

图 2 pUC-spn-PermE-crp 重组载体的构建及鉴定
Fig. 2 The construction and confirmation of recombinant plasmid pUC-spn-PermE-crp
3582 中 国 农 业 科 学 47 卷
同样双酶切及 DNA 回收试剂盒回收的 pOJ260-cm-
PermE载体片段连接，使 crp置于强启动子PermE的下游，
转化大肠杆菌，抽提转化子质粒，酶切鉴定，得到质
粒 pOJ260-cm-PermE-crp（图 2-B）。以质粒 pOJ260-cm-
PermE-crp 为模板，cm-PermE-crp-F 和 cm-PermE-crp-R 为
引物 PCR 扩增带同源臂的 cm-PermE-crp 基因片段，在
Red/ET 重组酶的作用下，将 cm-PermE-crp 基因亚克隆
到 pUC-spn 质粒上，得到最终质粒 pUC-spn-PermE-crp
（图 2-C）。该载体带有大肠杆菌 pUC 复制子，接合
转移起始位点（oriT），阿伯拉霉素抗性基因（ApraR，
可以作为 E. coli 和 S. spinosa 的筛选标记），红霉素
抗性基因强启动子（PermE）控制下的 crp 以及 19 kb
多杀菌素基因簇片段（图 1）。
2.2 接合转移构建重组工程菌株 S. spinosa-Crp 及
其 PCR 验证
含目标质粒的供体菌 E. coli S17 与受体菌刺糖多
孢菌进行属间接合转移试验，通过单交换同源重组将
质粒整合至刺糖多孢菌染色体上（图 3）。将 R6 平板
上长出的接合子转接至含阿伯拉霉素（50 mg·L-1）的
BHI 平板上，转接两次，再挑取单菌落至 TSB 液体培
养基，提取基因组作为模板进行 PCR 鉴定。以重组工
程菌 S. spinosa-Crp 基因组为模板，分别以 Apra-F/
Apra-R 引物对 PCR 扩增长度为 750 bp 的阿伯拉霉素
抗性基因片段，以 cm-PermE-crp-F/cm-PermE- crp-R 为引
物对扩增长度约为 2 000 bp 的 cm-PermE-crp 基因片段，
琼脂糖凝胶电泳结果表明（图 4），工程菌株以上述

PUC-spn-PermE-crp (31 kb)
chromosome
chromosome
PermE
PermE
19 kb
19 kb
19 kb 19 kb
crp
oriT
crp
oriT


图 3 载体 pUC-spn-PermE-crp 重组示意图
Fig. 3 Recombination schematic diagram of vector pUC-spn-PermE-crp

M 1
5000
3000
2000
1500
1000
750
500
250
100
bp
A 2 3 4 5 6
5000
3000
2000
1500
1000
750
500
bp
B M 1 2 3 4


A：引物对 Apra-F/Apra-R 扩增阿伯拉抗性基因；B：引物对 cm-PermE-crp-F/cm-PermE-crp-R 扩增 cm-PermE-crp 片段（M：DNA Marker；1：以 S. spinosa
基因组为模板作阴性对照；2：对照菌株 S. spinosa-1 基因组为模板；3、4：工程菌株 S. spinosa-Crp 基因组为模板；5：以水为模板；6：以质粒
pUC-spn-PermE-crp 为模板作阳性对照）
A: PCR products of ApraR amplified with primer pair Apra-F/Apra-R; B: PCR product of cm-PermE-crp frangments amplified with primer pair
cm-PermE-crp-F/cm-PermE-crp-R (M: DNA Marker; 1: Negative control using S. spinosa genome as template; 2: S. spinosa-1 genome as template; 3, 4: S.
spinosa-Crp genome as template; 5: ddH2O as template; 6: Positive control using plasmid pUC-spn-PermE-crp as template)

图 4 工程菌株 S. spinosa-Crp 的 PCR 鉴定
Fig. 4 PCR confirmation of the transconjugant S. spinosa-Crp
18 期 徐妙等：环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响 3583
两对引物 PCR 均能扩增出目的条带，说明 crp 已成功
的整合至刺糖多孢菌染色体上。
2.3 crp 过量表达对刺糖多孢菌生长与多杀菌素生
物合成的影响
2.3.1 crp 过量表达对刺糖多孢菌孢子萌发及形成
的影响 基于原始质粒 pUC-spn 的整合不会引起刺
糖多孢菌的形态变化及生长变化[23]，观察了工程菌
株 S. spinosa-Crp 及对照菌株 S. spinosa-1 在不同培
养基中的生长发育变化与形态差异。在 BHI 培养基
和 ISP-2 培养基上培养 72 h 后，对照菌产生了大量
白色孢子，而工程菌株只产生少量的孢子，工程菌
株孢子萌发及形成速率与对照菌株相比均有所延
迟。但在 R6 培养基上两者生长速率及菌落形态无
明显差异（图 5）。

BH1 ISP-2 R6
S. spinosa-1
S. spinosa -Crp


图 5 不同培养基上工程菌株 S. spinosa -Crp 与对照菌株 S. spinosa-1 的菌落形态比较
Fig. 5 The morphological comparison of the engineering strain S. spinosa-Crp and the control strain S. spinosa-1 on different media

2.3.2 crp 过量表达对刺糖多孢菌生长的影响 在
CSM 液体培养基中，对照菌株 S. spinosa-1 培养 24 h
后进入对数生长期，60 h 后趋于平稳，80—90 h 间又
有一个继续增长期，随后进入稳定期。工程菌 S.
spinosa-Crp 也是生长 24 h 后进入对数生长期，但没有
出现明显的与对照菌株类似的二次生长现象，80 h 后
便开始进入稳定期，且最终的细胞密度略高于对照菌
株（图 6）。
2.3.3 crp 过量表达对刺糖多孢菌菌丝体形态的影
响 在 TSB 液体培养基中培养 48 h 后，分别收集工
程菌株与对照菌株的菌丝体，采用扫描电子显微镜
（TEM）对其菌体形态进行观察（图 7），电镜结果
显示对照菌株的菌丝长而分支多，而工程菌株的菌丝
较短，片段化程度较高，且分支少。
2.3.4 crp 过量表达对刺糖多孢菌中多杀菌素生物
合成的影响 采用 HPLC 检测多杀菌素的生物合成，
结果表明（图 8），工程菌与对照菌多杀菌素的生物
合成呈现出相似的变化规律，第 6 天多杀菌素开始生
物合成，随后，多杀菌素的合成快速增加，第 10 天达
到最大值。从第 8 天开始工程菌株 S. spinosa-Crp 的多
杀菌素生物合成速率明显高于对照菌株，且随着时间

0
5
10
15
20
25
30
35
0 12 24 36 48 60 72 84 96
吸
光
度
A
bs
or
ba
nc
e
O
D
60
0
时间 Time (h)
S. spinosa-Crp
S. spinosa-1


图 6 工程菌株 S. spinosa -Crp 与对照菌株 S. spinosa-1
的生长曲线比较
Fig. 6 Growth curve comparision between the engineering
strain S. spinosa-Crp and the control strain S. spinosa-1
3584 中 国 农 业 科 学 47 卷


图 7 扫描电子显微镜观察两菌株的菌体形态
Fig. 7 The mycelial morphology of the engineering strain S. spinosa-Crp and the control strain S. spinosa-1 under a scanning
electron microscope

20
40
60
80
100
120
6 7 8 9 10 11 12
峰
面
积
P
ea
k
ar
ea
时间 Time (d)
S. spinosa-1
S. spinosa-Crp
Sp
in
os
yn
A
Sp
in
os
yn
D
A B
C
吸
光
值
A
bs
or
ba
nc
e
(m
A
U
)
保留时间 Retention time (min)
Sp
in
os
yn
A
Sp
in
os
yn
D
50
40
30
20
10
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
50
40
30
20
10
0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
保留时间 Retention time (min)


A：对照菌株多杀菌素产量的 HPLC 分析；B：工程菌株多杀菌素产量的 HPLC 分析；C：不同发酵时间菌株 S. spinosa-1 与 S. spinosa-Crp 多杀菌素
产量比较
A: Spinosad production of control strain by HPLC analysis; B: Spinosad production of engineering strain by HPLC analysis; C: The spinosad yields of the
strain S. spinosa-1 and S. spinosa-Crp during different fermentation times

图 8 对照菌株 S. spinosa-1 与工程菌株 S. spinosa-Crp 多杀菌素产量分析与比较
Fig. 8 The spinosad yields analysis and comparision of the control strain S. spinosa-1 and the engineering strain S. spinosa-Crp

的延长，这种差异越显著（P<0.01）。统计分析结果
表明，与对照菌株相比，发酵培养基中工程菌株多杀
菌素（A+D）的产量提高了 128%（图 8-C）。这说明
crp 的过表达促进了刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合
成。
2.4 重组菌株的遗传稳定性分析
在无抗性选择压力下，将 S. spinosa-Crp 连续 5
次传代培养后，98%以上的单克隆仍能保持阿伯拉
霉素抗性，而且 PCR 扩增 ApraR 的结果为阳性，这
说明在传代的过程中整合的 crp 没有丢失，工程菌
18 期 徐妙等：环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响 3585
株遗传稳定性良好。
3 讨论
多杀菌素极低的发酵产量促使人们对其进行菌
种改良和发酵工艺优化以提高其效价。本研究利用
基因工程方法将链霉菌中与抗生素生物合成相关的
调控因子 crp 整合至刺糖多孢菌染色体上，构建成
工程菌株 S. spinosa-Crp。并研究了 Crp 蛋白的过表
达对刺糖多孢菌生长、形态及多杀菌素产量等的方
面的影响。
扫描电子显微镜观察结果表明，与对照菌株相比，
工程菌株菌丝片段化程度较高且分支较少，有利于减
少发酵过程中菌丝的结团，提高发酵过程中菌株的溶
氧水平，从而有效地促进多杀菌素的生物合成。本研
究中工程菌株多杀菌素的产量较对照菌株提高了
128%，一方面，可能与工程菌株菌丝片段化程度较高，
菌体生物量高于对照菌株有关；另一方面，Crp 是一
个全局性调控因子，通过调控菌中他调控因子如
RelC、AfsR 等协调刺糖多孢菌中初级代谢与次级代谢
之间的代谢流，使前体物质更多的流向次级代谢。Crp
蛋白的调控作用主要体现在：（1）影响碳代谢流。
Crp 蛋白直接控制着几种乙酰-辅酶 A 积累相关酶的
表达及丙酰辅酶 A 羧化酶（ACCase）的表达（多种
聚酮合成酶的前体物质是丙酰-辅酶 A，该物质由丙
酰辅酶 A 羧化酶催化而成）[24]；（2）影响磷酸盐
的水平。细胞内磷的稳态是通过 PhoP 和 AfsR 共同
作用达到的[25]，AfsR 调控因子对抗生素产量的影响
是通过激活 afsS 获得[26]；受 PhoP 和 AfsR 共同影响
的 24 个基因中，有一半也受 Crp 的影响；25 个 AfsS
特异性调控组分及 38 个 PhoP 特异调控组分同时受
Crp 的调控[26-27]。然而，Crp 在刺糖多孢菌中的具体
调控机制及与其他调控基因的调控网络有待进一步
研究。
值得注意的是，本研究工程菌株在液体培养基中
培养时没有出现二次生长[28]，这可能是因为利用完速
效碳源后，工程菌株中 Crp 蛋白的过量表达使细胞中
激活蛋白 CAP 的合成大量增加，激活乳糖等操纵子，
从而快速利用其他碳源进行生存[29]，因而观察不到明
显的二次生长现象。此外，Piette 等研究报道，Crp 蛋
白的过量表达促使天蓝色链霉菌呈现“光秃型”[30]，
本研究发现在 BHI 和 ISP-2 培养基上，工程菌株与对
照菌株相比，其孢子萌发及孢子形成速率有所延迟，
但最终仍然能够正常产生孢子，这可能是因为 Piette
等采用的是高拷贝复制型的质粒，而本研究采用的是
整合性质粒，Crp 未达到产生光秃型现象的表达量。
在营养丰富的 R6 培养基上两者生长速率及菌落形态
无明显差异，推测与培养基组分不同有关。
对链霉菌进行基因整合最常见的方法是 PhiC31
位点特异性重组，但笔者通过序列比对分析发现，刺
糖多孢菌基因组上没有 phiC31 attB 位点的同源序
列[31]，因此利用此方法对刺糖多孢菌进行基因改造行
不通。目前，主要采用同源重组的方法对刺糖多孢菌
进行遗传修饰，但此方法要求同源臂长度至少达到
1 kb 以上，否则很难得到重组子，本研究采用的原始载
体 pUC-spn 含部分多杀菌素生物合成基因簇（19 kb），
保证了足够长的同源臂进行同源重组，有效的提高了
接合转移及同源重组效率。本研究中采用 Red/ET 同
源重组的方法将调控基因 crp 亚克隆至 pUC-spn 以构
建重组载体，该技术简便高效，尤其适合对大质粒进
行改造，为其他调控基因的克隆提供了经验与技术支
撑。
4 结论
环腺苷酸受体蛋白基因在刺糖多孢菌中的过量表
达引起了该菌株形态与生长上的变化，与对照菌株相
比，工程菌株出现了孢子萌发及形成速率延迟、菌丝
体片段化程度高且分支少、二次生长现象消失等特点；
并且，相比于对照菌株，工程菌株中多杀菌素的产量
提高了 128%，说明 crp 的过量表达能有效促进刺糖多
孢菌中多杀菌素的生物合成。

References
[1] Waldron C, Matsushima P, Rosteck Jr P R, Broughton M C, Turner J,
Madduri K, Baltz R H. Cloning and analysis of the spinosad
biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora spinosa. Chemistry &
Biology, 2001, 8: 487-499.
[2] Sparks T C, Crouse G D, Durst G. Natural products as insecticides:
the biology, biochemistry and quantitative structure-activity
relationships of spinosyns and spinosoids. Pest Management Science,
2001, 57: 896-905.
[3] Luo Y S, Kou X X, Ding X Z, Hu S B, Tang Y, Li W P, Xia L Q.
Promotion of spinosad biosynthesis by chromosomal integration of
the Vitreoscilla hemoglobin gene in Saccharopolyspora spinosa.
Science China Life Science, 2012, 55(2): 172-180.
[4] 蔡恒, 王燕, 万红贵, 蒋导航, 王汉领, 赵宗松. 刺糖多孢菌生产
多杀菌素的研究进展. 中国生物工程杂志, 2011, 31(2): 124-129.
3586 中 国 农 业 科 学 47 卷
Cai H, Wang Y, Wan H G, Jiang D H, Wang H L, Zhao Z S. Research
progress of spinosad produced by Saccharopolyspora spinosa. China
Biotechnology, 2011, 31(2): 124-129. (in Chinese)
[5] Chen Y, Smanski M J, Shen B. Improvement of secondary metabolite
production in Streptomyces by manipulating pathway regulation.
Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 86: 19-25.
[6] Martín J F, Liras P. Engineering of regulatory cascades and networks
controlling antibiotic biosynthesis in Streptomyces. Current Opinion
in Microbiology, 2010, 13: 263-273.
[7] Bruheim P, Sletta H, Bibb M J, White J, Levine D W. High-yield
actinorhodin production in fed-batch culture by a Streptomyces
lividans strain overexpressing the pathway-specific activator gene
actII-ORF4. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,
2002, 28(2): 103-111.
[8] Lee J Y, Hwang Y S, Kim S S, Kim E S, Choi C Y. Effect of a global
regulatory gene, afsR2, from Streptomyces lividans on avermectin
production in Streptomyces avermitilis. Journal of Bioscience and
Bioengineering, 2000, 89(6): 606-608.
[9] Wu J Q, Zhang Q L, Deng W, Qian J C, Zhang S L, Liu W. Toward
improvement of erythromycin a production in an industrial
Saccharopolyspora erythraea strain via facilitation of genetic
manipulation with an artificial attB site for specific recombination.
Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(21): 7508-7516.
[10] Jin Z H, Wu J P, Zhang Y, Cheng X, Yang L R, Cen P L. Improvement
of spinosad producing Saccharopolyspora spinosa by rational
screening. Journal of Zhejiang University Science A, 2006, 7(Suppl.2):
366-370.
[11] Wang C, Zhang X, Chen Z, Wen Y, Song Y. Strain construction for
enhanced production of spinosad via intergeneric protoplast fusion.
Canadian Journal of Microbiology, 2009, 55: 1070-1075.
[12] Xue C Y, Duan Y J, Zhao F L, Lu W Y. Stepwise increase of spinosad
production in Saccharopolyspora spinosa by metabolic engineering.
Biochemical Engineering Journal, 2013, 72(15): 90-95.
[13] Pan H X, Li J A, He N J, Chen J Y, Zhou Y M , Shao L, Chen D J.
Improvement of spinosad production by overexpression of gtt and gdh
controlled by promoter PermE* in Saccharopolyspora spinosa
SIPI-A2090. Biotechnology Letters, 2011, 33: 733-739.
[14] Derouaux A, Dehareng D, Lecocq E, Halici S, Nothaft H, Giannotta F,
Moutzourelis G, Dusart J, Devreese B, Titgemeyer F, Van Beeumen J,
Rigali S. Crp of Streptomyces coelicolor is the third transcription
factor of the large CRP-FNR superfamily able to bind cAMP.
Biochemical and Biophysical Research Communications, 2004, 325:
983-990.
[15] Fic E, Bonarek P, Gorecki A, Kedracka-Krok S, Mikolajczak J, Poli A,
Wasylewski Z. cAMP receptor protein from Escherichia coli as a
model of signal transduction in proteins. Journal of Molecular
Microbiology and Biotechnology, 2009, 17: 1-11.
[16] Derouaux A, Halici S, Nothaft H, Neutelings T, Moutzourelis G,
Dusart J, Titgemeyer F, Rigali S. Deletion of a cyclic AMP receptor
protein homologue diminishes germination and affects morphological
development of Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology,
2004, 186(6): 1893-1897.
[17] Gao C, Hindra, Mulder D, Yin C, Elliot M A. Crp is a global regulator
of antibiotic production in Streptomyces. mBio, 2012, 3(6):
e00407-12.
[18] Sambrook J, Fritsh E F, Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 2002.
[19] Bian X, Huang F, Stewart F A, Xia L Q, Zhang Y M, Müller R. Direct
cloning, genetic engineering, and heterologous expression of the
syringolin biosynthetic gene cluster in E. coli through Red/ET
recombineering. ChemBioChem, 2012, 13: 1946-1952.
[20] Matsushima P, Broughton M C, Turner J R, Baltz R H. Conjugal
transfer of cosmid DNA from Escherichia coli to Saccharopolyspora
spinosa: effects of chromosomal insertions on macrolide A83543
production. Gene, 1994, 146: 39-45.
[21] Kieser T, Bibb M J, Buttner M J, Chater K F, Hopwood D
A. Practical Streptomyces Genetics. Norwich: The John Innes
Foundation, Colney, 2000: 161-211.
[22] 高宇, 王志英, 赵红盈, 刘欣. 白蜡吉丁啮小蜂触角感觉器的扫描
电镜观察. 中国农业科学, 2013, 46(9): 1956-1964.
Gao Y, Wang Z Y, Zhao H Y, Liu X. Scanning electron microscopy
observation on the antennal sensilla of Tetrastichus planipennisi
(Hymenoptera: Eulophidae). Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(9):
1956-1964. (in Chinese)
[23] Tang Y, Xia L Q, Ding X Z, Luo Y S, Huang F, Jiang Y W.
Duplication of partial spinosyn biosynthetic gene cluster in
Saccharopolyspora spinosa enhances spinosyn production. FEMS
Microbiology Letters, 2011, 325(1): 22-29.
[24] Ryu Y G, Butler M J, Chater K F, Lee K J. Engineering of primary
carbohydrate metabolism for increased production of actinorhodin in
Streptomyces coelicolor. Applied and Environmental Microbiology,
2006, 72(11): 7132-7139.
[25] Santos B F, Rodríguez G A, Sola L A, Martín J F. Cross-talk between
two global regulators in Streptomyces: PhoP and AfsR interact in the
control of afsS, pstS and phoRP transcription. Molecular
Microbiology, 2009, 72(1): 53-68.
18 期 徐妙等：环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响 3587
[26] Lian W, Jayapal K P, Charaniya S, Mehra S, Glod F, Kyung Y S, Hu
W S. Genome-wide transcriptome analysis reveals that a pleiotropic
antibiotic regulator, AfsS, modulates nutritional stress response in
Streptomyces coelicolor A3(2). BMC Genomics, 2008, 9(1): 56.
[27] Rodríguez-Garca A, Barreiro C, Santos-Beneit F, Sola-Landa A,
Martín J F. Genome-wide transcriptomic and proteomic analysis of
the primary response to phosphate limitation in Streptomyces
coelicolor M145 and in a ∆phoP mutant. Proteomics, 2007, 7:
2410-2429.
[28] Luo Y, Ding X Z, Xia L Q, Huang F, Li W P, Huang S Y, Tang Y,
Sun Y J. Comparative proteomic analysis of Saccharopolyspora
spinosa SP06081 and PR2 strains reveals the differentially expressed
proteins correlated with the increase of spinosad yield. Proteome
Science, 2011, 9: 40.
[29] Deutscher J. The mechanisms of carbon catabolite repression in
bacteria. Current Opinion in Microbiology, 2008, 11: 87-93.
[30] Piette A, Derouaux A, Gerkens P, Noens E E, Mazzucchelli G, Vion S,
Rigali S. From dormant to germinating spores of Streptomyces
coelicolor A3(2): new perspectives from the crp null mutant. Journal
of Proteome Research, 2005, 4: 1699-1708.
[31] Pan Y, Yang X, Li J, Zhang R, Zhang R F, Hu Y F, Zhou Y G, Wang J,
Zhu B L. Genome sequence of the spinosyns-producing bacterium
Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395. Journal of Bacteriology,
2011, 193(12): 3150-3151.

（责任编辑 岳梅）