全 文 ：World Notes on Antibiotics, 2009, Vol. 30, No. 4· 164 ·
刺糖多胞菌合成多杀菌素的基因研究
叶丽娟，王辂*
（中国医药集团 四川抗菌素工业研究所，成都 610052）
摘　要：多杀菌素是由刺糖多孢菌产生的一种新型大环内酯类混合次级代谢产物，为新型、高效、安全的生物杀
虫剂。该类化合物由一个12元大环内酯以及一个中性糖和一个胺糖构成。多杀菌素生物合成基因大部分聚集在刺糖多
孢菌基因组上约80kb大小的区域中。该区域DNA已被完全测序，并通过破坏目的基因的方法，对这一区域DNA的特
性和功能进行了深入研究。多杀菌素生物合成基因簇包括5个编码I型聚酮合成酶的基因和14个与大环内酯结构修饰有
关的基因，另外还有4个编码鼠李糖的基因未包含在上述基因簇中。
关键词：多杀菌素；刺糖多胞菌；生物合成；基因；聚酮合成酶；大环内酯
中图分类号：R978.1+9；Q939.9 　　　文献标识码：A 文章编号：10001-8751(2009)04-0164-07
Study on Spinosad Synthetic Genes in Saccharopolyspora spinosa
YE Li-juan, WANG Lu
(Department of Pharmaceutical Chemistry, Sichuan Industrial Institute of Antibiotics, China National Pharmaceutical Group
Corporation, Chengdu 610052, China)
Abstract：As a serial of novel, efficient and safe bio-insecticides, spinosad are produced by Saccharopolyspora
spinosa and are catalogued into macrolide secondary metabolites. These compounds are composed by one neutral sugar
(rhamnose), an amino sugar (forosamine), and a 5,6,5-tricyclic ring system fused to a 12-membered macrocyclic lactone. In
the bacteria producing these compounds, most of the macrolide biosynthetic genes clustered together in a 70~80kb region
of the genome. DNA in this region has been sequenced and the character and function of it has been intensively studied by
interrupting target gene. The gene clusters in charge of spinosad biosynthesis include 5 genes encoding polyketide synthase
typeⅠ(PKS-Ⅰ), 14 genes required for modification of macrolide. Another 4 genes encoding for rhamnose are not included
in the above-mentioned gene clusters.
Key words: spinosad; Saccharopolyspora spinosa ; biosynthesis; gene; PKS; macrolide
杀虫剂在人类日常生活中起着重要的作用，它
们不仅对农作物有保护作用，还可以有效阻止蚊虫
对疾病的传播，如疟疾。然而，过去几十年对高毒
性杀虫剂的使用未进行严格控制，造成环境破坏，
许多非靶标生物也遭到毒杀。所以，开发具有高选
择性和低毒性的新型杀虫剂迫在眉睫[1]。
1997年美国陶氏益农公司推出的多杀菌素(商品
名：菜喜)即是一类新型高效的生物杀虫剂。多杀菌
素因具有低毒、低残留、自然分解快、对已知杀虫
剂无交叉耐药性等特点，1999年荣获美国“总统绿
色化学品挑战奖”。而多杀菌素最初是由美国礼来
公司科研人员于1989年从维尔群岛土壤中分离的刺
糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa)发酵液中分离
得到 [2]，随后经NMR和X-射线晶体衍射鉴定为大环
内酯类物质[3]，目前已鉴定出34种结构类似物[4]，其
中以多杀菌素A和D(化学结构见图1)活性最高。
天然产生的多杀菌素类化合物由一个与5,6,5-三
环系统相联的12元大环内酯，以及一个中性糖(鼠李
糖)和一个胺糖(福乐糖)构成 [5]。同时还存在两类不
含糖基的化合物：拟甙元类化合物(不含胺糖)和反
拟甙元类化合物(不含中性糖)。这些化合物均可由
S. spinosa发酵产生，且不同菌株所产多杀菌素比例
收稿日期：2009-01-19
作者简介：叶丽娟，硕士，主要从事微生物遗传育种及培养过程优化的研究。
通讯作者：王辂， 硕士，主要从事微生物天然药物的研究，Tel: 028-84216035, E-mail: L.Wang@mail.siia.sc.cn.
DOI:10.13461/j.cnki.wna.004383
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不同，如NRRL 18395、18537、18538、18539主要
合成多杀菌素A-J，NRRL18823主要合成多杀菌素
Q-T，NRRL18743主要合成多杀菌素K、O、P、U、
V、W、Y。然而这些原始菌株在发酵生产多杀菌素
A、D时转化率太低，往往需要大量的发酵液才能提
取少量多杀菌素。因此礼来和陶氏益农的研究员开
始着手对S. spinosa的基因研究，并通过克隆多杀菌
素合成途径中关键酶的基因成功地提高了多杀菌素
的产量[6]。这也为生产新的具有不同杀虫谱的多杀菌
素衍生物提供了可行方法。本文将阐述多杀菌素生
物合成途径和合成途径中关键酶的基因簇功能。
1　多杀菌素的生物合成
1.1 合成途径
13C放射性标记和生物转化研究以及现代基因序
列分析[7]发现S.spinosa是按聚酮合成途径合成多杀菌
素的内酯环，再在C9和C17上分别与鼠李糖和福乐
糖胺结合。因此多杀菌素的合成可分2个不同阶段。
首先2~3个碳的羧酸类前体(如：丙酰辅酶A)在
酶作用下通过逐步缩合和修饰合成线形的聚酮链，
再通过硫酯酶催化成环，接着在spnF , spnJ , spnL
和spnM基因编码的酶作用下，于大环内酯分子的
C3~C14、C4~C12和C7~C11之间形成交联桥，生成
4元环甙元中间体[8](图2)。这一过程与其他大环内酯
类药物(如：红霉素、阿维菌素和雷帕霉素)的合成过
程相似[9]。
多杀菌素合成的第二阶段是在酶促作用下将由
D-葡萄糖-1-磷酸合成的NDP-鼠李糖结合到甙元中间
体上，再通过甲基化修饰酶形成拟甙元，在特异的
糖基转移酶作用下将NDP-二甲基-福乐糖胺结合在拟
甙元上，形成终产物多杀菌素[8]。有趣的是只有在鼠
李糖与甙元中间体结合后，才能与福乐糖胺结合。
1.2 关键酶
S.spinosa与其他合成大环内酯的细菌一样，其
生物合成基因聚集成簇，长度约70~80kb，在这段
基因序列的中央有3~5个高度保守的基因负责编码
合成多杀菌素内酯环的关键酶—— I型聚酮合成酶
(PKS)。PKS是一个结构和功能复杂的多酶体系，由
一个起始组件和多个延伸组件构成，每一延伸组件
都可向聚酮链上添加一个特异的乙酰辅酶A前体，同
时还能对β-酮基进行特异的修饰。因此，PKS中延
伸组件的组成及其次序决定着聚酮链的结构。而这
些组件又由多个具有不同功能的催化区域构成。其
中起始组件由乙酰转移酶(AT)区域构成，该区域可
将前体的乙酰基转移到酰基载体蛋白(ACP)上。延伸
组件由β-酮合成酶(KS)、β-酮还原酶(KR)、脱水酶
(DH)、烯酰还原酶(ER)和硫酯酶(TE)区域构成，各
具不同催化功能[4]。
多杀菌素内酯环的修饰包括甲基化以及非常
见糖基的掺入。催化这些反应的酶基因多数聚集在
PKS基因周围，编码脱氧糖合成酶系 [10]和特异的糖
基转移酶。其中脱氧糖合成酶系包括葡萄糖核苷
转移酶、脱水酶、差向异构酶、酮还原酶、转氨酶
等，分别催化葡萄糖的活化、脱水、变构、还原、
转氨等反应 [11]，再由特异的糖基转移酶——鼠李糖
转移酶、O-甲基转移酶和福乐糖胺转移酶催化结合
在内酯环分子上。
2　多杀菌素生物合成基因簇
Waldron等报道通过分子探针，营养缺陷型菌
株的回复突变以及染色体步查法测定S.spinosa多杀
菌素生物合成基因和相关的可读框(ORF)的序列(共
80 ku，详细核苷酸序列参见US Pat 0023343 A1)，
包括spnA-spnS、ORFL15、ORFL16、ORFL1、
ORFL2、S.spinosa gtt、S.spinosa gdh、S.spinosa epi
和S.spinosa kre[12]。这些基因在多杀菌素生物合成途
径中的大致功能可参看图2，下文对其具体功能进行
细致探讨。
2.1 PKS基因
多杀菌素PKS基因序列包括5个具有框内终止
子的可读框：spnA-spnE，相互之间头尾紧密相接
(图3)，中间无任何非PKS功能基因。这5个多杀菌素
PKS基因的核苷酸序列和相应编码的多肽已全部鉴
定[4](表1)。
spnA编码起始组件(碱基序:21126-24041)和延伸
组件1(碱基序:24102-28649)。起始组件和延伸组件1
中各功能域的核苷酸序列和相应的氨基酸序见表2。
spnB编码延伸组件2(碱基序:29024-35125)。延
伸组件2中各功能域的核苷酸序列和相应的氨基酸序
图 1 多杀菌素A和D的化学结构
Figure 1 Chemical structure of spinosad A and D
World Notes on Antibiotics, 2009, Vol. 30, No. 4· 166 ·
见表3。
spnC编码延伸组件3(碱基序: 35518-40035)和延
伸组件4(碱基序: 40102-44676)。延伸组件3和延伸组
件4中各功能域核苷酸序列和相应氨基酸序见表4。
spnD编码延伸组件5(碱基序: 45077-50254)、延
伸组件6(碱基序:50318-54883)和延伸组件7(碱基序:
54947-59494)。延伸组件5、6和7中各功能域的核苷
酸序列和相应的氨基酸序见表5。
spnE编码延伸组件8(碱基序:59902-65079)、延
伸组件9(碱基序:65146-70401)和延伸组件10(碱基序
:70471-76566)。延伸组件8, 9和10中各功能域的核苷
酸序列和相应的氨基酸序见表6。
在上述表2~6的50个功能域中，起始组件氨基末
端的KSi区域是非功能区，因为β-酮合成酶所必需
的172位上的半胱氨酸被谷氨酰胺取代[13]。Bradley
等在泰乐菌素PKS起始组件中同样发现了一个类似
的非功能KS区域[14]。除此外，其他多杀菌素PKS区
域为功能区域。
表 1 多杀菌素PKS基因的核苷酸序列和相应多肽大小
Table 1 The nucleotide sequence for each of the five spinosyn PKS
genes, and the size of corresponding polypeptides
基因 碱基序 相应多肽大小
spnA 21111-28898 2595
spnB 28916-35374 2152
spnC 35419-44931 3170
spnD 44966-59752 4928
spnE 59803-76569 5588
图 2 多杀菌素A生物合成途径
Figure 2 The biosynthetic pathways of spinosad A
表 2 spnA编码的起始组件和延伸组件1中各功能域的
核苷酸序列和相应的氨基酸序
Table 2 The nucleotide sequence and corresponding amino acid
sequence in each functional domain within the initiator module and
extender module 1 encoded by spnA
功能域 碱基序 氨基酸序
KSi 21126-22379 6-423
ATi 22692-23669 528-853
ACPi 23793-24041 895-977
KS1 24102-25349 998-1413
AT1 25683-26684 1525-1858
KR1 27582-28121 2158-2337
ACP1 28404-28649 2432-2513
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为了进一步研究PKS基因对S.spinosa合成多杀
菌素的影响，Matsushima等在1994年构建了一个源
于E.coli的pOJ260质粒。该质粒不能在S. spinosa中
独立复制，但可以通过与S. spinosa染色体的整合稳
定地存在于S. spinosa的PKS基因簇中。由于pOJ260
的插入，使PKS基因簇中相应可读框遭到破坏，对
重组子代谢产物进行分析发现spnA ORF中的BamH1
片段V、N或K(相应基因序列:21365-22052、22052-
24338、24338-26227)，spnD ORF中的BamH1片
段G、E或K(相应基因序列:48848-50578、50578-
52467、55207-55888)，spnE ORF中的BamH1片
段J、I、D、H或F(相应基因序列 :63219-63989、
65406-66733、66733-68997、69369-70731、70731-
72675)被外源基因破坏后会使S. spinosa合成多杀菌
素受阻[15]。
表 3 spnB编码的延伸组件2中各功能域的核苷酸序列和
相应的氨基酸序
Table 3 The nucleotide sequence and corresponding amino acid
sequence in each functional domain within the extender module 2
encoded by spnB
功能域 碱基序 氨基酸序
KS2 29024-30295 1-424
AT2 30629-31621 536-866
DH2 31697-32254 892-1077
ER2 33035-34072 1338-1683
KR2 34082-34621 1687-1866
ACP2 34886-35125 1955-2034
表 4 spnC编码的延伸组件3和4中各功能域的核苷酸序列和
相应的氨基酸序
Table 4 The nucleotide sequence and corresponding amino acid
sequence in each functional domain within the extender module 3
and 4 encoded by spnC
功能域 碱基序 氨基酸序
KS3 35518-36786 1-423
AT3 37108-38097 531-860
KR3 38992-39528 1159-1337
ACP3 39790-40035 1425-1506
KS4 40102-41373 1529-1952
AT4 41713-42705 2066-2396
KR4 43615-44157 2700-2880
ACP4 44431-44676 2972-3053
表 5 spnD编码的延伸组件5，6和7中各功能域的
核苷酸序列和相应的氨基酸序
Table 5 The nucleotide sequence and corresponding amino acid
sequence in each functional domain within the extender module 5,
6 and 7 encoded by spnD
功能域 碱基序 氨基酸序
KS5 45077-46348 1-424
AT5 46691-47674 539-866
DH5 47753-48310 893-1078
KR5 49226-49771 1384-1565
ACP5 50009-50254 1645-1726
KS6 50318-51592 1748-2172
AT6 51923-52915 2283-2613
KR6 53822-54361 2916-3095
ACP6 54638-54883 3188-3269
KS7 54947-56215 3291-3713
AT7 56549-57535 3825-4153
KR7 58106-58990 4344-4638
ACP7 59249-59494 4725-4806
表 6 spnE编码的延伸组件8，9和10中各功能域的
核苷酸序列和相应的氨基酸序
Table 6 The nucleotide sequence and corresponding amino acid
sequence in each functional domain within the extender module 8,
9and 10 encoded by spnE
功能域 碱基序 氨基酸序
KS8 59902-61173 1-424
AT8 61489-62445 530-848
DH8 62548-63111 883-1070
KR8 64006-64557 1369-1552
ACP8 64843-65079 1648-1726
KS9 65146-66420 1749-2173
AT9 66760-67743 2287-2614
DH9 67819-68301 2640-2800
KR9 69370-69924 3157-3341
ACP9 70165-70401 3422-3500
KS10 70471-71745 3534-3948
AT10 72079-73071 4060-4390
DH10 73138-73692 4413-4597
KR10 74599-75135 4900-5078
ACP10 75415-75660 5172-5253
TE10 75805-76566 5302-5555
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2.2 与PKS基因簇毗邻的修饰基因(含福乐糖胺合成
基因)
在PKS基因簇的上游有16个可读框，每一读码
框至少含有100个密码子[16]，在PKS基因簇的下游有
2个可读框(图3)，这18个可读框编码修饰多杀菌素
大环内酯结构的蛋白质或多肽[17]。表7列出了这18个
可读框的基因序列、编码的氨基酸数量以及相关功
能，其中ORFR1和ORFR2为下游读码框。
采用上述插入破坏基因的方法，分别对上述
17个可读框进行了分析，同时对生物转化也作了研
究，结果见表8。其中R1因序列太短，无插入位点，
未作研究，spnQ-S与脱氧糖的合成有关，所以也未
作研究。
PKS上游的11个可读框与多杀菌素的生物合成
直接相关，当受到破坏时多杀菌素主成分A和D无法
累积(见表8)。上游的另外2个基因(L15，L16)与下游
基因R2受到破坏时不影响多杀菌素的积累。
当spnF, spnJ, spnL, spnM受到破坏时，菌株几
乎不产生任何多杀菌素，却可以将外源甙元(AGL)转
化成多杀菌素A，说明这些基因肯定与甙元的合成有
关。Fish等研究发现，这些基因编码的多肽可促使多
杀菌素大环内酯母核中形成碳-碳交联桥，而这些基
因发生突变的菌株则会产生出不稳定的化合物[18]。
当spnG受到破坏时，菌株同样不会产生多杀菌
素，但也不能对外源甙元(AGL)进行转化。进一步
研究发现，该基因编码鼠李糖转移酶。另外spnG被
破坏的突变株亦无4-O-甲基转移酶活性，因此表现
出可将3, 4-二脱甲基多杀菌素(P)转化成4-脱甲基多
杀菌素(K)，但是不能转化成完全甲基化的多杀菌素
A的活性。而在spnG下游的spnH基因受到破坏时，
同样不会具有4-O-甲基转移酶活性，因为破坏序列
在同一操纵子中。不过spnH受破坏后还会失去3-O-
图 3 多杀菌素生物合成基因簇
Figure 3 The biosynthetic gene clusters of spinosads
表 8 在修饰基因的17个可读框中插入破坏基因后的分析结果
Table 8 The analytical results after inserting the interrupting gene
in ORF 17 of modification gene
破坏基因 插入片段基序 多杀菌素
生物转化产物
AGL→ P→ K→ PSA→
无 无 A+D
spnF 20325-20924 无 A A A
spnG 18818-19426 无 AGL K A
spnG-H 18511-19559 P K A
spnI 16699-17400 无 J A A
spnJ 14866-15470 无 A A
spnK 13785-14574 无
spnL 12791-13428 无 A A A
spnM 11705-12371 3% A A A
spnN 10636-11369 PSA
spnO 9262-10226 PSA
spnP 7391-8159 PSA PSA
L 15 2145-2719 A+D
L 16 1226-1852 A+D
R 2 79321-79855 A+D
AGL：多杀菌素A甙元；P、K分别为多杀菌素P和K；PSA代表多杀菌素A 9-Psa
表 7 修饰基因的基因序列，编码的氨基酸数量及相关功能
Table 7 The nucleotide sequence, number of amino acids and
corresponding function of 16 ORF in modification gene
基因 碱基序 氨基酸数量 功能
spnF 20168-20995 275 C端甲基化
spnG 18541-19713 390 加糖
spnH 17749-18501 250 糖甲基化
spnI 16556-17743 395 未知
spnJ 14799-16418 539 氧化还原
spnK 13592-14785 397 未知
spnL 12696-13547 283 C端甲基化
spnM 11530-12492 320 未知
spnN 10436-11434 332 未知
spnO 8967-10427 486 脱氧糖合成
spnP 7083-8450 455 加糖
spnQ 5363-6751 462 双脱氧糖合成
spnR 4168-5325 385 糖胺基化
spnS 3416-4165 249 氨基糖甲基化
L 15 2024-2791 255 氧化还原
L 16 1135-1971 278 转录调控
R 1 76932-77528 198 未知
R 2 77729-79984 751 DNA复制
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甲基转移酶活性，因此菌株表现出积累多杀菌素P
的现象。spnI基因可能编码3-O-甲基转移酶，因为
spnI与Streptomyces nogalator的ORF Y基因同源性极
高。虽然ORF Y的产物还不清楚，但是Streptomyces
nogalator却可以合成一种少见的四甲基脱氧糖(诺加
糖)，这与多杀菌素A中的三甲基脱氧糖(鼠李糖)相
似，所以推测这2种基因都与糖的甲基化有关。同时
对spnI的破坏发现，突变菌株仅能将多杀菌素P转化
成3-脱甲基多杀菌素(J)，而非多杀菌素A。spnK具
有和spnI以及ORF Y相似的基因序列，推测可能编码
2-O-甲基转移酶。对它的破坏发现不能累积任何多
杀菌素。
当spnN、spnO和spnP受到破坏时，突变菌株
会积累拟甙元。因此这些基因与福乐糖胺的生物合
成或添加有关。通过基因比对发现spnP和spnO分别
与糖基转移酶，2, 3-脱水酶的基因相近，因此推测
spnP可能编码福乐糖胺转移酶，spnO则可能参与福
乐糖胺合成过程中的2-脱氧作用。
2.3 鼠李糖合成基因
鼠李糖合成的第一个酶是葡萄糖胸苷转移酶
(gtt)，该酶可将二磷酸核苷酸(NDP)加入葡萄糖。第
二个酶是葡萄糖脱氢酶(gdh)，可以催化合成脱氧糖
中间代谢产物：NDP-4-酮-6-脱氧-D-葡萄糖。另外
的差相异构酶(epi)和酮还原酶(kre)则是鼠李糖合成
代谢中的特异酶，它们可将中间代谢产物NDP-4-酮
-6-脱氧-D-葡萄糖转化成鼠李糖转移酶的作用底物：
NDP-L-鼠李糖。这些酶的编码基因目前已被全部克
隆，它们与PKS基因簇不在一起 [19]。通过外源基因
插入研究发现，这些基因被破坏后，突变菌株仅能
生长在渗透压稳定的培养基中。而且即便在这种培
养基下，其生长速率也明显慢于野生型菌株。进一
步研究发现鼠李糖是S. spinosa细胞壁的组成成分，
通过Southern杂交显示S. spinosa细胞中无其他基因
与上述4个基因同源，因此S. spinosa细胞壁中鼠李糖
的合成和多杀菌素合成共用一套基因。
3 讨论
对多杀菌素生物合成基因的深入研究，可以有
效地指导研究人员提高S. spinosa发酵生产多杀菌素
的产量以及利用基因工程技术生产新型多杀菌素类
化合物。但由于多杀菌素仍在专利保护期内，所以
对其结构改造的研究受到了一定的阻碍。Hahn等报
道了从另一种刺糖多孢菌S. pogona中分离获得的30
种丁烯多杀菌素类化合物[20]，这类化合物仅在C-21
位上与多杀菌素不同。进一步的基因研究发现，
S.pogona生物合成基因簇与S. spinosa的基因簇相似
度高达91%~94%，可谓是天然基因重组的杰作。这
也向我们展示了通过基因工程技术获得新型多杀菌
素衍生物的可行性。
参 考 文 献
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逆的抑制剂将通过永久抑制激酶活性而体现出其优
越性。这一原则正愈来愈多地应用于设计抗肿瘤药
物即蛋白激酶抑制剂之中。
使用如同迈克尔反应受体这样的活性化合物时
所面临的挑战是，寻找反应性足够低即不会不加选
择地与所有亲核基团反应但却与一个亲核的催化基
团强有力地特异性结合以至于高度选择性地烷基化
该基团的化合物。这也是目前正在进展中的对蛋白
剪接抑制剂进行优化的首要目标。一项研究是利用
已知的结核分支杆菌RecA内含肽的晶体结构来优化
在HTS中鉴定出的蛋白剪接抑制剂的结合能力和选
择性。