全 文 ：2011年 1月　第 13卷　第 1期 中国现代中药　ModernChineseMedicine Jan.2011　Vol.13　No.1
药理研究
■ [基金项目 ] 　国家 863计划项目(2008AA10323)
[通讯作者 ] 　＊王金辉 , Tel:(0993)2055001, E-mail:wangjh1972@vip.sina.cn;
＊黄健 , Tel:(024)23986482, E-mail:huang jian1977@yahoo.com.cn
阿魏侧耳多糖抗癌作用机理研究■
王金辉1, 2, 3, ＊ , 黄健2＊ , 巩平 1 , 李国玉1 , 魏秀岩 2 , 秦颖2 , 张翠 2 , 杨琳 1 , 王莹1
(1.石河子大学药学院 , 新疆　石河子　832002;2.沈阳药科大学中药学院 , 沈阳
辽宁　110016;3.教育部省部共建新疆特种植物药资源重点实验室 , 新疆　石河子　832002)
[摘要 ] 　目的:阿魏侧耳 (阿魏菇)多糖(Pleurotusferulaepolysaccharide, PFP)抗宫颈癌作用的机理研究。
方法:MTT法 、 中性红比色法和 Griess法。结果:灌胃给药 500 mg·kg-1的阿魏菇多糖可抑制小鼠宫颈癌 U14移植
瘤的生长 , 抑瘤率达到 39%, 临床抗宫颈癌药顺铂的抑瘤率为 46.5%, 阿魏菇多糖与顺铂共同作用时 , 抑瘤率达
到 65.1 %;但是在体外实验中 , 不同浓度阿魏菇多糖分别作用于人宫颈癌 HeLa和人乳腺癌 MCF-7细胞不同时间
后 , 却不能抑制两种细胞的生长;在 5 μg·mL-1的脂多糖刺激下 , 阿魏菇多糖不能促进脾淋巴细胞的增殖;不同浓
度的阿魏菇多糖作用于腹腔巨噬细胞 24 h, 能使腹腔巨噬细胞的吞噬能力显著增强 , 并且呈现明显的剂量依赖性 ,
与此同时阿魏菇多糖也促进了腹腔巨噬细胞的增殖 , 但是却不能刺激腹腔巨噬细胞释放 NO。结论:阿魏菇的抗宫
颈癌机制可能是通过促进小鼠机体免疫功能而实现的。
[关键词 ] 　阿魏菇多糖;U14荷瘤小鼠;腹腔巨噬细胞;脾淋巴细胞
阿魏侧耳 PleurotusferulaeLanzi, 又名阿魏菇 ,
阿魏蘑 , 因其生长在新疆干旱草原上的草本植物阿
魏上而得名 。其子实体菌肉肥厚 、 味道鲜美 、 口感
柔润 , 具有很高的营养价值和药用价值[ 1] 。阿魏侧
耳中含有多种营养物质 , 如含有多种维生素 、 氨基
酸 、蛋白质 、不饱和脂肪酸和微量元素 , 其中蛋白
质的含量可高达子实体干重的 20 %[ 2, 3] 。除此之
外 , 阿魏侧耳中所含的多糖据报道是其中的生物活
性成分 , 具有抗肿瘤 、 抗疲劳 、 抗氧化和抗衰老等
功效[ 4] 。本文对阿魏侧耳多糖的抗宫颈癌的活性进
行了测试 , 并对其抗癌的作用机理进行了初步的
研究。
1　材料
1.1动物
健康昆明系小鼠 , 6 ～ 8周龄 , 雄性 , 体重 18 ～
22 g, 购自新疆大学医学院实验动物中心 。动物随
机分组后置于温度 20 ～ 24 ℃, 恒湿 (55 ±5)%,
12 h光照(8∶00 ～ 20∶00)、 12 h黑暗 、隔音的动物室
内 , 自由摄食 、 饮水 。
1.2瘤细胞株
小鼠宫颈癌 U14细胞株 , 小鼠腹腔传代 , 购自
北京金紫晶生物医药技术有限公司 。实验时 , 当传
代的小鼠腹水变白时 , 采集腹水并用 0.9 %的氯化
钠溶液稀释成 1 ×107·mL-1的瘤细胞悬液备用。
1.3主要试剂及仪器
顺铂(Diaminodichloroplatin, DDP, 齐鲁制药有
限公司 , 批号:9120532DC);RPMI1640培养液 ,
脂多糖(LPS), 小鼠淋巴细胞分层液 , DMSO, 四甲
基偶氮唑盐(MTT), 灭活小牛血清 , PBS缓冲液 ,
均为 Sigma公司产品;DMEM培养液 (GIBCO公
司);MTT以 pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)配成 5
mg·mL-1备用 。Griess试剂以蒸馏水配制 0.1 %盐
酸萘乙二胺(Sigma产品), 5 %磷酸配制 1 %磺胺嘧
啶(Sigma产品), 临用前两者等量混合 。美国 BIO-
RAD伯乐酶标仪(680)由沈阳药科大学提供。
1.4试药
阿魏菇购于新疆石河子市 , 经石河子大学谭勇
博士鉴定为阿魏侧耳 PleurotusferulaeLanzi, 标本号
为 No.20071002001, 保存在石河子大学药学院 。
阿魏菇加水热提取 1次 , 浸提温度 70 ℃, 浸提
2 h, 料液比 1∶40。阿魏菇水提取物加入木瓜蛋白酶
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DOI :10.13313/j.issn.1673-4890.2011.01.020
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(酶底比 8 mg·g-1), 用 HCl分别调 pH为 6, 60 ℃
水浴 90 min水解后 , 沸水浴 10 min使酶灭活 , 冷却
至室温 , 3 000 r·min-1离心 5 min, 取上清液加
95 %乙醇至醇浓度 80 %, 3 000 r·min-1离心 10 min
取沉淀 , 得阿魏菇多糖 , 得率 3.1 %。
2　方法
2.1阿魏侧耳多糖对 U14荷瘤小鼠的抑瘤率
小鼠 32只均于右腋下接种 107·mL-1浓度的
U14小鼠宫颈癌细胞悬液 0.2 mL, 随机分为 4组 ,
每组 8只 , 待瘤长至米粒大小后开始分组给药 , 模
型组隔天腹腔注射无菌 0.9 %氯化钠溶液(NS)0.2
mL/只 , 顺铂组隔天腹腔注射 3 mg·kg-1的顺铂 0.2
mL/只 , 阿魏侧耳组每天用 500 mg·kg-1阿魏侧耳多
糖 0.2 mL/只灌胃 , 阿魏侧耳 +顺铂组每天用 500
mg·kg-1的阿魏侧耳多糖 0.2 mL/只灌胃 , 隔天腹
腔注射 3 mg·kg-1的顺铂 0.2 mL/只 , 连续 10 d。所
有小鼠初始体重 , 于第 11天处死小鼠 , 称重 , 剥取
瘤块 , 洗去血渍 , 用吸水纸吸干水分 , 称重。
抑瘤率(%) =对照组(NS)平均瘤重 -给药
组平均瘤重 /对照组平均瘤重 ×100 %
2.2人宫颈癌 HeLa和人乳腺癌 MCF-7细胞生长实验
人宫颈癌 HeLa和人乳腺癌 MCF-7细胞 , 用培
养液 RPMI1640混悬细胞至浓度 4 ×105个·mL-1 ,
分别接种于 96孔培养板 , 每孔 100 μL。培养 12 h,
分别加入不同浓度的阿魏侧耳多糖 , 培养 24 h后 ,
MTT法测定两种细胞生长率 , 酶标仪 570 nm测 A值。
细胞生长率 (%) = [ A570(给药) -A570(空白) ] /
[ A570(阴性)-A570(空白)] ×100
2.3小鼠脾脏淋巴细胞增殖实验
无菌取小鼠脾脏 , 按常规制备脾细胞悬液 ,
最后用 DMEM培养液调细胞浓度至 1 ×106·mL-1。
取上述细胞悬液加入 96孔板中 , 每孔 100 μL, 同
时设空白对照组 、 阴性对照组及 LPS对照组。空
白对照组及阴性对照组加 DMEM培养液培养 , 除
空白对照组及阴性对照组外 , 各组分别加入 LPS
至终浓度为 5 μg·mL-1 , 其他给药组分别加入阿魏
侧耳多糖至终浓度为 3, 6, 12 , 25, 50, 100 μg·
mL-1。用 MTT法检测细胞的增殖率 , 酶标仪 570
nm测 A值 。
细胞增殖率(%) = [ A570(LPS或给药)-A570(空白)] /
[ A570(阴性)-A570(空白)] ×100
2.4腹腔 Mφ吞噬功能测定(中性红比色法)
用冷 PBS注入小鼠腹腔 , 常规制备腹腔 Mφ悬
液 。用完全 DMEM培养液调细胞浓度至 1 ×106·
mL-1 , 加入 96孔板 , 每孔 100 μL, 置 37 ℃, 5 %
CO2培养箱内培养 4 h后 , 弃未黏附细胞 , 同时设空
白对照组 、阴性对照组。空白对照组及阴性对照组加
DMEM培养液培养 , 其他给药组分别加入阿魏侧耳多
糖至终浓度为 3, 6, 12, 25, 50, 100 μg· mL-1 , 置
37 ℃, 5 % CO2培养箱内培养 24 h后 , 弃上清液 ,
加入 0.072 %的中性红溶液 100 μL/孔 , 培养 30 min
后 , 以 PBS洗 2次 , 加入腹腔 Mφ裂解液 200 μL/孔 ,
4 ℃静置过夜 , 酶标仪 530 nm测 A值。
2.5腹腔 MφNO释放能力测定(Griess法)
腹腔 Mφ制备 、 加样 、 分组同上 。经 37 ℃, 5
% CO2培养 24 h, 取上清液 100 μL加至另一块 96
孔板相应位置 , 加入 Griess液 100 μL/孔 , 25 ℃反
应 10 min, 酶标仪 530 nm测 A值。
2.6小鼠腹腔巨噬细胞增殖实验
用冷 PBS注入小鼠腹腔 , 常规制备腹腔 Mφ悬
液 , 用 DMEM培养液调细胞浓度至 1 ×106·mL-1。
其余操作同 2.3。
2.7统计方法
各组数据采用组间方差分析和 t检验统计处理 。
3　结果
3.1阿魏侧耳多糖对宫颈癌 U14荷瘤鼠生长的影响
图 1结果显示 , 500 mg·kg-1的阿魏侧耳多糖抑
瘤率达到 39 %, 表明其具有很强的抑制小鼠宫颈癌
U14移植瘤生长的作用;临床抗宫颈癌药顺铂的抑
瘤率为 46.5 %;阿魏侧耳多糖与临床抗宫颈癌药顺
铂共同作用时 , 抑瘤率达到 65.1 %, 说明阿魏侧耳
多糖可以提高顺铂的抗癌疗效 。
注:NS-0.9 %氯化钠溶液;DDP-顺铂(3 mg·kg-1);
PFP-阿魏侧耳多糖(500 mg·kg-1)
图 1　阿魏侧耳多糖对 U14荷瘤鼠生长影响图
3.2阿魏侧耳多糖对人宫颈癌 HeLa和人乳腺癌
MCF-7细胞生长的影响
　　不同浓度阿魏侧耳多糖 3, 6, 12, 25 , 50,
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100 μg·mL-1分别作用于人宫颈癌 HeLa和人乳腺癌
MCF-7细胞 12 , 24, 36 h后的结果如图 2, 3所示 ,
对两种细胞的生长情况几乎没产生影响(无统计学
意义)。显微镜下观察细胞的形态 , 发现细胞分布
均匀 , 自然舒展且细胞壁完整 (如图 4, 5所示)。
以上实验表明阿魏侧耳多糖在体外对肿瘤细胞生长
没有
直接抑制作用。
3.3阿魏侧耳多糖对小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响
5 μg·mL-1的 LPS单独作用脾淋巴细胞 24 h,
促进了脾淋巴细胞的增殖 , 与 DMEM培养的阴性
对照组(100 %)相比 , 细胞的增殖率为 135 %。
但是不同浓度的阿魏侧耳多糖和 LPS共同作用组
与 LPS单独作用组相比 , 无统计学意义 , 本实验
结果表明阿魏侧耳多糖对 LPS没有协同增殖作用 ,
如图 6所示 。
图 6　MTT法测定阿魏侧耳多糖对脾淋巴细胞的
增殖影响图(n=3, x±s)
3.4阿魏侧耳多糖对腹腔 Mφ吞噬功能及 NO释放的
影响
　　阿魏侧耳多糖 3, 6, 12, 25, 50, 100 μg·
mL-1作用于腹腔 Mφ24 h, 能使腹腔 Mφ的吞噬能力
显著增强并且呈现明显的剂量依赖性 , 如图 7所示。
但是不同浓度的阿魏侧耳多糖作用于腹腔巨噬细胞 ,
与阴性对照组(阿魏侧耳多糖 0 μg·mL-1)相比 , 阿
魏侧耳多糖不能刺激腹腔巨噬细胞释放 NO(无统计
学意义), 如图 8所示 。
注:与阴性对照(0 μg·mL-1)比较, ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
图 7　阿魏侧耳多糖对小鼠巨噬细胞吞噬的
影响图(n=3, x±s)
3.5阿魏侧耳多糖对腹腔 Mφ增殖的影响
3, 6, 12, 25 , 50, 100 μg·mL-1的阿魏侧耳多
糖作用于腹腔 Mφ24 h, 能促进腹腔 Mφ的增殖。其
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图 8　阿魏侧耳多糖对小鼠巨噬细胞释放 NO的
影响图(n=3, x±s)
中 25 μg·mL-1阿魏侧耳多糖作用于腹腔 Mφ与阴性
对照组(0 μg·mL-1)相比 , 能显著促进细胞的增
殖 , 如图 9所示 。
注:与阴性对照(0 μg·mL-1)比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
图 9　MTT法测定阿魏侧耳多糖对腹腔 Mφ细胞的
增殖影响(n=3, x±s)
4　讨论
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一 , 新疆
是我国宫颈癌的高发区 , 发病率和死亡率都很
高 , 并有逐年上升及年轻化的趋势 。宫颈癌治疗
手段由传统的局部治疗手术 、 放疗 , 发展到全身
化疗治疗 , 然而多种治疗方法均能减弱抗肿瘤免
疫反应 。因此 , 在宫颈癌的治疗过程中 , 提高机
体免疫功能在消灭肿瘤细胞的过程中起着重要的
作用 。
作为一种珍稀的药食两用资源 , 阿魏侧耳的
抗肿瘤方面的研究已有一些报道 [ 5] 。本实验选用
了文献中阿魏侧耳多糖的最适剂量 500 mg·kg-1 ,
结果表明 , 阿魏侧耳多糖对小鼠宫颈癌 U14移植
瘤有一定的抑制效果 , 抑瘤率达到 39 %, 临床常
用的宫颈癌化疗一线药顺铂对其的抑瘤率为 46.5
%, 阿魏侧耳多糖与顺铂共同作用时 , 抑瘤率达
到 65.1 %, 说明阿魏侧耳多糖可以提高顺铂的抗
癌疗效 。但是 , 不同浓度阿魏侧耳多糖分别作用
于人
宫颈癌 HeLa和人乳腺癌 MCF-7细胞不同时间后 ,
对两种细胞的生长情况几乎没产生影响 , 表明阿
魏侧耳多糖在体外对肿瘤细胞生长没有直接抑制
作用 。
阿魏侧耳的抗癌机制可能是通过其免疫激活
作用实现的 。它可激活机体免疫系统的细胞和体
液免疫应答而发挥抗肿瘤作用 , 尤其是细胞免疫
的激活及其产生的细胞因子具有重要的作用 。巨
噬细胞是参与杀伤肿瘤的一种十分活跃的免疫效
应细胞 , Mφ主要通过内吞和分泌一些效应分子
NO等杀伤肿瘤细胞 [ 6] 。本文实验结果表明 , 阿魏
侧耳多糖 3, 6 , 12, 25 , 50 , 100 μg·mL-1作用于
腹腔Mφ24 h, 能使腹腔 Mφ的吞噬能力显著增强 ,
并且呈现明显的剂量依赖性 。但是 3 , 6, 12, 25,
50, 100 μg· mL-1阿魏侧耳多糖作用于腹腔巨噬细
胞 , 与阴性对照组 (阿魏侧耳多糖 0 μg·mL-1 )
相比 , 阿魏侧耳多糖不能刺激腹腔巨噬细胞释放
NO。同时我们也考察了相同浓度的阿魏侧耳多糖
对腹腔巨噬细胞增殖能力的影响 , 阿魏侧耳多糖
作用于腹腔 Mφ24 h, 能促进腹腔 Mφ的增殖 ,
其中 25 μg·mL-1阿魏侧耳多糖作用于腹腔 Mφ与
阴性对照组(0 μg·mL-1)相比 , 能显著促进细胞
的增殖 。
淋巴细胞包括 B淋巴细胞和 T淋巴细胞 , 并且
两种细胞在脾脏中大量分布。 T细胞在机体的细胞
免疫和体液免疫诱导中均有重要作用 , 其作为免疫
效应细胞 , 主要有两方面功能:介导迟发型超敏反
应和直接杀伤靶细胞 。 B细胞通过分泌的抗体行使
其免疫功能 , 另外活化的 B细胞还具有加工和提呈
抗原给 T细胞的作用 [ 7] 。淋巴细胞增殖和分化是机
体免疫应答过程的一个重要阶段 。因此 , 检测淋巴
细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测
的一种常用方法 。本文实验结果表明 , 5 μg·mL-1
的 LPS单独作用脾淋巴细胞 , 促进了脾淋巴细胞的
增殖 , 但是阿魏侧耳多糖在 LPS的刺激下 , 没能促
进脾淋巴细胞的增殖 。
综合以上实验结果 , 在体内阿魏侧耳多糖抑
制了小鼠宫颈癌 U14荷瘤增殖 , 然而在体外阿魏
侧耳多糖却不能抑制人宫颈癌 HeLa细胞的生长 ,
但是阿魏侧耳多糖促进了小鼠腹腔巨噬细胞的增
殖和吞噬功能 。实验结果表明 , 阿魏侧耳的抗
癌机制可能是通过促进小鼠机体免疫功能而实
现的 。
·42·
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(收稿日期　2010-09-06)
StudyontheMechanismsofAnti-tumorEffectofPleurotusFerulaePolysaccharide
WANGJin-hui1, 2, 3 , HUANGJian2 , GONGPing1 , LIGuo-yu1 , WEIXiu-yan2 ,
QINYing2 , ZHANGCui2 , YANGLin1 , WANGYing1
(1.SchoolofPharmacy, ShiheziUniversity, Shihezi　832002, China;2.bSchoolofTraditional
ChineseMateriaMedica, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang　110016, China;3.KeyLaboratoryof
PhytomedicineResources＆ModernizationofTCM, Shihezi　832002, China)
[ Abstract] 　Objective:Toinvestigatethemechanismsofanti-tumorefectofPleurotusferulaepolysaccharide
(PFP)oncervix.Methods:MTTassay, neutralredcolorimetryandGriessassaywereused.Results:500mg·
kg-1 PFP(i.g.)canrestraingrowthoftransplantationtumorU14 ofcancerofthecervix(CACX)inKunmingmice
andtheinhibitionratewas39 %.IncombinationPFPwithDiaminodichloroplatin, theinhibitionrateagainstCACX
U14 was65.1 %, comparedwiththeinhibitionrateof46.5 % inDiaminodichloroplatin-treatedalonegroup.
However, aftertreatedHeLaandMCF-7 withdiferentconcentrationsofPFPfordiferenttimeperiods,
respectively, thePFPcannotinhibitcelgrowthofthetwokinds, invitro.Inthepresenceof5μg· mL-1 LPS, the
PFPcannotinduceproliferationofspleniclymphocyte.Wherever, whentheperitonealmacrophageswerecultured
withdiferentconcentrationsofPFPfor24 h, thePFPwasfoundtosignificantlyincreasethephagocytosisina
concentration-dependentmannerandtriggertheproliferationofperitonealmacrophages, however, NOcouldnotbe
detectedinthesameperitonealmacrophages.Conclusion:ThePFPinhibitedtheCACXgrowthbymeansof
improvingtheimmunesysteminKunmingmice.
[ Keywords] 　Pleurotusferulaepolysaccharide(PFP);U14 tumor-bearingmice;Peritonealmacrophages;
Spleniclymphocytes
(上接第 33页)
Methods:Determiningandanalysingthecontentofursolicacid, loganin, tannin, polysaccharide, totalorganic
acids, water-solubleextractandethanol-solubleextractofCorniFructussamples.Results:Thereisacertain
accumulationruleofmajorchemicalsubstancesofCorniFructusindiferentgrowthperiodfromthreeproduction
areas.ThegrowthageofCorniFructushaslitleefectonthequalityofmedicines;goodharvestoryieldreduction
ofCorniFructushasnotobviousinfluenceonthequalityofmedicines, too.Consideringthelocalharvesthabits
traditionaly, itapprovedthatthebestharvestperiodofHenanandZhejiangisinlateOctoberandthebestharvestof
ShanxiisthemidofOctober.Conclusion:Thisresultprovidesascientificbasisforthetraditionalharvestperiodof
CorniFructus.
[ Keywords] CorniFructus;Harvestperiod;Chemicalcomposition;Principalcomponentanalysis
·43·