全 文 ：中国美容医学2008年4月第17卷第4期 ChineseJournalofAestheticMedicine.Apr.2008.Vol.17.No.4
驱虫斑鸠菊是一种菊科植物，其果实在维族医药学中常
用来治疗白癜风，驱虫斑鸠菊黄酮是驱虫斑鸠菊果实的主要
活性成分。大量的临床结果已经表明驱虫斑鸠菊注射液以及
复方驱虫斑鸠菊搽剂对白癜风的治疗有效，但具体的药物有
效成分以及作用机制不明。本研究以不同浓度的驱虫斑鸠菊
黄酮干预体外培养的人表皮黑素细胞，观察黑素细胞形态、
酪氨酸酶活性、黑素含量、细胞增殖率以及处理前后黑素合
成关键酶蛋白的表达情况，旨在研究驱虫斑鸠菊治疗白癜风
的深层药理机制，为其临床更好的开发和利用提供实验依据。
1 材料和方法
1.1试剂和材料：驱虫斑鸠菊黄酮(新疆维吾尔自治区临床
药学研究所提供)，左旋多巴(L-dopa)、二甲基亚砜(DMSO)、
分离酶(dispase)、霍乱毒素(CT)、佛波酯（TPA）、MCDB153培
养基(美国 Sigma公司)，脱氧胆酸钠、噻唑蓝(MTT)(美国
Amersco公司)，多克隆兔抗人酪氨酸酶（TYR）抗体、多克隆兔
抗人酪氨酸酶相关蛋白酶1（TRP1）抗体、多克隆兔抗人酪氨
酸酶相关蛋白酶2（TRP2）抗体均由美国国立卫生院Hearing
教授惠赠，25cm2塑料培养瓶 (美国Corning公司)，Western
blot检测试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)，胎牛血清
(海克隆生物化学制品有限公司)，高速冷冻离心机、722分光
光度计(上海精密分析仪器有限公司)，Clinibio128c酶联免
疫检测仪(澳大利亚Clinibio公司)。
1.2细胞培养：取包皮环切手术病人的包皮标本，去除皮下
基金项目：国家自然科学基金资助 (编号：30600538)；博士后科学基金资助（编号：20070420574）
通讯作者：赵广，中国人民解放军空军总医院皮肤科教授，硕士研究生导师，主要从事皮肤肿瘤和色素性皮肤病的研究。
E-mail:guangfen@yahoo.com,北京市海淀区阜成路30号空军总医院皮肤科，100036
·论著·
驱虫斑鸠菊黄酮促人表皮黑素细胞黑素合成及其机制的研究
马慧军 1,訾绍霞 2,李 铀 1,刘 雯 1,王毅侠 1,赵 广 1
(1.中国人民解放军皮肤病研究所,空军总医院皮肤科 北京 100036;2.首都医科大学宣武医院皮肤性病科 北京 100053)
[摘要]目的:观察驱虫斑鸠菊黄酮对体外培养的人表皮黑素细胞(MC)黑素合成和酪氨酸酶活性的影响,并初步探讨其可能的
作用机制。方法:噻唑兰比色法(MTT)测定药物对细胞增殖率的影响,选择高、中、低 3种浓度(30、10、3μg/ml)的驱虫斑鸠菊黄
酮作用体外培养的人表皮黑素细胞,观察对黑素细胞的形态、酪氨酸酶活性、黑素含量的影响。免疫印迹法测定药物作用前后
MC酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)和酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)蛋白表达的变化。结果:≥90μg/ml驱虫斑鸠菊黄
酮可明显抑制 MC的增殖;试验浓度范围内可明显促进 MC黑素合成和酪氨酸酶活性增加,并以浓度依赖方式促进 TRP-1的蛋
白表达,但对TYR、TRP-2的表达没有影响。结论:驱虫斑鸠菊黄酮在体外能直接刺激表皮 MC黑素合成,上述变化可能通过促
进TRP-1的蛋白表达和TYR的翻译后修饰作用来完成。
[关键词]驱虫斑鸠菊黄酮;表皮黑素细胞;黑素合成;免疫印迹
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2008)04-03
Theefectofvernoniaanthelminticaflavoneonmelanogenesisofhumanmelanocytesinvitro
MAHui-jun1,ZIShao-xia2,LIYou1,LIUWen1,WANGYi-xia1,ZHAOGuang1
(1.DepartmentofDermatology,theAirforceGeneralHospitalofChinesePLA,Beijing100036,China;2.Departmentof
Dermatologyandvenerology,XuanwuHospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100053)
Abstract: Objective Toinvestigatetheefectofvernoniaanthelminticaflavone (VAF)onmelanogenesisand
tyrosinaseactivityofhumanepidermalmelanocytes,andinitialydiscusstheirrelatedmechanism.Methods Cel
proliferationwasobservedbyMTTmethod.ThreediferentconcentrationsofVAFwereincubated withhuman
melanocytesfor72handthenmelanincontent,tyrosinaseactivitywererespectivelymeasured.Theproteinexpressionof
melanogenesiskeyenzymeswasinvestigatedbywesternblot.Results Theproliferationofmelanocyteswasmost
inhibitedbyVAFathighdose (≥100μg/ml).Intherangeofexperimentaldose,VAFincreasedtheactivityofthe
tyrosinaseand melanincontentsignificantlyinadose-dependentmanner.TheincreasingproteinexpressionofTRP1
wasalsoobservedinadose-dependentmanner.NoefectwasobservedonproteinexpressionofTYRandTRP2.
Conclusion VAFmaystimulatemelanogenesisdirectlyonhumanepidermalmelanocytes,whichmaybeinducedby
increasingexpressionofTPR1andpost-translationalmodificationofTYR.
Keywords:vernoniaanthelminticaflavone;melanocyte;melanogenesis;westernbloting
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DOI:10.15909/j.cnki.cn61-1347/r.2008.04.007
中国美容医学2008年4月第17卷第4期 ChineseJournalofAestheticMedicine.Apr.2008.Vol.17.No.4
基
础
研
究
组织后剪成 1cm×1cm的小片，0.25%分离酶 4℃放置 12～
16h，眼科镊轻轻分离表真皮，用0.25%的胰酶37℃消化表皮
5～10min，用含5%胎牛血清、100U/mL青霉素，100μg/mL链
霉素，0.05μg/mlCT，50nmol/LTPA的 MCDB153培养基于
37℃、5%CO2条件下常规培养，取传2代的纯化的表皮黑素细
胞 (经HMB45单抗免疫组化和fontana-masson染色证实)，
待生长至融合状态，以 0.25%胰酶和 0.02%乙二胺四乙酸
（EDTA）消化，台盼蓝染色法计数活细胞数，然后接种至25cm2
塑料培养瓶，接种浓度为105个细胞/cm2，液体量5mL/瓶。细
胞接种12h后，用含药物的新鲜培养液换液1次，继续孵育
72h后收获细胞，计数，将细胞用于酪氨酸酶活性和黑素含量
测定。
1.3实验分组：驱虫斑鸠菊黄酮贮液用DMEM配制成浓度为
30mg/ml的母液，-20℃保存 ，临用时用新鲜培养基调至终浓
度，其实验浓度为 3、10、30μg/ml，观察 24、72h时的指标变
化。α-促黑素（α-MSH）实验浓度为100nmol/L作为阳性对
照组；空白对照组仅加入相应溶媒，每一处理因素重复测定4
次。
1.4酪氨酸酶活性和黑素含量测定方法参照文献[1-2]。
1.5MTT法测定细胞增殖率：参考我们以前的文献[3]，细胞接
种至96孔培养板后，分别加入0.003、0.03、0.3、3、30、90、
150、300、600μg/ml9个浓度梯度的驱虫斑鸠菊黄酮各200μl，空
白对照组仅加入培养液和相应溶媒，结束时用酶标仪测定每
孔吸光度A490nm值，细胞增殖率＝药物处理组A490/空白
对照组A490×100%。
1.6免疫印迹法检测黑素合成关键酶的蛋白表达：分别取
0，3，30μg/ml驱虫斑鸠黄酮作用48h的细胞，收获细胞并计
数（细胞数大于106），按试剂盒说明裂解提取细胞总蛋白，将
相同数量的蛋白（约8μg）加入7.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶
30mA恒流进行电泳分离，转膜，3%BSA封闭液室温封闭，分别
以兔抗人的 TYR（1：500）、TRP1（1：500）、TRP2（1：500）多克隆
抗体，37℃孵育2h，0.02MPBST液洗涤PVDF膜2次，加入辣
根过氧化物酶结合的羊抗兔IgG（1：500稀释），37℃孵育20
min；DAB显色，观察条带，凝胶成像系统扫描处理。每一处理
因素重复测定3次。
1.7统计学分析：统计过程使用SPSS10.0统计软件完成，采
用非配对计量资料的t检验，数据均以x±s表示。
2 结果
2.1驱虫斑鸠菊黄酮对表皮黑素细胞形态的影响：传代培养
的表皮黑素细胞胞体小，呈树枝状生长，主要为多极，少数为
两极生长(图1A)。黑素细胞经30μg/ml驱虫斑鸠菊黄酮作
用72h后，细胞胞体增大，树突增多、延长。树突边缘可见较
多棕黑色颗粒(图1B)。
2.2不同浓度驱虫斑鸠菊黄酮对表皮黑素细胞增殖的影响：
高浓度驱虫斑鸠菊黄酮对细胞增殖有明显抑制作用，其作用
72h的IC30(30%的抑制浓度)，IC50(50%的抑制浓度)和IC70
（70%的抑制浓度）分别为30μg/ml、90μg/ml、150μg/ml(图2)。
图2不同浓度驱虫斑鸠菊黄酮对表皮黑素细胞增殖的影响
2.2不同浓度的斑鸠菊黄酮对黑素细胞酪氨酸酶活性和黑
素合成的影响：3种浓度均显示不同程度上调细胞酪氨酸酶
活性和黑素含量的作用，呈浓度依赖性增加，≥10μg/ml驱
虫斑鸠菊黄酮促黑素合成作用与α-MSH相当(表1)。
黑
素
细
胞
增
值
率
（
%）
驱虫斑鸠菊黄酮试验浓度（μg/ml）
3
10
30
100nmol/Lα-MSH
驱虫斑鸠菊黄酮浓度
（μg/ml）
表1驱虫斑鸠菊黄酮对表皮黑素细胞酪氨酸酶活性、黑素含量的影响(x±s,%)
空白对照组相应值设定为100%;与空白对照组相比,*P<0.05,**P<0.01
酪氨酸酶活性（n=4）
24h 72h
153.45±17.96* 178.57±12.67*
229.23±21.25** 257.35±14.89**
254.58±27.34** 275.98±32.47**
233.32±32.28** 247.25±21.66**
黑素含量（n=4）
24h 72h
213.56±19.45** 256.43±23.22**
312.46±25.79** 345.66±35.29**
356.16±32.15** 397.63±40.56**
337.45±28.73** 353.47±36.22**
图1A 倒置显微镜下可见未经
处理的表皮黑素细胞呈树枝状
生长,主要为多极,少数可见两
极生长(×200)
图1B 倒置显微镜下可见表皮
黑素细胞经30μg/ml驱虫斑鸠
菊黄酮作用72h后,树突增多、
延长、树突边缘可见较多棕黑
色颗粒(×200)
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中国美容医学2008年4月第17卷第4期 Chinese Journal ofAesthetic Medicine.Apr.2008.Vol.17.No.4
2.4驱虫斑鸠菊黄酮对黑素合成关键酶蛋白表达的影响：3
种浓度的驱虫斑鸠菊黄酮作用表皮黑素细胞48 h后，各组
细胞的TYR、TRP1、TRP2的蛋白表达情况（见表2、图3）。驱虫
斑鸠菊黄酮以浓度依赖方式促进TRP-1的蛋白表达，但对
TYR、TRP-2的表达没有影响。
图 3驱虫斑鸠菊黄酮处理黑素细胞 48h后黑素合成关键酶的表达
情况 Lane 1:未处理组;Lane 2:3μg/ml处理组;Lane 3:30μg/ml
处理组
3 讨论
驱虫斑鸠菊黄酮是从新疆药物驱虫斑鸠菊果实中提取
的一种黄酮类植物成分，临床已经被制成注射液（驱虫斑鸠
菊注射液）用于白癜风的治疗。既往的研究表明驱虫斑鸠菊
可体外直接促进酪氨酸酶活性、促进人A375黑素瘤细胞黑
素合成和酪氨酸酶mRNA的表达[4-5]，另外，驱虫斑鸠菊还具有
降低小鼠的免疫功能、抑制正常小鼠T、B细胞的增殖反应[6]。
表明驱虫斑鸠菊对白癜风的治疗作用可能通过两方面发挥
作用：一是抑制机体的免疫功能，降低自身黑素细胞的破坏；
二是在转录水平促进酪氨酸酶活性从而加速黑素合成。但上
述试验均选用的是鼠来源或人来源的黑素瘤细胞与正常人
表皮黑素细胞尚有一定的差距，为了进一步研究驱虫斑鸠菊
治疗白癜风的深层作用机制，为临床该药更好的开发和利用
提供实验依据。笔者应用不同浓度的驱虫斑鸠菊黄酮对纯化
培养的表皮黑素细胞进行了研究发现：30μg/mL 驱虫斑鸠菊
黄酮作用72h后，黑素细胞树突增多延长，树突边缘胞浆内
可见较多细小的棕黑色颗粒，提示驱虫斑鸠菊黄酮可诱导黑
素小体成熟化和向树突边缘转移。既往的电镜观察结果也证
实驱虫斑鸠菊体外能提高黑素细胞中Ⅲ、Ⅳ期黑素小体的比
例[7]。在试验浓度范围内（3～30μg/ml）驱虫斑鸠菊黄酮对体
外培养的表皮黑素细胞具有浓度依赖性促进酪氨酸酶活性
和黑素合成的作用，该作用在72 h达到高峰。这与以前的研
究结果[4-5]基本一致。≥10μg/ml 驱虫斑鸠菊黄酮促黑素合
成作用与100nmol/Lα-MSH 相当。上述结果提示该药能很好
的促进黑素细胞成熟、黑素合成活跃，延长的树突以及树突
边缘聚集的黑素颗粒则有利于黑素小体向周围的角质形成
细胞进行广泛传递。驱虫斑鸠黄酮具有明显的细胞抑制作
用，MTT 法检测细胞增殖率实验显示：低浓度（0.003～3
μg/ml）驱虫斑鸠菊黄酮对细胞增殖无明显影响，而高浓度
(＞90μg/ml) 则有明显的细胞抑制作用。其 IC50 为 90
μg/ml。说明在临床应用于应注意调整驱虫斑鸠菊的量，避免
高浓度形成的药物毒性作用。
酪氨酸酶是黑素合成过程中的主要限速酶，TRP1 和
TRP2同属于酪氨酸酶基因超家族成员，二者催化黑素生化合
成过程中的后续步骤，在黑素细胞内它们与酪氨酸酶一起以
多酶复合体形式存在，并对该复合体起稳定作用。TRP1作用
与TYR相似，但催化活性较弱。研究发现TRP1mRNA只在含有
优黑素的细胞中出现，表明TRP1在优黑素生成过程中具有
重要作用[8]。免疫印迹法检测驱虫斑鸠菊黄酮作用后的表皮
黑素细胞TYR、TRP1、TRP2的蛋白表达，仅发现TRP-1的表达
量较空白对照高（P＜0.05）且呈浓度依赖性增加，而 TYR、
TRP-2的表达量与空白对照组无差异（P＞0.05）。提示驱虫
斑鸠菊黄酮的促表皮黑素细胞黑素合成的作用可能通过上
调TRP1的表达、增强TYR翻译后修饰来发挥作用，TRP2在此
的作用似乎不太明显。由于TRP1主要与优黑素的生成密切
相关，我们推测驱虫斑鸠菊黄酮可能主要通过促进黑素细胞
中优黑素的合成而发挥其有效的促进黑素合成的作用。
[参考文献]
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[收稿日期]2007-08-12 [修回日期]2008-03-24
编辑/张惠娟
与空白对照组相比*P< 0.05,**P< 0.01
表2驱虫斑鸠黄酮对黑素细胞内TYR、TRP1、TRP2蛋白表达的影响
驱虫斑鸠菊黄酮浓度
（μg/ml）
0
3
30
0.464±0.006
0.479±0.015
0.468±0.012
0.423±0.017
0.836±0.013*
1.537±0.031**
0.312±0.007
0.307±0.010
0. 21±0.014
TYR表达 TRP1表达 TRP2表达
1 2 3
66KD
66KD
66KD
66KD
TRP2
TRP1
TYR
actin
526