全 文 ：第 21 卷 第 5 期
2014 年 10 月
琼州学院学报
Journal of Qiongzhou University
Vol． 21 No． 5
Oct． 2014
收稿日期:2014 － 09 － 15
基金项目:国家自然科学基金(21262026);海南省自然科学基金项目(314088);琼州学院青年教师科研基金项目
(QYQN201430)
作者简介:徐小雄(1982 －)，男，广西岑溪人，琼州学院理工学院讲师，硕士，研究方向为微生物学．
吊罗山阿宽蕉根际土壤放线菌的分离与初步鉴定
徐小雄1，2，雷鸣1，邵贵银1，徐云升1
(1．琼州学院 理工学院，海南 三亚 572022;2．琼州学院 三亚热带植物分子育种重点实验室，海南 三亚 572022)
摘要:从吊罗山野生阿宽蕉居群采集根际土壤，选择性分离放线菌，并进行初步鉴定． 采用葡萄糖天门冬酸培养基
(GA)和腐植酸(HV)培养基分离，均添加了终浓度为 50 mg /L放线菌酮、制霉菌素和重铬酸钾，以及 0． 5 mg /L 复合维生素．
共分离获得 45 株放线菌．对其中的 19 株菌株进行 16S rＲNA基因序列分析，结果显示包括小单胞菌 7 株，野野村菌 4 株，链
霉菌 2 株，疣孢菌 4 株，假诺卡氏菌 1 株，拟诺卡氏菌 1 株．
关键词:吊罗山;阿宽蕉根际土壤;放线菌;分离;鉴定
中国分类号:S668． 4 文献标志码:A 文章编号:1008 － 6722(2014)05 － 0058 － 06
DOI:10． 13307 / j． issn． 1008 － 6722． 2014． 05． 12
0 引言
放线菌是一类丝状、高 G + C 含量的革兰氏阳性细菌，属于细菌域放线菌门(Actinobactria) ，目前有
240 多个属和 3000 多个种［1］．放线菌分布广泛，种类繁多，代谢功能多样，能产抗生素、免疫抑制剂、抗肿
瘤药物和酶制剂，是一类具有广泛实际用途和巨大经济价值的微生物类群［2］．目前已发现的 2 万多种微生
物来源生物活性物质，有 45%以上是由放线菌产生的［3］;至今发现的近万种天然抗生素中，约有 2 /3 是由
放线菌产生的．放线菌活细胞制剂具有无毒、无残留，不伤害非靶标微生物，与环境兼容性好，防病持效期
长等优点，因而在植物生物防治上有着非常好的发展潜力［4］．
海南位于热带、亚热带地区，具有丰富的野生蕉资源．阿宽蕉(Musa itinerans Cheesman)由 Cheesman 于
1949 年命名，在东南亚大陆广泛分布，在中国、越南、泰国、老挝、缅甸和印度均有分布［5］．阿宽蕉是我国分
布最广的野生蕉，在海南的热带雨林地区分布广泛．阿宽蕉克隆生长势强，容易形成单种群优势群落，这种
单种群优势群落能够影响和改变该地区植物群落的组成、结构和演替方向，是海南热带雨林一种独特的先
锋植物［6］．阿宽蕉是目前在海南发现的唯一野生蕉［7］．
吊罗山是海南著名的四大天然热带雨林区之一，具有丰富的热带生物资源．雷湘兰［8］等通过对 7 处热
带不同生境土壤样品中的稀有放线菌进行研究，发现吊罗山原始森林的土壤中稀有放线菌多样性丰富，并
从吊罗山原始森林共分离到 6 个不同属的稀有放线菌，分别为链轮丝菌属、游动放线菌属、诺卡氏菌属、马
杜拉放线菌属、链孢囊菌属和小单孢菌属．曾会才［9］等从海南吊罗山原始林区土壤样品分离得到 385 株放
线菌，并从中筛选出了 16 株对香蕉枯萎病菌具有拮抗活性的放线菌，其中菌株 DL － 28 和菌株 DL － 24 具
强抑菌活性．目前，关于吊罗山土壤放线菌资源的报道较少，为了挖掘这一生境的放线菌资源，本文采用较
为成熟有效的方法对吊罗山野生阿宽蕉根际土壤放线菌资源进行探索．
1 材料与方法
1． 1 土壤采集
土壤采自海南省陵水黎族自治县吊罗山保护区内(GPS:18°40． 398N，109°52． 772E) ，野生阿宽蕉居
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群根际土壤，从居群内采集 5 株间距在 2 m 以上的野生阿宽蕉的根际土壤，混合而成．
1． 2 培养基
葡萄糖天门冬酸培养基(GA) :葡萄糖，2 g;天门冬酰氨，1 g;K2HPO4，0． 5 g;MgSO4·7H2O，0． 5 g;琼
脂，15 g;蒸馏水，1 L;pH:7． 2 － 7． 4．
腐殖酸培养基(HV) :腐植酸，1． 0 g;CaCO3，0． 02 g;Na2HPO4，0． 5 g;KCl，1． 7 g;FeSO4·7H2O，0． 01 g;
MgSO4·7H2O，0． 5 g;琼脂，15 g;蒸馏水，1 L;pH 7． 2 － 7． 4．
ISP2 培养基:酵母膏，4 g;麦芽浸提物，10 g;葡萄糖，4 g;琼脂，15 g;蒸馏水，1 L;pH7． 2 － 7． 4．
1． 3 预处理
土壤采集到实验室后，置阴凉处 5 d风干，研磨，待用．
称量 10 g样品，放到无菌干燥的三角瓶，密封后置于 120℃干热处理 60 min．然后往三角瓶添加入 1 /4
林格溶液 90 mL，得到稀释度为 10 －1涂布液，置超声波处理 30 min，期间不时用手轻微震荡三角瓶．从三角
瓶中取出 1 mL 上层液加入到 9 mL 的 1 /4 林格溶液，得到稀释度为 10 －2的稀释液． 以此类推，分别得到
10 －3、10 －4的稀释液．
1． 4 分离和纯化
稀释平板涂布法，分别吸取 10 －1、10 －2、10 －3、10 －4稀释液 100 μl 涂布于 GA 和 HV 培养基，每个浓度
设置三个平行．两种选择性分离培养基中均添加复合维生素(0． 5 mg /L)、放线菌酮(50 mg /L)、制霉菌素
(50 mg /L)和重铬酸钾(50 mg /L)．涂布后的培养基置于 28℃培养箱中培养 14 d 后观察，并记录结果，挑
菌．分离得到的菌株采用 ISP 2 培养基进行纯化，保藏．
1． 5 16S rＲNA基因序列分析
根据菌株在 ISP2 培养基上的形态特征，对分离得到的放线菌进行分群，选取代表菌株进行分析．
1． 5． 1 DNA模板的制备
从培养皿中上直接挑取单菌落菌体，放到裂解管中．裂解管事先装好石英砂，并灭菌，烘干．往裂解管
加入 500 μL的无菌 TE 缓冲液(Tris － EDTA Buffer)． 将裂解管置于 DNA 快速提取仪 Fastprep 中，振荡
1 min，速度设置为 6． 0．往裂解管添加入 500 μL氯仿:异戊醇(24:1)，震荡 10s，静置 10 min，12，000 rpm
离心 2 min，取上清液用 0． 8%的琼脂糖凝胶电泳检测．如果电泳结果显示有较好的基因组 DNA条带，即可
用作 PCＲ模板，于 － 20℃保存．
1． 5． 2 PCＲ扩增
采用 27F(5’－ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3’)和 1492Ｒ(5’－ GGTTACCTTGTTACGACTT － 3’)为
引物对菌株的 16S rＲNA基因进行 PCＲ扩增．反应条件参数:95℃预变性 5 min ;94℃变性 1 min，56℃退火
1 min;72℃延伸 90 s，30 个循环后 72℃延伸 10 min． PCＲ产物用 0． 8% 的琼脂糖凝胶电泳进行检，检测扩
增成功后，PCＲ产物直接送测序公司．
1． 5． 3 序列分析
将所测 16S rＲNA基因序列在 Eztaxon(www． ezbiocloud． net)中进行比对［10］，查找相同或相似的模式
菌株(Type strain)的 16S rＲNA 基因序列，然后采用 Clustal X 进行多序列比对，并利用邻接法构建聚类分
析图，主要软件包括 MEGA6． 0，BIOEDIT 7． 0，初步确定菌株分类归属，推断菌株的系统发育分类地位．
2 结果与分析
2． 1 分离结果
从海南陵水吊罗山野生阿宽蕉根际土壤中共分离得到 45 株放线菌．通过其在 ISP2 培养基上的观察，
初步判断其中 18 株为链霉菌，27 株为稀有放线菌．选择其中的 19 株疑似稀有放线菌进行 16S rＲNA 基因
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序列测序．
2． 2 16S rＲNA基因序列分析
将 19 株疑似稀有放线菌的 16S rＲNA基因序列在 Eztaxon 数据库中进行比对，然后进行聚类分析．初
步判断 19 株菌株归属于 6 个属，其中小单胞菌属 7 株，野野村菌属 4 株，链霉菌属 2 株，疣孢菌属 4 株，假
诺卡氏菌属 1 株，拟诺卡氏菌属 1 株(见图 1)．其中，7 株小单胞菌与已知标准株的 16S rＲNA最高相似率
分别是:X2742 与 M． chersina DSM 44151T 为 99． 13%;X2736 与 M． chaiyaphumensis MC5 － 1T 为 99． 0%;
X2731、X2745 和 X2773 与 M． chaiyaphumensis MC5 － 1T 分别为 98． 99%、99． 29%和 99． 07%;X2721 和
X2743 与 M． equine Y22T 均为 98． 91% ． 4 株野野村菌株与已知标准株的 16S rＲNA 最高相似率分别是:
X2715、X2718 和 X2750 与 Nonomuraea jabiensis A4036T 分别为 98． 44%、98． 86%和 99． 00%;X2783 与 N．
Candida HMC10T 为 98． 70% ．
图 1 19 株放线菌的 16S rＲNA基因序列聚类分析图
Fig． 1 Phylogenetic tree of 16S rＲNA gene sequences of 19 actinobacteria
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两株链霉菌株与已知标准株的 16S rＲNA 最高相似率是:X2704 与 Streptomyces yanii NBＲC 14669T 为
99． 93%;X2740 与 S． wuyuanensis FX61TT 为 99． 50% ．疣孢菌属中 4 株菌株 X2733、X2737、X2738 和 X2785
均与 Verrucosispora gifhornensis DSM 44337T 的 16S rＲNA相似率最高，分别是:98． 97%、99． 11%、99． 04%和
99． 11% ．假诺卡氏菌 X2741 与 Pseudonocardia alaniniphila YIM 16303T 的 16S rＲNA相似率为最高，为 99．
02% ．拟诺卡氏菌 X2766 与已知菌株 Nocardiopsis lucentensis DSM 44048T 的 16S rＲNA 相似率最高，为
98． 80% ．
2． 3 菌株 X2733 的 16S rＲNA基因序列分析
通过对 16S rＲNA基因序列分析，结合聚类树分析(图 1) ，可见菌株 X2733、X2737、X2738 和 X2785 聚
成一簇，其序列相似度很高，且形态相近，故这 4 株应该是同一个种．利用 Bioedit 对 X2733 和其它已知疣
孢菌株进行 16S rＲNA基因序列相似率分析，结果见表 1．菌株 X2733 与已知种 V． gifhornensis的 16S rＲNA
基因序列相似率最高，为 98． 9% ．疣孢菌属的已知种中，V． gifhornensis与其它已知种的相似率介于 97． 0%
到 99． 5%，因此 X2733 与 V． gifhornensis 的 16S rＲNA 相似率为 98． 9%，有可能是疣孢菌属的一个潜在
新种．
表 1 菌株 X2733 与疣孢菌的 16S rＲNA基因序列相似率分析
Tab． 1 Analysis of similarity of 16S rＲNA gene sequence of X2733 and Verrucosispora type strains
2 3 4 5 6 7 8 X2733
1 V． andamanensis 99． 1% 99． 1% 98． 8% 98． 9% 97． 4% 99． 2% 99． 4% 98． 4%
2 V． fiedleri 99． 3% 98． 4% 99． 1% 97． 1% 98． 9% 99． 0% 98． 7%
3 V． gifhornensis 98． 3% 99． 5% 97． 0% 98． 9% 98． 9% 98． 9%
4 V． lutea 98． 1% 97． 5% 98． 6% 98． 7% 97． 6%
5 V． maris 96． 9% 98． 7% 98． 7% 98． 7%
6 V． qiuiae 97． 4% 97． 6% 97． 8%
7 V． sediminis 99． 2% 98． 2%
8 V． wenchangensis 98． 3%
3 讨论
3． 1 阿宽蕉根际土壤放线菌资源多样性
为了对吊罗山野生阿宽蕉根际土壤中的放线菌资源进行初步探索和发掘，本文所采用的分离方法相
对单一，且采用了 120℃干热 60 min的预处理方法，出菌率必然受到一定的影响，只能从一个侧面来反映
这个生境的可培养放线菌资源，但从目前的结果来看，分离得到放线菌的多样性较好，从某种程度说明这
个生境的放线菌资源值得进一步研究．这个结果与雷湘兰［8］等的结果基本一致，后者采用了多种处理方法
和多种培养基．目前，已经初步确定 19 株菌里面包含了 5 个稀有放线菌属，分别是小单胞菌属、野野村菌
属、疣孢菌属、假诺卡氏菌属和拟诺卡氏菌属．雷湘兰［8］等从吊罗山的土壤分离获得 6 个属是链轮丝菌属、
游动放线菌属、诺卡氏菌属、马杜拉放线菌属、链孢囊菌属和小单孢菌属．本研究结果与之相较，重叠性较
少本文分离获得 4 个属是其未分离到的．今后，设计更多的预处理方法和采用更多的选择性分离培养基对
这一样品的进行放线菌分离，结合微生物分子生态学的方法，更全面、更深层次的评价这个生境的放线菌
资源．阿宽蕉作为海南热带雨林中的先锋植物，在热带雨林生态系统中作用特殊，我们将继续研究海南岛
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内其它的地方的阿宽蕉居群根际土壤的放线菌，形成对海南野生阿宽蕉根际土壤的放线菌资源的评价．
3． 2 阿宽蕉根际土壤放线菌在香蕉枯萎病防治上的应用
放线菌能产生多种活性物质，在土传性植物病害生物防治上很有优势，如芬兰的 Kemira 从泥煤中分
离到的灰绿链霉菌(Streptomyces griseovidis) ，用其孢子和菌丝制成的放线菌的活体制剂 Mycostop［11］，成功
防治常见的一些土传病原菌，如腐霉菌(Pythium spp．)、镰刀菌(Fusarium spp．)、疫霉菌(Phytophthora
spp．)和丝核菌(Ｒhizoctonia spp．)等，这是利用抗生菌防治土传病害的一个成功案例．香蕉枯萎病是由尖孢
镰刀菌(Fusarium oxysporum f． sp． Cubense)侵染而引起的毁灭性土传真菌病害，该病会导致香蕉茎叶萎蔫
垂全部枯死，是世界上危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物土传病害之一，然而其发病机理至今未
明确．目前，针对香蕉枯萎病防治方法很多，包括化学防治、抗病育种生物防治以及采取适当农业措施等，
生物防治是目前公认比较安全和有效的防治措施［12］．曾会才［9］等从吊罗山土壤分离得到 2 株对香蕉枯萎
病菌具有强拮抗活性的放线菌．本课题组将进一步对分离获得的菌株进行抗菌活性筛选．我们采集的土壤
样品的来自生态系统稳定，长势良好的野生阿宽蕉菌群，分离得到的菌株将进行香蕉枯萎病菌活性筛选，
为其将进一步生物防治的应用提供依据．从生物适应性来考虑，均来自野生香蕉根际土的性菌株，可能会
更容易与栽培香蕉产生互作效应．
3． 3 阿宽蕉根际土壤放线菌的纤维素酶发掘
放线菌产生的纤维素酶活力较高，具有很好的耐热性．放线菌结构简单，为单细胞微生物，便于遗传分
析和改造［13］，目前可应用基因组分析技术从分子遗传水平对产酶代谢进行调控［14］． 与其它微生物相比，
放线菌更加具备成为产纤维素酶工业化模式菌株的特征［15］．在野生阿宽蕉居群中，茎干枯萎凋亡后只能
依赖自然环境自然降解，阿宽蕉的茎干具有丰富纤维素．推测在野生阿宽蕉居群的根际土壤的微生物中可
能存在丰富的纤维素酶系，并且该酶系对香蕉茎干的降解可能具有较强的专一性和较高的酶活性．本课题
组将会对分离菌株进行纤维素酶活性筛选，以期在香蕉栽培产业中废弃茎干资源再利用中发挥作用．
致谢，感谢武汉大学药学院洪葵教授及其实验室成员在本文实验过程中给与的帮助和支持．
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Isolation and Primary Identification of Actinobacteria from
Ｒhizosphere Soil of Musa itinerans in Diaoluo Mountain
XU Xiao － xiong1，2，LEI Min1，SHAO Gui － yin1，XU Yun － sheng1
(1． School of science and technology，Qiongzhou University，Sanya Hainan，572022，China
2． Key Laboratory of Tropical Crop Molecular Breeding of Sanya，Qiongzhou University，Sanya Hainan，572022，China)
Abstract:In order to isolate actinobacteria from rhizosphere soil of wild M． itinerans Cheesman，soil sample
were collected in Diaoluo Mountain，Hainan，China． GA and HV media were employed as the isolation media
that supplemented with 50 mg /L cycloheximide，50 mg /L nystatin，50 mg /L K2Cr2O7 and 0． 5 mg /L multi －
vitamin． Forty － five actinobacteria were isolated according to their morphological characteristics． Nineteen
isolates were putatively identified to genus level based on 16S rＲNA gene sequence analysis，which belong to
Micromonospora (7)，Nonomuraea (4) ，Streptomyces (2) ，Verrucosispora (4) ，Pseudonocardia (1)and
Nocardiopsis (1)．
Keywords:Diaoluo Mountain;rhizosphere soil of M． itinerans;actinobacteria;isolation;identification
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