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利用未成熟种子建立野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系和植株再生的研究



全 文 :收稿日期:2005-07-04 接受日期:2005-10-31
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(701126和031995)。
作者简介:魏岳荣,男,博士。Tel:020-38765640,E-mail:weid18@163.com
利用未成熟种子建立野生阿宽蕉胚性
细胞悬浮系和植株再生的研究
魏岳荣 1,2,黄学林 2,黄秉智 1,杨 护 1,邱继水 1,许林兵 1
(1广东省农业科学院果树研究所,广州 510640;2中山大学生命科学院教育部基因过程重点实验室,广州 510275)
摘 要:以纵切的野生阿宽蕉 60d龄未成熟种子为外植体,在 MI1愈伤组织诱导培养基(MS大量和微量元素及铁
盐+MorelandWetmore维生素+0.1mmol/LKH2PO4+87mmol/L蔗糖+4.5μmol/L2,4-D+1g/LGelrite)中培养 60d后
开始出现浅黄色松散的胚性愈伤组织,150d后愈伤组织诱导率为 (15.11±1.95)%。该类愈伤组织被转移到含 18
μmol/L2,4-D的MI2培养基中继代60d后,可获得状态均一的理想的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织悬浮培养后,通
过2个月的筛选和继代培养,可得到均质的胚性细胞悬浮系。理想的胚性愈伤组织在体细胞胚诱导培养基中培养
10d后可见到白色半透明体细胞胚的发生,体细胞胚诱导率为7.70×105个/gFW。成熟体细胞胚的萌发率为(33.33±
3.37)%,植株再生率为(20.83±1.68)%。
关键词:阿宽蕉;胚性愈伤组织;胚性细胞悬浮系;体细胞胚;植株再生
中图分类号:S668.1 文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2006)01-41-05
EstablishmentofembryogeniccelsuspensionsandregenerationofMusa
itineransfromimmatureseeds
WEIYue-rong1,2,HUANGXue-lin2,HUANGBing-zhi1,YANGHu1,QIUJi-shui1,XULin-bing1
(1FruitResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou,Guangdong510640China;2TheKeyLaboratoryof
GeneEngineeringofMinistryofEducation,SchoolofLifeSciences,ZhongshanUniversity,Guangzhou,Guangdong510275China)
Abstract:Establishmentofastableembryogeniccelsuspension(ECS)isaprerequisiteforthebiotechnologicalbreeding
methods.Inthisstudyasystemforembryogeniccelsuspensionwasestablishedfrom60daysoldimmatureseedsofMusa
itineransCheesm,animportantwildgermplasminChina.Afterculturefor60daysoncalusinductionmedium,whichcon-
sistedofMSsaltsandMorelandWetmorevitaminssupplementedwith4.5μmol/L2,4-dichlorophenoxyaceticacid(2,4-D),
0.1mmol/LKH2PO4,87mmol/Lsucrose,andsolidifiedwith1g/LGelrite,yelow,friableembryogeniccaliwereinduced
fromtheexplants,and(15.11±1.95)%ofexplantsinducedembryogeniccaliaftercultureof150days.Thiskindofembryo-
geniccaliweretransferedtocalussubculturemedium,contained18μmol/L2,4-D,toculturefor60days,andideal,
homogeneousembryogeniccaliwereobtained.Suspensioncultureswereinitiatedfromtheseembryogeniccaliinliquid
mediumsupplementedwith4.5μmol/L2,4-D.Afterselectionoftheculturesusingastainlesssteelmetalicstrainerwitha
154-μmporesizeat15-dayintervalsfor2months,homogeneousandyelowembryogeniccelsuspensions,composedof
singlecelsandsmalcelaggregates,wereestablished.Plantingofembryogeniccalusonsemi-solidmediumofsomatic
embryoinductionanddevelopment(MSD)resultedinapproximately7.70×105somaticembryos/gfreshweightembryogenic
cali.MSDcontainedSHmacronutrients,micro-nutrients,Fe-EDTAandMSvitaminssupplementedwith4.5μmol/Lbi-
otin,680μmol/Lglutamine,2mmol/Lproline,100mg/Lmaltextract,1.1μmol/LNAA,0.2μmol/Lzeatin,0.5μmol/L
kinetin,0.7μmol/LN6-(2-isopentenyl)adenine,29mmol/Llactose,130mmol/Lsucroseandsolidifiedwith2g/Lgelrite.
After2monthsofmaturityonMSD, (33.33±3.37)%ofsomaticembryoswereobservedtogerminateongerminationmedia
(MG),consistedofMSsalt,MorelandWetmorevitamins,0.2μmol/L6-BA,1.1μmol/LIAA,87μmol/Lsucroseandso-
lidifiedwith2g/Lgelrite,and(20.83±1.68)%ofsomaticembryoscoulddevelopintonormalplantletsonrootingmediacon-
tainedthesamecompositionasthatofMGbutwithoutauxinandcytokinin.
KeyWords:MusaitineransCheesm;Embryogeniccalus;Embryogeniccelsuspension;Somaticembryo;Plantregeneration
果 树 学 报 2006,23(1):41-45
JournalofFruitScience
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2006.01.010
果 树 学 报 23卷
高产、优质同时具有高度抗性的优良新品种的
选育是香蕉产业持续发展的根本出路[1~3]。生物技术
手段是获得香蕉新品种的有效途径,而这些生物技
术的应用都有赖于高效的植株再生体系的建立,其
中胚性细胞悬浮系(embryogeniccelsuspension,ECS)
为最适合基因操作和后期性状筛选的再生体系[4]。
因此,尽管香蕉具有胚性反应低、ECS建立耗时长和
植株再生率不高等特点,但在过去的20多年里,国
内外学者通过不懈的努力,建立了少数品种的ECS,
并尝试应用于基因转化和原生质体培养的研究[4~11]。
野生蕉具有面对病虫害以及日益恶化的环境条
件的侵袭进行健康持续发展所必需的抗性基因,因
此野生蕉种质资源成为现代生物技术育种的宝藏。
本文报道了利用我国的野生阿宽蕉 (Musaitinerans
Cheesm.)未成熟种子的胚性潜力启动并建立其
ECS,通过体细胞胚发生途径获得再生植株的过程,
以期为野生蕉 ECS的建立及其在生物技术育种领
域的进一步应用提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料
野生阿宽蕉 (MusaitineransCheesm.)(因该材料
为新发掘,染色体组型待研究)取自位于广东省农业
科学院果树研究所的国家果树种质—广州香蕉圃。
1.2 方法
1.2.1 外植体的消毒灭菌 取抽蕾坐果后约 60d
的果实,果指长约6cm。先用自来水清洗果皮,晾干
后于 70%酒精表面消毒 5min,再用无菌水冲洗 2
次,备用。
1.2.2 愈伤组织的诱导与继代 在无菌条件下,用
尖嘴手术刀纵向切开果皮,完整分离种子(图版-1)
备用。将种子沿珠孔塞位置纵向切开,接种于愈伤组
织诱导(MI1)培养基中培养,以未切开种子为对照。
MI1组成为:MS大量和微量元素及铁盐[12]+Morel
andWetmore维生素[13]+0.1mmol/LKH2PO4+87mmol/
L蔗糖+4.5μmol/L2,4-D+1g/LGelrite。以上实验
中,每个培养瓶分装30mL培养基,每个培养瓶接种
8个外植体,8瓶为1个重复,共设3次重复。愈伤组
织的增殖培养分别在MI1和MI2培养基 〔MS基本
培养基[12]+18μmol/L2,4-D+4.1μmol/L生物素(biotin,
BIO)+5.7μmol/LIAA+5.4μmol/LNAA+100mg/L
麦芽提取物(ME)+680μmol/L谷氨酰胺+200mg/L水
解酪蛋白 (CH)+17.4μmol/L脯氨酸 +87mmol/L蔗
糖〕中进行,继代周期为21d。
1.2.3 胚性愈伤组织的鉴定 结合形态学和组织
细胞学的观察,确定并挑选松散易碎的浅黄色愈伤
组织为胚性愈伤组织。组织学研究采用石蜡切片
法[14]。
1.2.4 胚性愈伤组织的悬浮培养 参照魏岳荣等[10]
方法进行。取胚性愈伤组织约2g,加入到装有30mL
液体培养基(ML)的100mL锥形瓶中进行悬浮培养。
ML培养基组成为:MS基本培养基 [12]+4.5μmol/L
2,4-D+4.1μmol/LBIO+680μmol/L谷氨酰胺+100
mg/LME+130mmol/L蔗糖。
1.2.5 体细胞胚的诱导与成熟 挑取均质的胚性愈
伤组织诱导体细胞胚的发生,参照魏岳荣等[10]方法
进行。体细胞胚诱导培养基(MSD)的组成为:SH培
养基[15]中的大量元素和微量元素及其铁盐+MS维生
素[12]+4.5μmol/LBIO+680μmol/L谷氨酰胺+2mmol/
L脯氨酸+100mg/LME+1.1μmol/LNAA+0.2μmol/L
玉米素(Zeatin,ZT)+0.5μmol/L激动素(Kinetin,KT)
+0.7μmol/L2-ip+29mmol/L乳糖+130mmol/L蔗
糖+2g/LGelrite。定期观察体细胞胚的诱导情况,
60d后统计体细胞胚发生数量:测定培养物的总质
量,随机称取其中一定质量的样品后,在解剖镜下计
算样品中的体胚数量,从而获得单位质量培养物中
的体胚数和单位质量胚性愈伤组织所诱导获得的体
胚数。随后在同样的培养基中继续培养30d,以促进
体细胞胚的成熟。
1.2.6 体细胞胚的萌发与植株再生 参照魏岳荣
等[10]方法进行。取在MSD培养基中培养90d的成熟
体细胞胚,在萌发培养基(MG)中促进萌发,30d后
统计体细胞胚的萌发率。MG的组成为:MS大量元
素和微量元素及其铁盐[12]+MorelandWetmore维生
素[13]+0.2μmol/L6-BA+1.1μmol/LIAA+87mmol/L
蔗糖+2g/LGelrite。萌发后的体细胞胚被转移到MR
培养基 (不含任何植物生长调节剂的MG基本培养
基)中生根,进一步发育成为完整的小植株。体细胞
胚萌发率(%)=萌发的体胚数/总体胚数×100,植株
再生率(%)=再生植株数/总体胚数×100。
1.2.7 培养条件 所有培养基中,除ML培养基pH
值在灭菌前被调整为 5.3外,其余均为 5.8,然后在
121℃条件下灭菌15min。愈伤组织诱导与增殖、悬
浮培养、体细胞胚的诱导和成熟在 28±1℃、黑暗条
件下进行,体细胞胚的萌发和生根在 (28±1)℃、30
μmol/m2·s光强 (白色荧光灯),16h/8h光周期条件
下进行。胚性细胞悬浮培养保持在持续110r/min的
旋转摇床上进行。
42
1期
外植体种类
Explanttypes
外植体数
Amountofexplants
出胚性愈伤组织外植体数
Amountofexplantinduced
embryogeniccali
胚性愈伤组织诱导率
Inductionpercentageof
embryogeniccalus(%)
平均诱导率
Averageinduction
percentage(%)
纵切种子
Verticalcutingseed
未纵切种子
Noverticalcutingseed
64
64
64
64
64
11
10
8
2
2
17.19
15.63
12.50
3.13
3.13
15.11±1.95
2.61±0.74
表1 外植体种类和胚性愈伤组织诱导的关系
Table1Therelationofexplanttypesandinductionpercentageofembryogeniccalus
体胚数
Amountofsomatic
embryos
萌发体胚数
Amountofgerminated
somaticembryos
萌发率
Germination
percentage(%)
平均值
Average
(%)
再生植株数
Amountof
regenerableplants
植株再生率
Plantregeneration
percentage(%)
平均值
Average
(%)
56
56
56
20
20
16
35.71
35.71
28.57
33.33±3.37 11
13
11
19.64
23.21
19.64
20.83±1.68
表2 野生阿宽蕉体胚萌发率和植株再生率情况
Table2ThegerminationandplantregenerationpercentageofMusaitineranssomaticembryos
2 结果与分析
2.1愈伤组织的诱导与增殖
在愈伤组织诱导过程中,直接将整个种子置于
培养基中培养时,初期褐化较轻,但 10d后整个种
子全部褐化,而从中间切开的种子由于受到的机械
伤害使得外植体在接种5d内全部褐化。在接种初
期培养的45d内,外植体的大小都不会发生明显的
变化。60d后,被切开的种子褐化的种皮内部开始出
现浅黄色松散的愈伤组织,该类愈伤组织在原培养
基上生长的速度较慢。组织学切片表明,该类松散的
愈伤组织为胚性愈伤组织,其组成细胞大小均匀,呈
圆形,直径约 20~30μm,具有浓厚的细胞质和大核
仁(图版-4)。至150d时,纵切开的种子胚性愈伤组
织(图版-2)的诱导率为(15.11±1.95)%(表1)。相比
较而言,未纵切的完整种子的胚性愈伤组织的诱导
率则低的多,只有(2.61±0.74)%(表 1),其胚性愈伤
组织则是从种子的珠孔塞位置诱导出来的。因此,对
于尚且无法分离完整合子胚的未成熟种子而言,纵
切有利于胚性愈伤组织的分化。
在愈伤组织诱导培养基 MI1(含 4.5μmol/L
2,4-D)中继代时,由于 2,4-D浓度低,胚性愈伤组
织生长速度慢,且表现不均质,即由原胚、胚性愈伤
组织团、颗粒状愈伤组织和褐化组织等组成的混合
物。而转移到含有18μmol/L2,4-D的MI2培养基
中继代增殖时,愈伤组织增殖速度明显加快,且由均
一的易于分散的颗粒极其细小的浅黄色胚性愈伤组
织和少量白色原胚组成(图版-3),而未见到褐化组
织和结节状的瘤状愈伤组织,从而有利于悬浮培养。
2.2 ECS的建立
均质的、浅黄色松散的胚性愈伤组织被转移到
液体培养基后,在摇床的振荡(110r/min)下游离出
大量具有浓厚细胞质的胚性细胞,且未观察到褐化
现象。在连续继代中通过154μm孔径不锈钢筛网
的筛选,可逐渐剔除大的原胚和颗粒状愈伤组织团,
2个月后即能获得均质的由圆形、形态较小,具有浓
厚的黄色的细胞质和大核仁的胚性细胞团 (图版-6)
组成的ECS(图版-5)。
2.3 体细胞胚的诱导和成熟
取MI2中增殖的胚性愈伤组织转移到体细胞胚
诱导培养基进行体细胞胚的诱导。培养10d后即可
见到大量白色半透明圆球形体细胞胚的发生。30d
后球形胚直径增大至1mm左右(图版-7)。45d后,
部分球形胚发育成形同合子胚的体细胞胚 (图版-
8、9)。由于体胚发育的不完全同步,此时已有部分体
胚开始抽生出白色的根,但部分体胚仍然处于球形
胚阶段。60d后部分体胚发育为直径约1.5~2.0mm
的成熟体胚(图版-10)。统计表明,每g鲜重胚性愈
伤组织可诱导产生7.70×105个体胚。
2.4 体细胞胚的萌发与植株再生
将成熟体胚转移到光照条件下的MG培养基培
养7d后,体胚的茎端开始转绿,但也有部分成熟体
胚开始生根。30d后,约有(33.33±3.37)%(表 2)的
体胚能萌发(图版-11)。将在MG培养基中培养30d
的萌发体胚转移到MG生根培养基培养,5~7d后萌
发体胚开始生根,30d后 62.5%的萌发体胚能转化
为健康小植株(图版-12),即植株再生率为(20.83±
1.68)%(表2),其余大多重新愈伤化或褐化死亡。在
魏岳荣等:利用未成熟种子建立野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系和植株再生的研究 43
果 树 学 报 23卷
体细胞胚萌发的过程中,我们观察到同时存在2种
萌发现象:1个体胚萌发成为单一的小植株,或萌发
出2~4株的丛生状小植株。这些丛生的小植株都具
有独立的根系,分离后能独立存活。
3 讨 论
通过 4.5μmol/L外源生长素类物质 2,4-D的
诱导作用,野生阿宽蕉未成熟种子可以获得15.1%
的胚性愈伤组织诱导率。该类胚性愈伤组织呈浅黄
色的松散微小颗粒,很难黏结成团,适合于启动悬浮
培养,60d内能建立理想的ECS。与贡蕉等鲜食蕉品
种未成熟花序以及多芽体 Scalps诱导获得的胚性
愈伤组织相比[10,11],来源于未成熟种子的这种胚性
愈伤组织启动并建立 ECS所需的时间要短 30d以
上。本人认为其关键在于胚性愈伤组织的理想状态,
与从其它香蕉品种(包括二倍体和三倍体)合子胚和
未成熟花序[5~8]诱导获得的白色半透明松散的胚性
愈伤组织相比,野生阿宽蕉胚性愈伤组织在颜色、
形态和质地等特征上都有所不同。另据Escalant等[5]
报道,Musaacuminate×Musabalbisiana杂交的 45d
龄的合子胚胚性愈伤组织诱导率为32%,而25d龄
合子胚的诱导率只有16%。可见,合子胚胚性愈伤
组织的诱导率不但与品种基因型有关,还受合子胚
的年龄等因素的影响。该类胚性愈伤组织在含有细
胞分裂素的体细胞胚诱导培养基中培养60d后,每
g鲜重胚性愈伤组织可获得7.7×105个体细胞胚,但
只有33.3%的体胚萌发率和20.8%的体细胞胚可获
得完整植株,可能是体细胞胚发生发育的不同步或
萌发培养基中细胞分裂素类物质的浓度等因素导致
萌发时体细胞胚易于出现愈伤化或褐化造成的。因
此,关于利用未成熟种子建立野生蕉高效ECS的培
养体系及其进一步在育种中的有效利用还有待优化
研究。
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44
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魏岳荣等:利用未成熟种子建立野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系和植株再生的研究 45