全 文 ：麦类作物学报　２０１５，３５（９）：１２０２－１２０７
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ　 ｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－１０４１．２０１５．０９．０４
网络出版时间：２０１５－０９－０６
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３５９．Ｓ．２０１５０９０６．０９４４．００８．ｈｔｍｌ
粗山羊草新型硬度等位基因的克隆及分析
收稿日期：２０１５－０１－０９　　　修回日期：２０１５－０７－１３
基金项目：中国科学院重点部署项目（ＫＳＺＤ－ＥＷ－Ｚ－００２－００１－２）
第一作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｎｎｘｃｗｍ＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：郑明辉（Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｔｔｐ２００４１２９＠１６３．ｃｏｍ）
曹雯梅１，刘述忠１，张亚菲１，郑明辉２
（１．河南农业职业学院，河南郑州４５１４５０；２．河南大学生命科学学院，河南开封４７５０００）
摘　要：小麦籽粒硬度是其最为重要的品质性状之一，现已发现控制小麦籽粒硬度的主效基因是Ｐｉｎａ
和Ｐｉｎｂ。为了丰富籽粒硬度新型等位基因，根据已报道的小麦Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ基因的保守序列，设计了２对特
异性引物，对粗山羊草（Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉｉ）进行Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ基因的ＰＣＲ扩增、克隆及序列分析。结果表明，
本研究共得到２个新型Ｐｉｎａ等位基因和３个新型Ｐｉｎｂ等位基因，核酸序列长度均为４４７ｂｐ，编码１４８个氨
基酸残基，具有麦类作物ＰＩＮＡ和ＰＩＮＢ蛋白所特有的色氨酸结构域：ＷＲＷＷＫＷＷＫ和 ＷＰＴＫＷＷＫ。与
已知的Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ基因序列相比较，这些基因含有多个ＳＮＰ变异位点，丰富了小麦籽粒硬度改良的遗传资源。
关键词：籽粒硬度；粗山羊草；等位基因；基因克隆；序列分析
中图分类号：Ｓ５１９；Ｓ３３０　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００９－１０４１（２０１５）０９－１２０２－０６
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｏｖｅｌ
Ｐｕｒｏｉｎｄｏｌｉｎｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍＡｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉ
ＣＡＯ　Ｗｅｎｍｅｉ，ＬＩＵ　Ｓｈｕｚｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ　Ｙａｆｅｉ，ＺＨＥＮＧ　Ｍｉｎｇｈｕｉ
（１．Ｈｅｎａｎ　Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，Ｈｅｎａｎ　４５１４５０，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋａｉｆｅｎｇ，Ｈｅｎａｎ　４７５０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｇｒａｉｎ　ｈａｒｄｎｅｓｓ　ｉｓ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ．Ｉｔ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ
ｍａｊｏｒ　ｇｅｎｅｓ　ｃｏｎｔｒｏｌｉｎｇ　ｇｒａｉｎ　ｈａｒｄｎｅｓｓ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ　ｗｅｒｅ　Ｐｉｎａａｎｄ　Ｐｉｎｂ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｒｅ－
ｇｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐｉｎａａｎｄ　Ｐｉｎｂ　ｇｅｎｅｓ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ，ｔｗｏ　ｐａｉｒｓ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｕｓｅｄ
ｔｏ　ａｍｐｌｉｆｙ　ｉｎ　ｗｈｅａｔ　Ｄ－ｇｅｎｏｍｅ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ，Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉｉ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｗｏ　ｎｏｖｅｌ　Ｐｉｎａ
ａｌｅｌｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｒｅｅ　Ｐｉｎｂａｌｅｌｅｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ａｌ　ｏｆ　ｔｗｏ　Ｐｉｎａｇｅｎｅｓ　ａｎｄ
ｔｈｒｅｅ　Ｐｉｎｂ　ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　４４７ｂｐ　ｉｎ　ｓｉｚｅ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ　１４８ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｍｏｔｉｆ
ｏｆ　ＷＲＷＷＫＷＷＫ　ａｎｄ　ＷＰＴＫＷＷＫ，ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｏ　ＰＩＮＡ　ａｎｄ　ＰＩＮＢ　ｉｎ　ｃｅｒｅａｌ　ｃｒｏｐ．Ｃｏｍ－
ｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｅｐｏｒｔｅｄ　Ｐｉｎａ　ａｎｄ　Ｐｉｎｂ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｓｏｍｅ　ＳＮＰｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｉｎａ　ａｎｄ
Ｐｉｎｂ　ａｌｅｌｅｓ　ｏｆ　Ａｅ．ｔａｕｓｃｈｉｉ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｅｎｒｉｃｈｅｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｆｏｒ　ｋｅｒｎｅｌ　ｈａｒｄｎｅｓｓ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ
ｗｈｅａｔ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｋｅｒｎｅｌ　ｈａｒｄｎｅｓｓ；Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉｉ；Ｐｕｒｏｉｎｄｏｌｉｎｅ　ａｌｅｌｅｓ；Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙ－
ｓｉｓ
　　籽粒硬度是普通小麦重要的品质性状之一，
对小麦的磨粉品质和烘烤品质具有重要的影响。
ＰＵＲＯＩＮＤＯＬＩＮＥ蛋白是形成小麦籽粒硬度的
物质基础［１］，主要由ＰＩＮＡ和ＰＩＮＢ两种组分组
成，编码这两种组分的１对主效基因 Ｐｉｎａ 和
Ｐｉｎｂ位于５Ｄ 染色体短臂上［２－３］。普通小麦中
Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ基因具有高度的同源性，均不含内
含子，编码区长度为４４７ｂｐ，经转录翻译可生成
含１４８个氨基酸且具有较高亲和力的碱性亲水脂
膜蛋白，其突出特征是具有一个富含色氨酸的类
脂结合区域。通过该结构域与淀粉表面结合，可
以改变籽粒质地的结构，从而影响籽粒硬度［４］。
现已发现Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ基因存在多个等位变异，
不同类型的等位变异对籽粒硬度具有不同影响，
特别是色氨酸结构域序列的改变，可以引起籽粒
硬度发生显著的变化［５］。粗山羊草是与小麦遗传
关系最近的近缘种，是普通小麦Ｄ基因组的供体
种，但与普通小麦相比，其变异类型更为丰富［６－８］。
已有研究［９－１０］表明，普通小麦中Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ基
因发生单核苷酸突变或Ｐｉｎａ基因缺失均可造成
小麦胚乳质地变硬［４，１１］，而在粗山羊草中Ｐｉｎａ
和Ｐｉｎｂ基因的多个位点发生单核苷酸的替换或
缺失，其胚乳质地仍表现为软质［１２－１３］。我国黄河
流域的陕西、河南等地和新疆伊犁河谷均有自然
分布的粗山羊草，但对其进行系统收集并深入研
究的较少。本研究利用特异的硬度基因引物对收
集到的新疆及黄河流域的粗山羊草进行Ｐｉｎａ和
Ｐｉｎｂ基因的克隆及序列分析，以期寻找和丰富籽
粒硬度新型等位基因，进一步扩充小麦属硬度基
因资源库，为普通小麦品质的遗传改良奠定基础。
１　 材料与方法
１．１　材 料
供试材料为采自黄河中游地区及新疆地区的
３５份粗山羊草（表１），由河南大学植物种植资源
与遗传工程实验室提供。
表１　３５份粗山羊草的来源
Ｔａｂｌｅ　１　Ｏｒｉｇｉｎｓ　ｏｆ　３５ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ａｅ．ｔａｕｓｃｈｉ　ｔｈａｔ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ
编号
Ｎｏ．
来源
Ｏｒｉｇｉｎ
编号
Ｎｏ．
来源
Ｏｒｉｇｉｎ
编号
Ｎｏ．
来源
Ｏｒｉｇｉｎ
编号
Ｎｏ．
来源
Ｏｒｉｇｉｎ
编号
Ｎｏ．
来源
Ｏｒｉｇｉｎ
Ｔ－２
河南灵宝
Ｌｉｎｇｂａｏ，Ｈｅｎａｎ Ｔ－５０
河南温县
Ｗｅｎｘｉａｎ，Ｈｅｎａｎ ＳＬ－３
陕西武功
Ｗｕｇｏｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ＸＪ－４
新疆巩留
Ｇｏｎｇｌｉｕ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ＸＪ－４１
新疆库车
Ｋｕｃｈｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ
Ｔ－５
河南三门峡
Ｓａｎｍｅｎｘｉａ，Ｈｅｎａｎ Ｔ－８２
河南封丘
Ｆｅｎｇｑｉｕ，Ｈｅｎａｎ ＳＣ－３
陕西武功
Ｗｕｇｏｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ＸＪ－６
新疆尼勒克
Ｎｉｌｅｋｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ＸＪ－５４
新疆喀什
Ｋａｓｈｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ
Ｔ－８
河南渑池
Ｍｉａｎｃｈｉ，Ｈｅｎａｎ Ｔ１－２
河南范县
Ｆａｎｘｉａｎ，Ｈｅｎａｎ ＳＸ－１１
陕西泾阳
Ｊｉｎｇｙａｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ＸＪ－７
新疆霍城
Ｈｕｏｃｈｅｎｇ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ＸＪ－５６
新疆喀什
Ｋａｓｈｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ
Ｔ－１４
河南卢氏
Ｌｕｓｈｉ，Ｈｅｎａｎ Ｔ１－９
河南台前
Ｔａｉｑｉａｎ，Ｈｅｎａｎ ＳＸ－２４
陕西泾阳
Ｊｉｎｇｙａｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ＸＪ－１７
新疆霍城
Ｈｕｏｃｈｅｎｇ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ＸＪ－６７
新疆和田
Ｈｅｔｉａｎ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ
Ｔ－２０
河南洛宁
Ｌｕｏｎｉｎｇ，Ｈｅｎａｎ Ｔ－１１６
河南兰考
Ｌａｎｋａｏ，Ｈｅｎａｎ ＳＸ－２６
陕西三原
Ｓａｎｙｕａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ ＸＪ－２２
新疆新源
Ｘｉｎｙｕａｎ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ＸＪ－９６
新疆新和
Ｘｉｎｈｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ
Ｔ－２６
河南济源
Ｊｉｙｕａｎ，Ｈｅｎａｎ Ｔ－１１７
河南兰考
Ｌａｎｋａｏ，Ｈｅｎａｎ ＳＸ－３１
陕西三原
Ｓａｎｙｕａｎ，Ｓｈａａｎｘｉ ＸＪ－２８
新疆新源
Ｘｉｎｙｕａｎ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ＸＪ－１０２
新疆新和
Ｘｉｎｈｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ
Ｔ－３３
河南武陟
Ｗｕｚｈｉ，Ｈｅｎａｎ ＳＬ－２
陕西武功
Ｗｕｇｏｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ＸＪ－１
新疆霍城
Ｈｕｏｃｈｅｎｇ，ＸｉｎｊｉａｎｇＸＪ－３９
新疆库车
Ｋｕｃｈｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ＸＪ－１０９
新疆奇台
Ｑｉｔａｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ
１．２　基因组ＤＮＡ的提取
取１ｇ粗山羊草幼嫩叶片（培养皿温室培养４
～５ｄ），液氮冷冻磨成细粉后参照Ｙａｎ等［１４］的方
法提取基因组总ＤＮＡ。
１．３　引物的设计
根据 已 报 道 的 小 麦 Ｐｉｎａ 和 Ｐｉｎｂ 基 因
（Ｇｅｎｅｂａｎｋ 登 录 号 分 别 为 ＫＣ５０９９９４ 和
ＡＢ２６２６６０）的保守序列，利用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０
软件设计２对引物 Ｐｉｎａ－Ｆ／Ｐｉｎａ－Ｒ（Ｐｉｎａ－Ｆ：５′－
ＡＴＧＡＡＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡ－３′；Ｐｉｎａ－Ｒ：５′－
ＴＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＧＣＣＡＡＴＡＧＴＧ－３′）和Ｐｉｎｂ－Ｆ／
Ｐｉｎｂ－Ｒ（Ｐｉｎｂ－Ｆ：５′－ＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＴＡＴＴＣＣＴ
ＣＣＴＡＧＣ－３′；Ｐｉｎｂ－Ｒ：５′－ＴＡＴＡＧＡＴＡＴＣＡＴＣ
ＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＧＣＣ－３′），并交由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公
司（北京）合成。
１．４　Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ基因的克隆
以１．２中得到的粗山羊草基因组ＤＮＡ为模
板，分别以 Ｐｉｎａ－Ｆ／Ｐｉｎａ－Ｒ 和 Ｐｉｎｂ－Ｆ／Ｐｉｎｂ－Ｒ 为
引物进行ＰＣＲ扩增。扩增体系及反应条件参照
陈明洁等［１５］的方法进行。同时，实验中采用了高
保真的ＬＡ　Ｔａｑ聚合酶（宝生物，大连），以避免错
配的核苷酸掺入。
ＰＣＲ扩增产物经１．５％琼脂糖凝胶电泳分离
后，切胶回收目的片段，与克隆载体连接后转化大
肠杆菌感受态细胞。挑取阳性克隆送六合华大基
因（北京）测序。
·３０２１·第９期 曹雯梅等：粗山羊草新型硬度等位基因的克隆及分析
１．５　序列分析
采用生物学软件Ｂｉｏｅｄｉｔ　７．０和 ＤＮＡＭＡＮ
进行序列比对分析。
２　结果与分析
２．１　Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ基因的克隆
对３５份粗山羊草Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ 基因进行
ＰＣＲ扩增后均得到大小约为４５０ｂｐ的特异性条
带（图１）。将获得的特异性条带切胶回收、克隆
和测序后，利用ＤＮＡＭＡＮ软件进行比对和拼接
得到长度均为４４７ｂｐ的序列。分别将其与已上
传到ＮＣＢＩ的所有Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ等位基因相比，
参试材料中，有２份材料（ＸＪ－１和ＳＬ－３）的Ｐｉｎａ
基因和３份材料（ＸＪ－４、ＸＪ－１０９和ＳＣ－３）的Ｐｉｎｂ
基因与已知硬度基因均不相同，应该属于新Ｐｉｎａ
和Ｐｉｎｂ基因。这５份材料Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ基因全
长均为４　４　７ｂｐ，具有麦类作物ＰＩＮＡ和ＰＩＮＢ蛋
白所特有的 ＷＲＷＷＫＷＷＫ和 ＷＰＴＫＷＷＫ色
氨酸结构域（图２、图３）。
　　１：１００ｂｐ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；２：ＸＪ－１；３：ＳＬ－３；４：ＸＪ－４；５：ＸＪ－１０９；
６：ＳＣ－３；２～３所用引物为Ｐｉｎａ－Ｆ／Ｐｉｎａ－Ｒ；４～６所用引物为Ｐｉｎｂ－
Ｆ／Ｐｉｎｂ－Ｒ
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｌａｎｅ　２～３ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｉｎａ－Ｆ／Ｐｉｎａ－
Ｒ；Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｌａｎｅ　４～６ｗｅｒｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｉｎｂ－Ｆ／Ｐｉｎｂ－Ｒ
图１　部分粗山羊草Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ基因扩增结果
Ｆｉｇ．１　Ｇｅｎｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｐｉｎａａｎｄ　Ｐｉｎｂ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｉｎ
ｐａｒｔｉａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｏｆ　Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉ
　　Ｐｉｎａ－ａｌｌｅ　１来源于材料ＸＪ－１；Ｐｉｎａ－ａｌｌｅ　２来源于材料ＳＬ－３；两箭头间表示色氨酸结构域
Ｐｉｎａ－ａｌｌｅ　１ａｎｄ　Ｐｉｎａ－ａｌｌｅ　２ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ＸＪ－１ａｎｄ　ＳＬ－３，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ－ｒｉｃｈ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｗｏ
ａｒｒｏｗｓ
图２　Ｐｉｎａ基因等位变异的核苷酸及推导的氨基酸序列比对
Ｆｉｇ．２　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｉｎａａｌｅｌｅｓ
·４０２１· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３５卷
２．２　序列分析
将本研究得到的５个新籽粒硬度基因与已报
道的野生型小麦Ｐｉｎａ－Ｄ１ａ和Ｐｉｎｂ－Ｄ１ａ基因序
列进行比对发现，这５个新基因均含有多个核苷
酸变异位点（图２、图３）。其中，材料 ＸＪ－１中的
Ｐｉｎａ基因核苷酸序列第１００、１２１和１４１位点分
别发生了Ｇ→Ｃ、Ｇ→Ｃ和Ａ→Ｔ的突变，与Ｇｅｎｅ－
ｂａｎｋ中已公布的Ｐｉｎａ－ａｌｌｅ　１基因核苷酸序列同
源性为９６．２％～９８．７％；材料ＳＬ－３中的Ｐｉｎａ基
因核苷酸序列第１２１、１４１、２５６、２６８和２８０位点分
别发生了Ｇ→Ｔ、Ａ→Ｔ、Ｃ→Ｇ、Ａ→Ｇ和Ｔ→Ｃ的
突变，与 Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已公布的Ｐｉｎａ－ａｌｌｅ　２基因
核苷酸序列同源性为９５．９％～９８．７％；材料ＸＪ－
１０９中的Ｐｉｎｂ基因核苷酸序列第９６、１３２和３７０
位点分别发生了Ｃ→Ｔ、Ｇ→Ａ和Ｃ→Ｔ的突变，
与Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已公布的Ｐｉｎｂ－ａｌｌｅ　１基因核苷酸
序列同源性为９６．６％～９９．３％；材料 ＸＪ－４中的
Ｐｉｎｂ基因核苷酸序列第１３２、１５９、２９１和３５０位
点分别发生了Ｇ→Ａ、Ｃ→Ｔ、Ｃ→Ａ和Ｇ→Ｃ的突
变，与 Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已公布的Ｐｉｎｂ－ａｌｌｅ　２基因核
苷酸序列同源性为９６．２％～９８．７％；材料ＳＣ－３
中的Ｐｉｎｂ基因核苷酸序列第９６、１３２和２５６位点
分别发生了 Ｃ→Ｔ、Ｇ→Ａ 和 Ｔ→Ａ 的突变，与
Ｇｅｎｅｂａｎｋ中已公布的Ｐｉｎｂ－ａｌｌｅ　３基因核苷酸同
源性范围为９６．４％～９８．９％。
进一步对其推导的氨基酸序列进行分析表
明，与野生型ＰＩＮＡ和ＰＩＮＢ蛋白相比，材料ＸＪ－１
中的ＰＩＮＡ蛋白氨基酸序列第３４和９４位点分别
发生了Ｇ→Ｒ和Ｃ→Ｒ的突变；材料ＳＬ－３中的
ＰＩＮＡ蛋白氨基酸序列第８６和９０位点分别发生
了Ｒ→Ｇ 和 Ｍ→Ｖ 的突变；材料 ＸＪ－１０９中的
ＰＩＮＢ蛋白第１２４位点发生了Ｌ→Ｆ的突变；材料
ＸＪ－４中的ＰＩＮＢ蛋白第１１７位点发生了Ｒ→Ｐ的
突变；材料ＳＣ－３中的ＰＩＮＢ蛋白氨基酸序列第８６
位点发生了Ｃ→Ｓ的突变（图２、图３）。
　　Ｐｉｎｂ－ａｌｌｅ　１来源于材料ＸＪ－１０９；Ｐｉｎｂ－ａｌｌｅ　２来源于材料ＸＪ－４；Ｐｉｎｂ－ａｌｌｅ　３来源于材料ＳＣ－３；两箭头间表示色氨酸结构域
Ｐｉｎｂ－ａｌｌｅ　１，Ｐｉｎｂ－ａｌｌｅ　２　ａｎｄ　Ｐｉｎｂ－ａｌｌｅ　３　ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ＸＪ－１０９，ＸＪ－４ａｎｄ　ＳＣ－３，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ－ｒｉｃｈ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｄｉｃａ－
ｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ａｒｒｏｗｓ
图３　Ｐｉｎｂ基因等位变异的核苷酸序列及推导的氨基酸序列比对
Ｆｉｇ．３　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｉｎｂａｌｅｌｅｓ
·５０２１·第９期 曹雯梅等：粗山羊草新型硬度等位基因的克隆及分析
３　讨 论
小麦子粒硬度主要受位于５Ｄ染色体短臂上
一个主效基因和多个微效基因控制，Ｐｉｎａ 和
Ｐｉｎｂ是形成小麦籽粒硬度的基础。ＰＩＮＡ蛋白
的缺失或编码ＰＩＮＢ蛋白的基因突变均造成小麦
胚乳质地变硬［１９］。中国目前对该项目已有一定
研究，但与国外相比仍有很大差距。粗山羊草作
为小麦的近缘野生物种，不仅是普通小麦Ｄ组的
供体，而且是柱穗山羊草、肥山羊草等几个多倍体
物种的关键性染色体组，随着小麦硬度测试方法
的日趋完善，其分子遗传基础的研究逐步加快，对
粗 山 羊 草 子 粒 硬 度 的 研 究 也 取 得 一 定 进
展［１５，１９－２１］。吴 昊等［２１］对粗山羊草的基因组
ＤＮＡ进行Ｐｉｎｂ基因扩增、克隆和序列分析，发现
了１个新型Ｐｉｎｂ等位基因。苏亚蕊等［１６］对黄河
流域的１６１份粗山羊草进行高分子量谷蛋白亚基
的鉴定、克隆及系统进化分析，发现了３个新的高
分子谷蛋白ｙ－型亚基。常广阳等［１７］对节节麦
Ｙ２１１进行高分子量谷蛋白亚基的鉴定、克隆及系
统进化分析，发现了１个新的高分子量谷蛋白ｙ－
型亚基。Ｍａｓｓａ等［９］对５０份粗山羊草硬度基因
多样性进行分析，发现了７种Ｇｓｐ－１、５种Ｐｉｎａ和
３种Ｐｉｎｂ的新突变类型。表明收集到的粗山羊
草这一野生种质资源含有比普通小麦较多的基因
类型，如果再增加粗山羊草样本进行研究，还可能
发现更多的新优良基因，这些基因是普通小麦Ｄ
组基因池的扩展基因，是普通小麦遗传改良的物
质基础。
本研究以黄河中下游地区及新疆地区的３５
份粗山羊草为材料，通过ＰＣＲ扩增、克隆及序列
分析的方法，得到了２个Ｐｉｎａ的新型等位基因，３
个Ｐｉｎｂ的新型等位基因。２个Ｐｉｎａ的新型等位
基因中，Ｐｉｎａ－ａｌｌｅ　１有３个核苷酸突变位点，Ｐｉ－
ｎａ－ａｌｌｅ　２有５个核苷酸突变位点，对其突变位点
的研究可以看出第１２１位是个高突变频率的位
点。２个新等位基因和软质小麦的Ｐｉｎａ－Ｄ１ａ序
列有较大差异。同样，在３个Ｐｉｎｂ的新型等位基
因中，Ｐｉｎｂ－ａｌｌｅ　１有３个核苷酸突变位点，Ｐｉｎｂ－
ａｌｌｅ　２有４个核苷酸突变位点，Ｐｉｎｂ－ａｌｌｅ　３也有３
个核苷酸突变位点，对其变异位点的研究可以看
出第９６位和１３２位是２个高突变频率的位点。
与软质小麦的Ｐｉｎｂ－Ｄ１ａ序列比较，它们也有较
大的差异。以上结果进一步证实了粗山羊草是一
个含有丰富遗传资源的野生材料，丰富了小麦子
粒硬度的遗传资源，为普通小麦品质的遗传改良
提供了材料、指出了方向。
　　本研究从粗山羊草中得到的Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ
新型等位基因，具有３到５个氨基酸的变异位点，
和软粒小麦的基因序列存在较大变异，但目前所
发现的各种山羊草突变类型均表现为软质，而且
其ＰＳＩ硬度值显著低于野生型，说明利用粗山羊
草这一野生种质资源可以改良软质普通小麦的品
质，对小麦子粒硬度改良的基因工程具有重要意
义。对于从粗山羊草中发现的Ｐｉｎａ和Ｐｉｎｂ新
型等位基因之间的关系及其功能有待进一步研
究，如对子粒硬度表达调控机理、表达载体的构建
等。另外，本研究虽然从３５份粗山羊草中仅得到
了２个Ｐｉｎａ的新型等位基因和３个Ｐｉｎｂ的新型
等位基因，但并不排除还有其他新基因的存在，因
为所选试验材料可能是Ｐｉｎａ或者Ｐｉｎｂ的基因
缺失类型，或者是试验所用引物特异性不强等。
本研究结论仅限于来自黄河中游地区的河
南、陕西、新疆的材料，为更充分地挖掘小麦子粒
硬度的遗传资源，有必要在整合前人研究材
料［２０－２１］及结论的基础上，系统收集粗山羊草材料，
在相似的环境及引物下进行克隆分析，以提高野
生植物资源利用的广泛性和有效性。
参考文献：
［１］Ｂｅｔｔｇｅ　Ａ　Ｄ，Ｍｏｒｒｉｓ　Ｃ　Ｆ，Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ　Ｇ　Ａ．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ　ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ
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·７０２１·第９期 曹雯梅等：粗山羊草新型硬度等位基因的克隆及分析