全 文 ：收稿日期:2009-04-25
基金项目：国家科技支撑计划项目（2008BAB3D06）
作者简介：刘 芳（1982- ），女，内蒙古丰镇人，硕士，研究方向为牧草遗传育种。
通讯作者：侯建华(1962-),女，内蒙古呼和浩特人，教授，博士，硕士生导师，主要从事植物遗传育种。
羊草和灰色赖草属禾本科赖草属根茎型牧草，四倍体（2n=
28,NS1NS1NS2NS2），异花授粉。 羊草是欧亚大陆草原区东部草甸
草原上的建群种，广泛分布于我国东北、内蒙古及西北、华北等
地区的草原上，是一种抗逆性很强的优良牧草，但羊草的“三低”
（结实率低、出苗率低、产草量低）难题已成为人工草地建设和天
然草场改良的主要限制因素， 也是羊草遗传育种改良的主要育
种目标。灰色赖草起源于美洲，具有植株高大，结实率、出苗率较
高，种子粒大和休眠浅等特点。 以二者为亲本获得的杂种 F1代
在生长势、产草量、营养成分及耐盐性等方面均表现出较强的种
间杂种优势和育种潜力，但其在开放授粉条件下完全不育。
大量研究表明， 杂种 F1 的染色体加倍是克服远缘杂种不
育、创造新物种的有效方法。通常禾本科牧草倍性育种用秋水仙
素浸泡法处理其分蘖苗，以期获得加倍植株。但获得加倍材料多
为嵌合体，往往不能稳定遗传，而且受环境干扰大，并且可能产
生回复突变。随着植物组织培养技术的发展，化学药剂可以在离
体条件下诱导单个细胞染色体加倍， 获得多倍体再生， 克服常
规人工加倍处理方法的缺陷。 近年来研究发现, 离体培养条件
下染色体加倍具有明显的优越性: 试验条件容易控制， 试验结
果重复性强，工作效率高，嵌合体发生率低。为此，本试验尝试采
用秋水仙素和氟乐灵（Trifluralin）两种化学诱变剂诱导幼穗愈伤
组织细胞进行染色体加倍的研究， 通过观察化学诱变试剂加倍
处理后愈伤组织的生长分化情况， 旨在探讨羊草与灰色赖草杂
种 F1育性恢复的有效方法。
1 材料和方法
1.1 材料及试验地概况
供试材料羊草（L.chinensis）×灰色赖草(L.cinereus)杂种 F1代
的种植和田间试验观察均在内蒙古农业大学牧草试验站进行。
该站位于呼和浩特市东郊， 东经 111°42′， 北纬 40°49′， 海拔
1063m，无霜期 140d，年平均降水量在 400mm 左右，属典型大陆
性气候。 试验地属沙壤质暗栗钙土，肥力中等，pH 值 7.5 左右，
具备灌溉条件。
1.2 仪器
国产 HZQ-Q 型振荡器 ；日本 Hirayama 公司产全自动高压
灭菌锅 HVE-50；超净工作台。
1.3 试验方法
1.3.1 愈伤组织的诱导 取 2cm 左右羊草×灰色赖草杂种 F1带
一层幼叶的幼穗，用 70％乙醇表面消毒 30s，无菌水冲洗 3 次，
0.1％HgCl2消毒 3～5min，再用无菌水冲洗 4～5 次后，在超净工作
台中用解剖镊子剥出幼穗，切成长 2～3mm 的小段，接种到 2mg/
L2,4-D 丁酯+MS 培养基上诱导愈伤组织。培养基含 3％蔗糖（W/
V），0.75%琼脂（W/V），调 pH 值=5.8。
培养条件： 光强 2000～3000lx， 光照时间 24h/d， 温度 26～
28℃，相对湿度 75％，每 30～45d 继代 1 次。
1.3.2 愈伤组织加倍 愈伤组织染色体加倍的途径有两条：（1）
将诱导出的胚性较强的愈伤组织， 分别放入浓度为 100mg/L、
300mg/L、500mg/L、700mg/L 的 秋 水 仙 素 和 20μM、200μM、
500μM、1500μM 的氟乐灵（Trifluralin）中，振荡处理 9～66h（温度
为 25±1℃，转速为 120±2r/min），然后转入不含诱变剂的液体培
养基中振荡洗脱 2h，洗净愈伤组织表面残留的诱变剂，最后将
其接在 MS 培养基上分化培养。 培养基含 3％蔗糖（W/V），0.75%
琼脂（W/V），调 pH 值=5.8。 分化绿苗转入 1/2MS+0.5NAA 培养
基中生根培养。 标记为 A 途径。 （2）取结构致密、颗粒较小的胚
性愈伤组织，分别接种在含 100mg/L、300mg/L、500mg/L、700mg/
L 4 个浓度的秋水仙素和 20μM、200μM、500μM、1500μM 的氟
乐灵继代培养基上（2mg/L2,4-D 丁酯+MS）加倍培养 5～15d，然
后转接到 MS 固体分化培养基上分化。 标记为 B 途径。
试验中秋水仙素采用细菌过滤器灭菌，氟乐灵采用以下 2种
方法灭菌：（1）湿热高压灭菌：用日本 Hirayama公司产全自动高压
灭菌锅 HVE-50在压力 1.2～1.3kg/cm2范围内灭菌 20min。（2）细菌
过滤器灭菌：在超净工作台中，用细菌过滤器过滤灭菌 2次。
含化学诱导剂的培养基配制方法： 将培养基用高压灭菌锅
灭菌，稍冷却后将其与灭菌后的化学诱导溶液混合均匀，分装。
1.4 数据处理
愈伤组织绿芽分化率（％）
=有芽形成的愈伤组织块数
接种的总愈伤组织块数
×100
化学诱变对羊草与灰色赖草杂种 F1愈伤组织生长和分化的影响
刘 芳 1， 云锦凤 1， 侯建华 1， 刘志雄 2
（1.内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特 010019；2.内蒙古农牧业科学院 玉米研究中心，内蒙古 呼和浩特 010031）
摘 要：以羊草与灰色赖草杂种 F1愈伤组织为材料，用秋水仙素和氟乐灵（Trifluralin）两种化学诱变剂对其进行加倍处理。 不同加倍途
径、诱导剂、诱导剂浓度、处理时间以及不同的诱导剂灭菌方法对愈伤组织生长和分化有不同的影响。试验中秋水仙素处理愈伤组织绿芽
分化率为 0～80%；氟乐灵处理愈伤组织绿芽分化率为 6%～93%。
关键词：羊草；灰色赖草；秋水仙素；氟乐灵；组织培养
中图分类号:Q813.1 文献标识码:A 10.3969/j.jssn.1007-0907.2009.03.020 文章编号:1007-0907(2009)03-0039-03
内蒙古农业科技 2009（3）：39~41
Inner Mongolia Agricultural Science And Technology
表 1 羊草与灰色赖草杂种 F1愈伤组织生长及分化情况
诱导剂 消毒方式 浓度 处理时间(h) 愈伤组织块数（块） 芽丛数（块） 愈伤组织绿芽分化率（%） 芽点状况
100mg/L 18 30 24 80 鲜绿色
100mg/L 27 60 44 73 部分褐化
100mg/L 36 30 21 70 部分褐化
100mg/L 54 30 19 63 部分褐化
300mg/L 9 30 22 73 鲜绿色
300mg/L 18 45 24 54 鲜绿色
300mg/L 27 60 32 53 部分褐化
300mg/L 36 30 14 47 部分褐化
300mg/L 54 30 9 30 部分褐化
500mg/L 9 30 19 63 鲜绿色
500mg/L 18 30 14 47 鲜绿色
500mg/L 27 30 12 40 部分褐化
500mg/L 36 30 8 27 部分褐化
500mg/L 54 45 10 22 部分褐化
700mg/L 9 30 14 48 鲜绿色
700mg/L 18 30 13 47 鲜绿色
700mg/L 27 30 11 37 部分褐化
700mg/L 36 30 0 0 全部褐化
ck 170 161 95 鲜绿色
20μM 28 30 28 93 鲜绿色
20μM 50 30 27 90 鲜绿色
20μM 66 30 26 87 鲜绿色
200μM 28 30 26 87 鲜绿色
200μM 42 30 24 80 鲜绿色
200μM 66 45 34 76 灰绿色
500μM 28 30 19 63 鲜绿色
500μM 42 30 18 60 灰绿色
500μM 66 30 16 52 灰绿色
1500μM 28 30 9 33 灰绿色
1500μM 42 30 6 20 灰绿色
20μM 28 30 27 90 鲜绿色
20μM 50 30 26 87 鲜绿色
20μM 66 30 25 83 鲜绿色
200μM 28 30 24 80 鲜绿色
200μM 42 30 23 77 鲜绿色
200μM 50 30 22 73 灰绿色
200μM 66 30 21 70 灰绿色
500μM 28 30 14 47 鲜绿色
500μM 42 30 12 40 鲜绿色
500μM 66 30 6 20 灰绿色
1500μM 28 30 4 13 灰绿色
1500μM 42 30 2 6 灰绿色
细菌过滤秋水仙素
高温高压
细菌过滤
氟乐灵
2 结果与分析
2.1 不同加倍途径对愈伤组织生长和分化的影响
A 途径加倍后的试验材料生长分化情况见表 1。 不同诱变
剂、 处理时间和浓度的不同以及诱变剂不同灭菌方式对愈伤组
织进行加倍处理后，其生长分化的情况表现出差异。B 途径加倍
过程中，加倍 5～15d，大部分愈伤组织逐渐变褐，处理后的愈伤
组织转接到 MS 固体分化培养基后，一部分材料继续变褐，另一
部分材料保持白色愈伤组织，不再生长，均没有绿芽分化现象，
最终全部死亡。
2.2 不同诱变剂对愈伤组织生长和分化的影响
2.2.1 秋水仙素对愈伤组织生长和分化的影响 与未经加倍的
对照相比，处理后的愈伤组织分化时间推后 30～60d。从表 1中可
以看出，相同处理时间下随着秋水仙素浓度的增加，绿芽率均有
所下降。 相同秋水仙素浓度下随着处理时间的增加，绿芽率也有
所下降。而且 100mg/L、300mg/L、500mg/L、700mg/L 4 个浓度的秋
水仙素超过 27h 处理后的愈伤组织在分化培养过程中均有变褐
死亡现象，500mg/L浓度下 54h处理后大多数愈伤组织生长受到
抑制不分化直至变褐死亡， 而 700mg/L 浓度下 36h 处理后愈伤
组织全部迅速死亡。 另外个别愈伤组织只长根不分化绿芽。
低浓度条件下处理时间对愈伤组织绿芽率没有显著影响。
100mg/L 浓度下处理 18～54h，绿芽率从 80％降至 63%。
2.2.2 氟乐灵对愈伤组织生长和分化的影响 氟乐灵属于硝基
苯胺类除草剂, 此类除草剂有干扰纺锤体机制的作用、抑制纺锤
体的形成和细胞分裂中期的有丝分裂。 在细胞分裂后期, 染色
体沿着纺锤体分离。 尽管 DNA 被复制 , 但是不形成新的细胞
壁, 于是在核中产生双 DNA。 与未经加倍的对照相比，处理后的
愈伤组织分化时间推后 30～60d。 从表 1 中可以看出，相同处理
时间下，随着氟乐灵浓度的增加，绿芽率均有所下降。 但相同氟
乐灵浓度下，随着处理时间的增加，绿芽率下降幅度不大，说明
浓度对绿芽率的影响显著。 如：细菌过滤灭菌方式下，氟乐灵处
40 内 蒙 古 农 业 科 技 No.3
表 6 不同处理的油用向日葵产量结果
处理
小区产量 1）
（kg）
净产量
（kg/667m2）
比垄沟增减
（%）
经济效益
（元/667m2）
垄面种植
垄腰种植
垄沟种植
1.94
1.89
1.75
105.4
102.7
70.0
50.6
46.7
358.5
349.3
238.0
注：1）为 20 株的产量
表 7 不同处理的油用向日葵考种结果
处理
结实率
（%）
单盘粒重
（g）
百粒重
（g）
含油率
（%）
垄面种植
垄腰种植
垄沟种植
70.67
75.84
84.92
111.78
101.30
101.36
9.03
8.67
8.13
50.9
49.3
49.6
表 8 西瓜间作油用向日葵的经济效益比较 （元/667m2）
西瓜经济效益 向日葵经济效益 总效益 比单种效益增减 比垄沟效益增减
垄面 2165.6 358.5 2524.1 129.8 33.8
垄腰 2406.5 349.3 2755.8 361.5 265.5
垄沟 2252.3 238.0 2490.3 96.0
ck(单种) 2394.3 2394.3 -96.0
处理
对照相比较中心糖都在 10.6%，纤维中，汁液多，
质地脆，口感适口但后微酸。
2.2.2 油用向日葵产、 质量比较 垄面种植油用向日葵 667m2
净产量 105.4kg 比垄沟油用向日葵增产 50.6%，667m2 增效益
120.5 元，垄腰油用向日葵净产量 102.7kg，比垄沟油用向日葵增
产 46.7%，667m2增效益 111.3 元。 表明垄面、垄腰种植油用向日
葵的生产潜力和经济效益优于垄沟种植，见表 6。
垄面种植油用向日葵的单盘粒重、百粒重、籽仁含油率都优
于其余两个处理，结实率垄沟种植优于垄面、垄腰种植，见表 7。
2.2.3 经济效益分析 从表 8 可见，垄作西瓜间作油用向日葵，
垄面种植油用向日葵方式的 667m2 效益比单种西瓜增收129.8
元，比垄沟种植油用向日葵增收 33.8 元。 垄腰种植油用向日葵
方式的 667m2效益比单种西瓜增收 365.1 元， 比垄沟种植油用
向日葵增收 265.5 元。
3 试验结论
垄作西瓜间作油用向日葵的不同种植方式中， 西瓜垄腰间
作油用向日葵方式的经济效益最高，推荐采用该模式；垄沟种植
虽然效益不如垄腰种植， 但也较单作增产， 且不影响主作物西
瓜，在垄腰种植不适合的时候，也可采用此法；虽然垄面间作方
式的油用向日葵产量最高，也较单种效益好，但对主产品西瓜存
在不利影响，因此不提倡垄面种植方式。
（责任编辑 侯旭光）
理时间 28h， 浓度 20～1500μM，绿芽率从 90%降到 13%；500μM
浓度下处理 28～66h，绿芽率从 47%降到 20%。
2.3 不同消毒灭菌方式对氟乐灵处理愈伤组织生长和分化的影响
从表 1 看出：相同浓度和处理时间下，与细菌过滤灭菌方式
相比， 采用高温高压灭菌的氟乐灵溶液对愈伤组织伤害程度较
小、绿芽分化率高。 同时细菌过滤灭菌法操作起来污染率较高。
3 讨论与小结
3.1 化学诱导剂诱导愈伤组织分化效果
近年来，大量研究表明，离体组织培养获得的愈伤组织是用
于染色体加倍的良好材料。 但经染色体加倍处理的明显缺陷就
是所有的生长发育阶段都表现缓慢，本试验也证实了这一点。处
理后的愈伤组织，细胞（团）的生长、分化绿芽、成苗、诱导生根都
明显减缓，分析其原因可能是诱变剂对愈伤组织有毒害作用，导
致细胞分裂强度降低，生长素含量减少等。
本试验中，处理后的愈伤组织接到分化培养基上需 45d左右
才有少量绿色芽点出现，而对照仅分化培养 15d就有大量绿芽出
现。 并且随着诱导剂处理时间的延长，4 个浓度的秋水仙素超过
27h处理后的愈伤组织逐渐变褐死亡，分化能力明显下降。 实验
中我们观察到，愈伤组织转入氟乐灵溶液的处理过程中，在高浓
度长时间处理条件下分化出的芽点颜色为灰绿色，生长缓慢。
3.2 不同的灭菌方法配置氟乐灵诱导愈伤组织变异效果
在本试验中发现， 用 2 种不同的灭菌方法处理后的氟乐灵
溶液处理愈伤组织的绿芽分化率明显不同。 相同浓度和处理时
间下， 采用高温高压灭菌的氟乐灵溶液对愈伤组织伤害程度较
小、绿芽分化率高，其原因可能是氟乐灵在高温高压灭菌的过程
中， 有效成分浓度降低， 但同时也降低了诱导染色体加倍的能
力。 而在常温下，采用细菌过滤器先对氟乐灵溶液进行灭菌，由
于氟乐灵溶液浓度不发生改变，杂种 F1愈伤组织的绿芽分化率
有所降低。
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学位论文，2005. （责任编辑 吴云霞）
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3 期 刘 芳等：化学诱变对羊草与灰色赖草杂种 F1愈伤组织生长和分化的影响 41