全 文 ：书·论 著·
十八味诃子利尿丸中小伞虎耳草的 TLC鉴别及羟基红花
黄色素 A的 HPLC测定
青海省黄南州食品药品检验检测中心( 813992) 蔡 霞
青 海 省 食 品 药 品 检 验 所( 810016) 张幸福 骆桂法
摘要 目的: 建立十八味诃子利尿丸的定性定量方法。方法: 通过薄层色谱对小伞虎耳草进行
定性鉴别，采用 HPLC测定羟基红花黄色素 A 的含量。结果: 通过 TLC 法可鉴别小伞虎耳草活性成
分原儿茶酸的特征斑点; 羟基红花黄色素 A在( 0． 46 ～ 2． 31) μg范围内线性良好，r = 0． 999 9。结论:
建立的鉴别方法专属性强，定量方法准确，可有效控制该药的质量。
关键词 十八味诃子利尿丸 小伞虎耳草 羟基红花黄色素 A TLC HPLC
中图分类号 Ｒ284． 1
藏药制剂十八味诃子利尿丸是以诃子、余甘子、
红花、姜黄、小伞虎耳草等十八味中藏药材制成的复
方制剂，用于肾病、糖尿病、遗精等症［1］。其对通常
抗生素难抑制的耐药菌和真菌抑制效果较好，尤其
是对白色念珠菌抑制效果最好［2、3］。本次实验用
HPLC测定了十八味诃子利尿丸中羟基红花黄色素
A的含量，另外对小伞虎耳草进行了 TLC 薄层色谱
鉴别，现报告如下。
仪器与试药
1 仪器 Agilent 1100 高效液相色谱仪及配套工作
站，OHAUS AＲ5120 电子天平(奥豪斯公司)，HAN-
GPING FA1004 电子天平(上海天平仪器厂)，Sarto-
rius CP 225D 电子天平(赛多利斯公司)，KQ5200B
超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。硅胶
G薄层板(青岛海洋化工厂)。
2 试药 原儿茶酸和羟基红花黄色素 A对照品(批
号分别为 111637 － 200503，809 － 200102，购自中国药
品生物制品检定研究院)，小伞虎耳草对照药材(青海
省食品药品检验所藏药标本室，经检定)。色谱用甲
醇、乙腈均为色谱纯，水为重蒸馏水;其它试剂均为
分析纯。十八味诃子利尿丸样品十批，分别来自青
海、西藏、甘肃、云南的生产单位。
基金项目:青海省科学技术厅项目(2012 － N － 523)。
方法与结果
1 小伞虎耳草的薄层色谱鉴别 取样品粉末 3g，
加水 20mL，超声处理 30 分钟，加稀盐酸调节 pH 值
至 2，用乙醚提取 2 次，每次 20mL，合并乙醚液，挥
去乙醚，残渣加甲醇 1mL 溶解，作为供试品溶液。
另取原儿茶酸对照品，加甲醇制成每 1mL含 2mg 的
溶液，作为对照品溶液。同时制备阴性溶液。参照
薄层色谱法试验，吸取供试品溶液 5μL，对照品溶液
2μL，分别点于同一硅胶 GF 254 薄层板上，以三氯
甲烷 －乙酸乙酯 －甲醇 －甲酸(12220． 8)为
展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯(254nm)下检
视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，
显相同的暗色斑点，见图 1。
(1:小伞虎耳草对照药材;2:原儿茶酸对照品;3:阴性样品;
4 ～ 10:十八味诃子利尿丸样品)
图 1 十八味诃子利尿丸的 TLC图谱(紫外光灯 254nm)
·1·青海医药杂志2 0 1 4年第4 4卷9期
2 溶液的制备［4 ～ 6］ 对照品溶液的制备取羟基红
花黄色素 A对照品适量，精密称定，加 25%甲醇制
成每 1mL含 0． 1mg的溶液，即得。供试品溶液的制
备 取本品，研匀，称取约 2． 0g，精密称定，置具塞锥
形瓶中，精密加入 25%甲醇 25mL，密塞，称定重量，
超声处理 30 分钟，放冷，再称定重量，用 25%甲醇
补足减失的重量，摇匀、滤过、取续滤液，即得。
3 色谱条件［4 ～ 7］ 羟基红花黄色素 A:Phenomenex
Luna C18柱(250mm × 4． 6mm，5μm)，流动相为甲醇
－乙腈 － 0． 7% 磷酸(6 12 82)，检测波长
403nm，柱温 25℃，理论板数不低于 3 000，对照品和
供试品各进 10μL。
4 专属性考察 按“3”色谱条件进样，供试品溶液
色谱中，在与羟基红花黄色素 A 对照品相应位置
处，有保留时间相同的色谱峰，阴性无干扰。见图
2。
(A:对照品溶液;B:供试品溶夜;C:阴性样品;1:羟基红花黄色素 A)
图 2 十八味诃子利尿丸 HPLC色谱图
5 线性关系考察 分别精密吸取羟基红花黄色素 A
对照品溶液(0． 115 7mg·mL －1)4、8、12、16、20μL;注入
液相色谱仪，以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐
标，绘制标准曲线，计算回归方程。羟基红花黄色素 A
在(0． 46 ～2． 31)μg范围内线性良好，Y =3． 9 ×103X －
3． 0，r =0． 999 9。
6 稳定性试验 取同一供试品溶液，于配置后 0、4、8、
14、16、20、24h内依法进样，结果羟基红花黄色素 A峰
面积的 ＲSD为 0． 3%(编号 6，n =5);结果表明在 16h
内的稳定性良好。
7 精密度试验 分别取羟基红花黄色素 A对照品溶
液(0． 115 7mg·mL －1)10μL、对照品溶液(0． 315mg·
mL －1)5μL，各重复进样 5 次，结果羟基红花黄色素 A
峰面积的 ＲSD为 0． 17%。
8 重复性试验 取十八味诃子利尿丸(编号 6)，研
细，取约2． 0g，平行6份，精密称定，按“2”项下羟基红
花黄色素 A方法制成供试品溶液并测定，结果 6份样
品的羟基红花黄色素 A含量为 0． 345，0． 343，0． 345，
0． 346，0． 346，0． 346，平均 0． 345mg /g，ＲSD =0． 29%。
9 回收率试验 取已知含量的十八味诃子利尿丸(编
号 6，羟基红花黄色素 A含量为 0． 345 2mg /g)约1． 0g，
平行 6份，置锥形瓶中，分别精密加入羟基红花黄色素
A对照品溶液(8． 642μg /mL)50mL，密塞，称定重量，超
声处理 30分钟，放冷，再称定重量，用 25%甲醇补足减
失的重量，摇匀、滤过、取续滤液，即得。按“3”项色谱
条件测定各成分的含量，计算回收率，结果见表 1。
表 1 加样回收率考察试验结果(%)
成分 样品含量(mg)
加入量
(mg)
实测总量
(mg) 回收率 平均 ＲSD
羟基红花
黄色素 A
0． 344 5
0． 349 5
0． 346 6
0． 346 2
0． 345 8
0． 348 3
0． 432 1
0． 432 1
0． 432 1
0． 432 1
0． 432 1
0． 4321
0． 771 3
0． 774 0
0． 767 1
0． 792 4
0． 787 5
0． 778 2
96． 5
98． 2
97． 3
103． 3
102． 2
99． 5
99． 5 2． 7
10 样品测定 按“2”和“3”项方法和色谱条件对
10 批次十八味诃子利尿丸中的羟基红花黄色素 A
的含量进行测定，结果见表 2。
表 2 十八味诃子利尿丸中含量测定结果(mg /g)
编号 羟基红花黄色素 A
1 0． 14
2 0． 12
3 0． 26
4 0． 12
5 0． 04
6 0． 35
7 0． 24
8 0． 23
9 0． 21
10 0． 32
·2· 青海医药杂志2 0 1 4年第4 4卷9期
讨 论
1)色谱柱选用:①ZOＲBAX Eclipse XDB － C18
(250mm × 4． 6mm，5μm);② Phenomenex Luna C18
(250mm × 4． 6mm，5μm);③依利特 Hypersil ODS2
C18(250mm × 4． 6mm，5μm)三个品牌的色谱柱对十
八味诃子利尿丸中的羟基红花黄色素 A 进行含量
测定，均得到样品中羟基红花黄色素 A 峰基线分离
的对称色谱峰，分离度大于 1． 5，理论塔板数按羟基
红花黄色素 A峰计算为 12 875。流动相的选择:选
用流动相甲醇 －乙腈 － 0． 7%磷酸(61282)，和
2010 年版《中国药典》(一部)红花［8］项下，测定羟
基红花黄色素 A的流动相比例比较，峰形达到基线
分离，对称性好，无拖尾现象。提取条件的考察:本
实验系统考察了甲醇、乙醇等溶液的提取效果，乙醇
提取的杂质较多，色谱峰难以分离，最终选择甲醇作
为提取溶剂。并在此基础上考察了甲醇的浓度、提
取的时间、甲醇的量三个因素。结果表明，加入
25%甲醇 25mL，超声处理 30 分钟，为最佳提取方
法。
2)实验共测定不同生产企业的水丸 10 批，结
果表明温度对羟基红花黄色素 A 的影响较大，70℃
以上，随着温度的升高和时间的延长，羟基红花黄色
素 A将损失 50% ～90%，因此，在生产工艺中，烘干
温度应控制在 70℃以下，以保证药品的有效性，为
十八味诃子利尿丸的临床疗效研究打下基础。
3)十八味诃子利尿丸为常用藏成药，一直未建
立完善的质量标准，小伞虎耳草、红花是主药，羟基
红花黄色素 A 为红花的活性成分，实验表明，本测
定方法简单，测定结果准确可靠、灵敏、重现性好，共
同控制小伞虎耳草和红花的定性定量指标，可作为
十八味诃子利尿丸的质量控制方法，该方法也为其
他藏药复方制剂的研发和质控，建立可靠、高效的检
测方法提供借鉴。
参 考 文 献
1 卫生部药典委员会． 卫生部药品标准(藏药第一册)．
1995，46．
2 傅永红．藏药甘青乌头抗菌、抗肿瘤活性研究以及兔耳草
抗病毒活性研究．兰州大学，2008，32 ～ 34．
3 傅永红，李红玉，张春江．等．藏药十八味诃子利尿丸抗菌
性研究．时珍国医国药，2007，18(2):406 ～ 408．
4 刘合禄，庄肃农，齐静．十八味诃子利尿丸质量标准研究．
齐鲁药事，2010，29(4):213 ～ 215．
5 杨凤梅，张幸福，张炜．等． UPLC法同时测定十八味诃子
利尿丸中 4 种药效成分含量的方法研究． 青海医学院学
报，2011，32(1):53 ～ 59．
6 张幸福． HPLC 测定藏药十四味羚牛角丸中的羟基红花
黄色素 A．华西药学杂志，2009，24(24):86 ～ 87．
7 张幸福，才毛，骆桂法．藏药十味诃子丸的质量控制研究．
中国实验方剂学杂志，2014，20(9):51 ～ 55．
8 国家药典委员会．中华人民共和国药典．一部．北京:中国
医药科技出版社，2010，141．
Identification of S． umbellulataHook． f． ＆Thoms． by TLC and determination of effective composition in
Tibetan Medicine Shibawei Hezi Diuretic Pills by HPLC
Cai Xia1，Zhang Xing fu2，Luo Gui fa2
1 Qinghai Huangnan Institute for Food and Drug Testing Center，Huangnan，Qinghai(813992)
2 Qinghai Institute for Food and Drug Control，Xining，Qinghai(810016)
Abstract Objective:To establish a qualitative and quantitative method for Tibetan Medicine Shibawei Hezi Diu-
retic Pills．Methods:S． umbellulataHook． f． ＆Thoms was identified by TLC methods． Hydroxysafflor yellow A was de-
termined by HPLC． Ｒesults:Protocatechuic acid could be identified by TLC． In the system of HPLC，Hdroxysafflor
yellow A showed good linear relationship in the ranges of 0． 46μg ～ 2． 31μg． Y = 3． 9 × 103X － 3． 0，r = 0． 999 9．
Conclusion:The method can be applied to the quality control of Shibawei Hezi Diuretic Pills．
Key words Shibawei Hezi diuretic Pills;S． umbellulataHook． f． ＆Thoms;Hydroxysafflor yellow A;TLC;
HPLC
·3·青海医药杂志2 0 1 4年第4 4卷9期