全 文 ：平邑甜茶MhWRKY15基因 cDNA克隆
及其生物信息学分析
孙晓莉，冉 昆，杨洪强 *，李 强，姜倩倩
（山东农业大学园艺科学与工程学院·作物生物学国家重点实验室·山东省果树生物学重点实验室，山东泰安 271018）
摘 要 : 以平邑甜茶为材料，通过 RT-PCR 和 RACE 技术，获得平邑甜茶 WRKY15 基因的全长 cDNA，命名为 Mh-
WRKY15（GenBank 登陆号: GU576874）。 生物信息学分析表明，该基因全长 1 091 bp，包含 810 bp 的完整开放读码
框，编码 269 个氨基酸，属于 WRKY 类转录因子的第 II 组，为 WRKY15 家族成员；其编码蛋白为可溶性蛋白，分子式
为 C1263H1941N365O425S12，相对分子量为 29 423.2 ku，理论等电点为 5.30；含有一个 WRKY 保守结构域，定位于细胞核，存
在磷酸化、N 糖基化和 O 糖基化位点，其二级结构主要以无规则卷曲为主。
关键词: 平邑甜茶； WRKY15； cDNA； 生物信息学
中图分类号：S661．19 文献标识码：A 文章编号：1009－9980(2011)06－949－04
Cloning of MhWRKY15 gene in Malus hupehensis and its bioinformatics
analysis
SUN Xiao-li， RAN Kun，YANG Hong-qiang*， LI Qiang， JIANG Qian-qian
（College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University· State Key Laboratory of Crop Biology； 3Shandong
Provincial Key Laboratory of Fruit Biology， Tai’an，Shandong 271018 China）
Abstract: Full-length cDNA sequence of WRKY15 gene from roots of Malus hupehensis （Pamp.） Rehd.
var. pinyiensis Jiang， which was tentatively designated as MhWRKY15， with GenBank accession number
GU576874， was acquired by RT-PCR and RACE with primers designed respectively based on the EST
sequence. Bioinformatics analysis indicated that MhWRKY15 was 1 091 bp in length， containing an open
reading frame of 810 bp and encoding 269 amino acids， and it belonged to group II of WRKY transcription
factors and was one member of WRKY15 family. The results also showed that the protein encoded by Mh-
WRKY15 was a soluble protein， with the molecular formula C1263H1941N365O425S12， the relative molecular
weight was 29 423.2 ku and the isoelectric point was 5.30. There was one conserved WRKY domain in the
protein sequence. The protein might be located in nucleus， and there were many phosphorylation sites， N
glycosylation sites and O glycosylation sites. The predicted secondary structure demonstrated that random
coil was the most important structural conformation.
Key words: Malus hupehensis （Pamp.） Rehd.；WRKY15； cDNA； Bioinformatics
WRKY是植物特有的一种 N端含有 7个绝对保
守的氨基酸序列 （WRKYGQK）及锌指结构 （CX4-7
CX22-23HXH/C）的转录因子 [1-2]，它通过与核心序列为
（T）（T）TGAC（T/C）的 W-box 顺式元件特异结合而
调节基因表达[3-4]。目前，在拟南芥和水稻等植物中已
克隆了大量 WRKY 成员 [5-6]，根据 WRKY 结构域个
数及锌指结构特征，这些成员可以分为 3类。第Ⅰ类
含有 2 个 WRKY 结构域； 第Ⅱ类含有 1 个 WRKY
结构域， 其锌指结构为 C2H2型； 第Ⅲ类含有 1 个
WRKY结构域，其锌指结构为 C2HC 型[7]。 WRKY 明
显受真菌、冷害、高温、干旱及盐胁迫等诱导，并参与
胚胎形成、种皮及腺毛发育等多种过程[1-2，7]。 平邑甜
果 树 学 报 2011，28（6）: 949～952
Journal of Fruit Science
收稿日期： 2011－01－10 接受日期: 2011－07－06
基金项目： 国家转基因生物新品种培育重大专项（2008ZX08009-3）； 高校博士点专项科研基金（20103702110003）
作者简介： 孙晓莉，女，在读硕士生，研究方向：果树生理与分子生物学。 Tel: 0538-8249304
觹 通讯作者。 Author for correspondence． E-mail: hqyang@sdau.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2011.06.013
果 树 学 报 28 卷
茶是苹果的优良砧木， 克隆其转录因子并进行生物
信息学分析， 对于苹果砧木的分子调控及遗传改良
有重要意义。
1 材料和方法
1.1 总 RNA的提取及检测
取具 4~6 片真叶的平邑甜茶 [Malus hupehensis
（Pamp） Rehd. var Pinyiensis Jiang]， 采用改进快速
CTAB 法提取根系总 RNA[8]，琼脂糖凝胶电泳及 Ep-
pendorf核酸蛋白测定仪检测质量及浓度。
1.2 MhWRKY15基因的克隆
按照 RNA PCR （AMV） Ver.3.0 （TaKaRa）使用
说明合成 cDNA 第 1 链，根据已知 EST 序列设计特
异的上游引物 P1: （5’-CAGATTATGAGCGACCAG
GAG-3’）和下游引物 P2: （5’-CGAGGAAACAAGTT
GAAAG-3’），以 cDNA为模板进行 PCR扩增。 产物
回收后克隆入 pMD-18T 载体 ， 转化大肠杆菌
DH5α， 提取质粒后测序； 根据测序结果设计 3’-
RACE 上游引物 P3: 5’ -CATGGTGGTCCTGGAGT
TCT-3’，下游引物为 B26通用引物: 5’-GACTCGAG
TCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT， 扩增得到 3’
端序列。 根据中间片段和 3’端序列，设计 5’-RACE
上游引物 P4（5’-CATTGCCCAGTGTAATCCT-3’）和
下游引物 P5 （5’-CATCTTAACCCTCCTTTCT-3’），
按照 5’-Full RACE Kit（Takara Code: D315）使用说
明，得到 5’端序列。 最后设计全长引物 P6（5’-ATG
GACCCCACATTCTTCAG-3’）和 P7（5’-TCAACAGA
ATCTGAGCTTGTG-3’）， 扩增得到 MhWRKY15 编
码区序列。
1.3 生物信息学分析
用 DNAStar 软件中的 EditSeq 程序分析 Mh-
WRKY15全长序列，用 ORF Finder （http://www. ncbi.
nlm. nih. gov/gorf/gorf. html） 寻找最大开放阅读框
（ORF）。 在 NCBI 上通过 Blastn 和 Blastp 分别进行
核苷酸和蛋白质序列同源性分析； 利用 ClastalW
1.8.1 和 Maga4.1 软件构建系统进化树； 分别采用
Conserved Domains Database （http://www. ncbi. nlm.
nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）、Expasy -ProtParam
（http://expasy. org/tools/protparam.html）、TMpred（http:
//www. ch. embnet. org/software/TMPRED_form. html）、
SignalP3.0（http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/）、
CELLO （http://cello. life. nctu. edu. tw/）、NetPhos 2.0
（http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/）、NetNGlyc
1.0 （http://www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/）和
NetOGlyc 3.1 （http://www. cbs. dtu. dk/services/NetO-
Glyc/）对编码蛋白进行保守域、氨基酸理化性质、跨
膜区、信号肽分析、亚细胞定位、磷酸化位点、N-糖
基化位点和 O-糖基化位点分析。
2 结果与分析
2.1 平邑甜茶 MhWRKY15 基因 cDNA 全长序列
的克隆
利用特异引物 P1 和 P2， 通过 RT-PCR 扩增得
到长约 350 bp 的目的条带（图 1-A），产物测序后确
定为 342 bp。通过 RACE技术分别获得 330 bp的 5’
端（图 1-B）和 741 bp的 3’端（图 1-C）序列。在拼接
序列起始密码子和终止密码子处分别设计引物 P6
和 P7，扩增得到 810 bp 的条带（图 1-D），测序结果
与拼接的编码区序列吻合。 将该基因命名为 Mh-
WRKY15，GenBank登陆号为 GU576874。
A M B M C M D M
图 1 平邑甜茶 MhWRKY15 基因 PCR 扩增电泳
A. MhWRKY15 中间片段； B. 5’端 cDNA片段； C. 3’端 cDNA片段； D.编码区 cDNA片段； M. DL2000 /plus DNA Marker
Fig. 1 Agarosegel electrophoresis of PCR amplification for MhWRKY15 fromM. hupehensis
A. Middle fragment； B. 5’fragment； C. 3’fragment； D. ORF； M. DL 2000/plus DNA marker
A M B M C M D M
950
6 期
图 3 SWISS-MODEL 预测的 MhWRKY15 三级结构
Fig. 3 Tertiary structure prediction of MhWRKY15 by
SWISS-MODEL
孙晓莉: 平邑甜茶 MhWRKY15 基因 cDNA 克隆及其生物信息学分析
2.2 平邑甜茶 MhWRKY15基因的核苷酸序列分析
EditSeq 程序和 ORF Finder 分析显示 ，Mh-
WRKY15全长 1 091 bp，含有 810 bp的完整 ORF，起
始密码子为 ATG，终止密码子为 TGA，包括 134 bp
的 5’非翻译区（5’-UTR）和 147 bp 的 3’非翻译区
（3’-UTR），共编码 269个氨基酸。
2.3 平邑甜茶 MhWRKY15编码蛋白的系统发生分
析
2.3.1 蛋 白 保 守 域 分 析 Conserved Domains
Database 蛋白保守域分析显示，MhWRKY15 编码蛋
白在 80~140位氨基酸之间含有一个 WRKY 保守功
能域，其中 WRKYGQK 为 7 个绝对保守的氨基酸残
基； 在该蛋白 DNA结合域中具有一个 C2H2型 （C-
X5-C-X23-H-X1-H）锌指结构，表明该蛋白属于第 II
组 WRKY 类转录因子 ；Blast 分析确认该基因为
WRKY15家族成员。
2.3.2 系统进化树分析 以最大简约法（MP）构建
的多物种系统进化树 （图 2） 显示， 与平邑甜茶
（GU576874）进化关系最近的是苹果（ADL36857.1），
其次是大豆（ABS18444.1）和葡萄（XP002269267.1）。
图 2 不同物种间 WRKY 基因氨基酸序列 MP 树分析
Fig. 2 Maximum parsimony tree of amino acid sequence of WRKY gene in different species
2.4 平邑甜茶 MhWRKY15编码蛋白的性质分析
ProtParam Tool 分析显示 MhWRKY15 分子量为
29 423.2 ku，分子式为 C1263H1941N365O425S12，理论 pI 值
为 5.30， 不稳定参数为 52.50， 属于不稳定蛋白。
TMPred跨膜区域分析表明，该蛋白从内到外及从外
到内的跨膜区域均为 0；SignalP 3.0信号肽分析显示
该蛋白没有信号肽。 NetPhos 2.0分析表明该蛋白存
在 15 个丝氨酸位点、2 个苏氨酸位点和 1 个酪氨酸
位点。 NetNGlyc1.0 分析显示在 22、30、40 及 152 位
氨基酸处存在 4 个 N-糖基化位点；NetOGlyc 3.1 分
析表明存在 16个 O-糖基化位点。 CELLO亚细胞定
位分析表明该蛋白定位于细胞核。 SOPMA 分析表
明，该蛋白 α-螺旋、延伸链和 β-转角的比例分别为
20.22%、11.61%和 3.37% ， 无规则卷曲比例最高
（64.79%）；用 SWISS-MODEL 构建的三维结构模型
AAS79556.1 小草拟南芥 Arabidopsis thaliana (thale cress)
NP174222.2 拟南芥 Arabidopsis thaliana
XP002890801.1 玉山筷子芥 Arabidopsis lyrata subsp. lyrata
ACI14404.1 橄榄型油菜 Brassica napus
ACD56642.1 山青木 Gossypioides kirkii
ACD56629.1 雷蒙德氏棉 Gossypium raimondii
AAT64011.1 陆地棉 Gossypium hirsutum
AAT64024.1 陆地棉 Gossypium hirsutum
XP002522247.1 蓖麻子 Ricinus communis
XP002305730.1 毛果杨 Populus trichocarpa
ACV92010.1 毛白杨 Populus tomentosa
XP002317397.1 毛果杨 Populus trichocarpa
ADL36857.1 苹果 Malus domestica
GU576874 平邑甜茶 Malus hupehensis
ABS18444.1 大豆 Glycine max
XP002269267.1 葡萄 Vitis vinifera
AAZ99027.1 辣椒 Capsicum annuum
ABU49724.1 马铃薯 Solanum tuberosum
100
100
100
100
88
100
100
84
95
99
82
99
99
0.20 0.15 0.10 0.05 0.00
951
2011 年 10 月 11—12 日，“中国园艺学会石榴分会年会
暨第二届全国石榴生产与科研研讨会”在陕西省西安市隆重
召开。
出席这次大会的有来自全国 12 个省、市的科研、教学、
生产、销售及业务主管部门共 90 余人，另有从事石榴研究的
以色列教授 Doron Holland 参加本次会议。 中国园艺学会石
榴分会常务副理事长曹尚银主持了开幕式，中国农业科学院
郑州果树研究所副所长李松章致开幕词，中国园艺学会荣誉
理事长朱德蔚、西安市农业委员会副主任苏新耀，陕西省果
业局总农艺师陈陵江分别作了重要讲话
会议期间召开了中国园艺学会石榴分会第一届第二次
常务理事会。 常务理事会上，与会代表总结了分会去年的工
作进展情况，完善了分会的规章制度，研究和讨论了石榴分
会今后的工作开展方向。
研讨会上，以色列专家 Doron Holland、李文祥等 8 位代
表作了内容丰富的专题报告， 与会代表就我国石榴产业现
状、生产形势、存在问题、解决途径、新品种选育、种质资源研
究、基因克隆、石榴加工产业进展、产业管理经营等方面进行
了充分认真的交流讨论。
与会代表还参观了临潼区秦绿果业专业合作社、杨家村
无公害石榴生产基地和丹若尔石榴酒业有限公司。 在参观现
场，临潼区园艺站负责人介绍了全区石榴的生产、加工和销
售等情况，十余家石榴专业合作社举行了现场推介，与会代
表品尝了近年来临潼培育的优质石榴和研发的丹若尔系列
石榴酒、石榴汁，对临潼石榴产业发展给予了很高的评价。
本次大会还举行了中国园艺学会石榴分会第二届全国
石榴优质产品评奖活动， 其中果品类共评出果王奖 3 个，金
奖 4 个，银奖 6 个，优秀奖 14 个；加工品类共评出金奖 2 个，
银奖 3 个，优秀奖 4 个。 并进行了表彰。
这次会议的胜利召开， 促进了全国石榴行业的交流，加
强了我国石榴生产、教学、科研等的联系，有力地推动了生
产、贮藏、加工、运输、营销等的发展，极大的提升了石榴产业
在全国的影响。
（刘丽 中国农业科学院郑州果树研究所，450009）
中国园艺学会石榴分会年会暨
第二届全国石榴生产与科研研讨会在西安召开
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
也显示 MhWRKY15主要以无规则卷曲为主（图 3）。
3 讨 论
转录因子是结合在目的基因特定 DNA 序列上
的蛋白质， 通过增强或抑制基因的转录效率来调控
基因表达， 真核生物基因表达调控主要是在转录水
平进行。 WRKY 转录因子作为一种诱导型调节因
子，参与植物的多种防卫反应、生长发育调节以及物
质代谢调节等各种重要生理活动[3，7]。 研究通过生物
学信息学分析发现 MhWRKY15 编码蛋白存在磷酸
化、N 糖基化和 O 糖基化位点， 这表明磷酸化作用
或糖基化作用能够调节 MhWRKY15 转录因子。 蛋
白磷酸化作用由蛋白激酶催化完成， 是细胞信号转
导过程中的作用环节；磷酸化位点的存在，表明 Mh-
WRKY15 转录因子可受蛋白激酶调节，能够在细胞
信号转导过程中发挥作用。 事实上，WRKY 通过与
W-box 元件发生特异性结合，可调节启动子中含有
该元件的基因的表达，能够参与多种应答反应[2]。 因
此，MhWRKY15 会在平邑甜茶转录调控、 信号转导
及对胁迫应答等中起调节作用。
参考文献 References:
[1] RUSHTON P J， SOMSSICH I E， RINGLER P， SHEN Q J. WRKY
transcription factors[J]. Trends in Plant Science， 2010， 5（5）: 247-
258.
[2] PANDEY S P， SOMSSICH I E. The role of WRKY transcription fac-
tors in plant immunity[J]. Plant Physiology， 2009， 150: 1648-1655.
[3] CAI M， QIU D Y， YUAN T， DING X H， LI H J， DUAN L， XU C
G， LI X H， WANG S P. Identification of novel pathogen-responsive
cis -elements and their binding proteins in the promoter of Os-
WRKY13， a gene regulating rice disease resistance[J]. Plant， Cell &
Environment， 2008， 31: 86-96.
[4] VAN-VERK M C， PAPPAIOANNOU D， NEELEMAN L， BOL J F，
LINTHORST H J M. A novel WRKY transcription factor is required
for induction of PR-1a gene expression by salicylic acid and bacteri-
al elicitors[J]. Plant Physiology， 2008，146: 1983-1995.
[5] EULGEM T， SOMSSICH I E. Networks of WRKY transcription fac-
tors in defense signaling[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2007，
10: 366-371.
[6] ROSS C A， LIU Y， SHEN Q J. The WRKY gene family in rice （O-
ryza sativa） [J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2007， 49 （6）:
827-842.
[7] EULGEM T， RUSHTON P J， ROBATZEK S， SOMSSICH I E. The
WRKY superfamily of plant transcription factors[J]. Trends in Plant
Science， 2000， 5（5）: 199-206.
[8] RAN Kun. Cloning of vacuolar processing enzyme gene MhVPE in
Malus hupehensis （Pamp） Rehd. and its bioinformatics analysis[D].
Shandong: Shandong Agricultural University， 2009.
冉昆． 平邑甜茶 MhVPE 基因的克隆及其生物信息学分析 [D]． 山
东： 山东农业大学，2009.
·会 讯·
果 树 学 报 28 卷952