全 文 ：仲恺农业技术学院学报 , 21(4):17 ～ 21, 2008
JournalofZhongkaiUniversityofAgricultureandTechnology
文章编号:1006-0774(2008)04-0017-05
　
收稿日期:2008-03-15
作者简介:古碧珠(1983),女 ,广东东莞人 ,实验助理.　　＊通讯作者:Email:lhofice@yahoo.com.cn
石斛兰和秋花独蒜兰种子的原球
茎诱导及其生长分化
古碧珠 , 刘柏涛 , 何嘉碧 , 梁　红＊
(仲恺农业工程学院 生命科学学院 , 广东 广州 510225)
摘要:以石斛兰 (Dendrobiumnobile)和秋花独蒜兰 (Pleionmaculate)的干种子为材料 , 分别于 MS、 B5和 KC
液体培养基上诱导原球茎的形成.然后再于 MS, KC和 B5固体培养基中继续培养并观察其在不同培养基上的生
长发育情况.结果表明 , 两种兰花的种子在 B5液体培养基中诱导产生的原球茎最多;秋花独蒜兰原球茎在 KC
固体培养基上的成活率最高 , 幼苗生长发育状况最好;石斛兰原球茎在 B5固体培养基上的成活率最高 , 在 KC
固体培养基上的生长发育状况最好.表明兰花在不同的发育阶段需要的养分不同.因此 , 根据不同的快繁目标 ,
在兰花的不同生长发育阶段选用合适的培养基 , 对培养优良单株和建立高效无性繁殖系是非常必要的.
关键词:石斛兰 (Dendrobiumnobile);秋花独蒜兰 (Pleionmaculate);种子;原球茎;培养基
中图分类号:S682.31　　　　　文献标识码:A
InductionanddiferentiationofprotocormsofDendrobium
nobileandPleionmaculateondifferentmedia
GUBi-zhu, LIUBo-tao, HEJia-bi, LIANGHong
(ColegeofLifeSciences, ZhongkaiUniversityofAgricultureandEngineering, Guangzhou510225, China)
Abstract:DryseedsofPleionmaculateandDendrobiumnobilewereculturedonMS, B5 andKCliquid
mediaforinducingprotocorms, andtheprotocormsweresubculturedonMS, B5 andKCsolidmediafor
observingprotocormdiferentiation.Theexperimentalresultsshowedthatprotocormsfromtheorchid
seedsoftwospeciesculturedonB5 mediumweremost.ProtocormsofPleionmaculateonKCmedium
wereofthehighestviability, anddevelopedbest.ProtocormsofDendrobiumnobileonB5mediumwereof
thehighestviabilityanddevelopedbestonKCmedium.Thepresentstudysuggestedthatorchidseedling
indiferentstagesofdevelopmentrequireddiferentnutrients.Selectionofoptimummediafororchidsin
diferentculturestagesiscrucialtoobtainexcelentplantstrainsandestablishclonesofhighproductivity.
Keywords:Dendrobiumnobile;Pleionmaculate;seed;protocorm;culturemedium
　　石斛 (Dendrobium)泛指兰科石斛属 (Dendrobium)植物 , 在我国有着悠久的栽培历史 , 其种类繁
多 , 不仅花形美丽 、 花色鲜艳 , 且具有迷人的香味 , 在观赏兰花中被列为上品.由于花卉和中药材市场的
需求 , 导致一些野生种类进入市场 , 加之石斛种子细小 , 萌发需要共生菌等限制 , 自然繁殖率极低 , 致使
野生资源消耗加快 , 濒临枯竭的危险 [ 1-2] .
秋花独蒜兰 (Pleionmaculate), 是独蒜兰 (Pleion)的原生种.而独蒜兰是兰科独蒜兰属 (Pleion)
多年生 、半耐寒 、附生的一种小型兰花 , 主要分布在我国东南各省区海拔 600 ～ 1 200 m的垂直地带 , 常
见生长于湿润的悬崖峭壁 , 假鳞茎埋于伴生的苔鲜或岩石表面枯枝落叶半分解的有机质层中 [ 3] .
由于两种兰花的种子极之细小 , 粒重仅 0.3 ～ 6.5 μg, 长约 1mm, 直径 0.1 ～ 0.2 mm, 呈两头尖中间
圆的长纺锤形 , 内含一发育不完全的球形胚 , 无胚乳 , 在自然条件下很难萌发且成活率低.所以在自然
界 , 兰花种子虽然可以发芽 , 但能成苗的却很少 [ 4] .
早在上世纪中叶 , L.knudson等即建立和完善了兰花的快速繁殖技术 [ 1] 246-256.大部分兰花的种子可
以通过处理 , 以无菌萌发的方式进行萌发建立无性繁殖系[ 5-9] .但是对许多中国原产特别是中国特有的野
生兰花来说 , 通过无菌萌发建立无性繁殖系还存在着一定的困难 , 特别是组培繁殖的速度太慢 , 不能满足
商业化生产的要求.为此 , 作者对石斛兰和秋花独蒜兰种子无菌萌发和不同生长发育情况进行观察 , 以期
从培养基及培养条件选择方面为优化其快速繁殖的技术体系提供依据.
1　材料与方法
1.1　材料
石斛兰和秋花独蒜兰干种子由美国夏威夷大学 Sagawa博士馈赠 , 试验前该干种子已置培养皿中在室
温下存放一年以上.
MS、 B5、 KC培养基根据标准配方自行配制.
1.2　方法
以 MS、 B5和 KC3种基本培养基分别进行干种子无菌萌发.培养方式分为液体摇瓶培养 (150 r/
min)和固体培养.培养条件为黑暗 , 26±2 ℃, 培养 45 d后调查种胚萌发率.
将种子轻轻倒入 25mL针筒里 , 抽取体积分数 0.6%的次氯酸钠溶液 10 mL, 来回抽压针筒至所有的
种子沉浸在液体中.放置 10 min后排出次氯酸钠溶液 , 再吸液体培养基 5 mL浸洗种子 , 1 min后排出培
养液.将液体培养基 1 mL悬浮种子注入液体培养基中摇瓶培养.
45 d后挑选出大小均一 , 颜色嫩绿且未分化的原球茎 , 在无菌条件下接种到 3种固体培养基上 , 每瓶
接种 8个 , 每处理重复 4次.接种后置于 25±1 ℃培养室培养.光强 2 000lx, 每天光照 12h(8∶00 ～ 20∶
00).原球茎培养 7 ～ 14 d后 , 将培养基逐渐变褐的原球茎在无菌条件下转移到相同的新培养基上.
经过 60 d左右培养 , 原球茎将长出 2 ～ 3片叶 、 高度大于 1.5 cm的幼苗 , 将其转移至同种培养基中
再培养 60d, 统计原球茎的成活率 , 记录原球茎分化苗的叶数 、 茎高 、叶长 、根长和株高等.
2　结果与分析
2.1　不同培养基对原球茎诱导的影响
　　两种兰花的干种子接种到液体培养基中摇瓶培养 10 ～ 14 d后开始膨大 , 35 ～ 42 d后 , 种子变绿 , 发
育成原球茎 (图 1).其具体变化过程是先吸水膨胀 , 体积变大 , 然后种胚细胞分裂 , 透过种皮可以看到
增大的胚.随着种胚胀大 , 胚表层的细胞形状不规则 , 外壁加厚 , 种胚胎从合点端将种皮纵向胀破 , 成为
早期原球茎.
　　不同培养基 , 对秋花独蒜兰成熟干种子原球茎的诱导效果表现出很大的差异.B5液体培养基中种子
萌发率达到 7.3%, KC为 3.4%, 而 MS只有 1.1%, 可见 B5培养基更适合秋花独蒜兰无菌种子的萌发
(表 1).而石斛兰干种子在 B5培养基中的萌发率为 3.1%, 在 KC培养基上只有个别原球茎出现 , 在 MS
培养基上未见原球茎产生.总体萌发率偏低 , 可能是由于种子存放太久的缘故.
图 1　石斛兰不同发育时期的原球茎
Fig1　ProtocormsofDendrobiumnobileindiferent
developmentalstages
表 1　秋花独蒜兰干种子在不同培养基中的萌发情况
Table1　GerminationofPleionmaculateseedsindiferentmedia
培养基
Medium
培养种子数
Numberof
seeds
萌发数
Numberof
germination
萌发率
Germination
rate/%
MS 2 000 22 1.1
B5 2 000 145 7.3
KC 2 000 67 3.4
18 仲恺农业技术学院学报 第 21卷
2.2　不同培养基对原球茎生长的影响
秋花独蒜兰原球茎接种在固体培养基之后 , 前期生长缓慢 , 有些在培养过程中逐步褐化死亡.培养
35 d后 , 原球茎在 KC培养基上的成活率为 71.9%, MS上为 25.0%, 而 B5上仅为 21.9% (表 2).
秋花独蒜兰在 KC培养基上培养 20 d后原球茎大小从 2.5 mm增加到 5.8±0.3 mm, 在 MS上增加至
3.5±0.6 mm, 而在 B5上则只有 2.6 ±0.5mm(表 3).由此可见 , 在 3种培养基中 KC培养基最为适合
秋花独蒜兰原球茎的早期培养 , 其次为 MS, 最后为 B5.同时观察到在 KC培养基中的原球茎生长表现为
深绿色 , 生长旺盛 , 质量最好.
表 2　不同培养基对秋花独蒜兰原球茎成活率的影响
Table2　ViabilitiesofprotocormsofP.maculate
indifferentmedia
培养基
Medium
原球茎数
Protocorm
number
成活数
Viable
protocorm
成活率
Viability
rate/%
MS 32 8 25.0
B5 32 7 21.9
KC 32 23 71.9
表 3　秋花独蒜兰原球茎生长状况的比较
Table3　ComparisonofprotocormsofP.maculate
grownondiferentmedia
原球茎数
Protocorm
number
培养前原球茎直径
Protocormdiameter
beforeculture/mm
培养 20d后原球茎直径
Protocormdiameter20dafterculture/mm
MS B5 KC
32×3 2.5±0.3 3.5±0.6 2.6±0.5 5.8±0.3
显著性测验 P<0.5 0.10Significancetest significant insignificanthighlysignificant
表 4　石斛兰原球茎继代培养不同时期的成活状况
Table4　ViabilityofD.nobileindifferentgrowthstagesonMS,
B5andKCmedia
观察日期
Date
培养基
Medium
原球茎数
Protocormnumber
成活率
Viabilityrate/%
2005-1-18 MS 40 100
KC 40 100
B5 40 100
2005-2-7 MS 29 72.5
KC 37 92.5
B5 40 100
2005-2-28 MS 9 22.5
KC 26 65.0
B5 35 87.5
2005-4-30 MS 7 17.5
KC 18 45.0
B5 26 65.0
表 5　石斛兰原球茎在不同培养基的生长状况
Table5　GrowthofprotocormsofD.nobileondiferentmedia
培养基
Medium
株高
Height/cm
叶片数
Leafnumber
根数
Rootnumber
根长
　Rootlength/cm
MS 1.65 3.2 2.3 0.28
B5 1.63 3.5 1.3 0.43
KC 2.83 4.3 0.7 0.18
　　经过 3个多月的培养 , 石斛兰原球茎在
B5培养基上的成活率最高 , 达到 65%;其
次为 KC培养基 , 达到了 45%;而 MS培养
基最低 , 其最后的成活率仅为 17.5% (表
4).但在叶色方面 , KC上的幼苗为深绿
色 , MS和 B5上的为浅绿色.MS培养基上
的原球茎直径为 5.0±0.5mm, 但分化成苗
较迟;B5培养基上的原球茎直径为 3.4 ±
0.4mm, 分化成苗最快;KC培养基上原球
茎直径为 3.8±0.6 mm, 分化速度居中.
2.3　幼苗在不同培养基上的生长状况
培养 60d后 , 石斛兰原球茎在 3种不同
培养基上的生长状况明显不同.其中幼苗
株高 、 叶片数以 KC培养基的为最好 , 根数
在 MS培养基上较多 , 而根长则以在 B5培
养基上的为最长 (表 5), 幼苗则以 KC培
养基中的生长最快最好 , 叶色鲜绿 , 幼苗
较粗壮;B5培养基上的幼苗次之 , 而 MS
培养基上的长势最差 , 幼苗叶色淡黄且矮
小 (图 2).继续培养 30 d后观察其生根状
况 , 发现在 KC培养基上的幼苗根数少且短
小;B5培养基上幼苗的根最粗最长;而 MS
培养基上幼苗的根的数目最多 (图 3).
秋花独蒜兰的生长状况与石斛兰大体
相似.
19　第 4期 古碧珠 , 等:石斛兰和秋花独蒜兰种子的原球茎诱导及其生长分化
图 2　在 KC、 B5、 MS培养基上的石斛兰幼苗
Fig2　SeedlingsofD.nobilegrownonKC, B5 andMSmedium
图 3　石斛兰幼苗在 KC、 B5、 MS培养基上的生根状况
Fig3　RootsofD.nobilegrownonKC, B5 andMSmedium
2.4　玻璃苗及褐化苗
石斛兰在固体培养的后期 , 在 MS培养基上出现了 4棵玻璃苗 , 占总数的 50% (图 4).玻璃苗的出
现说明 MS培养基较为不适合石斛兰苗的生长.考虑到玻璃化的发生是不能很好适应不宜培养基和培养环
境的结果 , 是 “生长因子不平衡的产物” [ 10] , 因此在培养的后期应及时更换合适的培养基 , 以利于幼苗
生长.本试验中在 KC和 B5培养基上均未发现玻璃苗.
在 KC培养基上 , 一般接种 1周左右后 , 在石斛兰幼苗插入位置及其附近的培养基开始变褐变黑 , 如
果此时不及时切除培养基中褐化部分或更换新培养基 , 幼苗会逐渐变褐出现褐化现象 (图 5);在 MS培
养基中 , 一般接种 2周后才会出现此种情况;而 B5培养基一般一个月内基本都不变色.秋花独蒜兰培养
未发现褐化现象.
图 4　MS培养基上的石斛兰玻璃苗
Fig4　Hyalo-seedlingofD.nobileonMSmedium
图 5　石斛兰的幼苗褐化现象
Fig5　BrowningofD.nobileseedlingonMSmedium
3　讨论
　　目前用于石斛类植物组织培养的培养基有 MS、 KC、 N6、 B5、 C17、 SH、 KN、 VacinWent(VW)、
Winber(W)、 1 /2B5、 1/2 N6、 1/2 C17、 1/2 SH、 1/2 MS和 1 /2ZW等 , 但使用最多的是 MS.本试验比
较了 MS、 KC和 B5 3种不同类型基本培养基对石斛兰从干种子到幼苗生长发育过程的影响.发现不同的
培养基对石斛兰的不同发育阶段有促进或抑制的作用 , 即石斛兰在不同的发育阶段需要不同的培养基 ,
MS培养基对原球茎的诱导不利 , 但对于原球茎体积增大和生根有利;B5培养基有利于原球茎的诱导和分
化;KC培养基能促进幼苗的健壮生长.说明石斛兰在不同的发育阶段需要的养分是不同的.因此 , 在工
厂化育苗中 , 应根据幼苗生长发育的不同阶段 , 采用不同的培养基配方 , 促使幼苗的快速生长和培育健苗
壮苗.
20 仲恺农业技术学院学报 第 21卷
在试验过程中 , 幼苗出现了玻璃化和褐化的现象.前者可能是因为试管内空气湿度相对较大或由于试
管苗瓶口密封较严 , 瓶内外气体交换困难所造成的;而褐化现象则可能是因为受伤细胞分泌多酚氧化酶氧
化酚类物质成醌 , 叶片在叶缘部位渗出褐化物 , 并逐渐在培养基中扩散造成的 [ 10 -11] .
试管苗褐化现象是植物组织培养中独有的现象 , 这与组培培养过程中诸多因数有关 , 如在接种时外植
体处理不当 , 会使其氧化变褐和不利于愈伤组织诱导 , 而温度 、不同外植体 、 2, 4-D含量 、 培养基种
类 、继代次数以及培养基中的附加成分等 , 都可能对组织培养过程中的变褐现象产生影响[ 12] .
种子无菌培养过程中使用不同的培养基对秋花独蒜兰原球茎的分化及生长有较大的影响.本试验结果
表明 , B5培养基有利于原球茎的诱导但不利于原球茎的生长分化;MS培养基不利于原球茎诱导 , 但可用
于原球茎的继代培养;在 KC培养基中的原球茎生长最快最好 , 其直径由培养前的 2 ～ 3 mm增大到 5 ～
6 mm, 净增了一倍 , 是最有利于原球茎膨大生长的培养基.KC培养基盐类含量低 , 微量元素只有锰盐 ,
不含维生素 , 而且 pH值较小.由此可知 , 低盐 、 pH值小有助于原球茎的生长.经培养 90 d后 , 原球茎
在 KC培养基上的成活率最高 , 且幼苗健壮 、旺盛 , 说明在 3种培养基中 , KC培养基是最适合秋花独蒜兰
原球茎分化及幼苗生长.而 B5培养基中幼苗的根长得最壮 , 说明根的良好生长应选择硝态氮 、 硝酸钾含
量较高的培养基.
目前 , 国内外兰花野生资源愈来愈少 , 优良品种更加珍贵.因此 , 掌握好兰花种胚的培养技术 , 不仅
可缩短育种年限 , 而且能更好地进行品种间 、 种间及属间的杂交育种 , 培育出更多优质的兰花品种.
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【责任编辑　徐　妍】
21　第 4期 古碧珠 , 等:石斛兰和秋花独蒜兰种子的原球茎诱导及其生长分化