全 文 ：　山 东 农 业 科 学　2010, 6:5 ～ 9 ShandongAgriculturalSciences
收稿日期:2010-03-02
基金项目:山东省自然科学基金资助项目(Y2007D08);十一五科技支撑重点项目(2008BADA4B05)
作者简介:史兴征(1986-),女 ,硕士研究生 ,研究方向为果树生理。 E-mail:shixingzheng2007@ 163.com
＊通讯作者, E-mail:pft@sdau.edu.cn
平邑甜茶非共生血红蛋白基因 GLB1
的克隆 、表达及转化研究
史兴征 ,彭福田＊ ,王新亮 ,王兆燕 ,赵　玉
(山东农业大学园艺科学与工程学院 /作物生物学国家重点实验室 , 山东 泰安　271018)
　　摘　要:根据 GenBank上苹果 GLB1基因的 EST序列设计引物 , 利用 PCR技术克隆到平邑甜茶 GLB1同
源基因 MhGLB1(GenBank注册号:GQ423619),该基因包含一个 477 bp的开放阅读框 ,编码 158个氨基酸 , 分
子量为 17.8 ku。成功构建了 35S∷MhGLB1正义表达载体 , 并对 “S以 12粉”番茄进行农杆菌介导的遗传转
化。荧光定量 PCR结果显示 , MhGLB1在根 、茎 、叶中均有所表达 , 但在根中的表达量最高;NO-
3
和 SNP处理
能够诱导根中 MhGLB1的表达。
关键词:平邑甜茶;MhGLB1;基因克隆;转基因
中图分类号:Q78;S661.4　　文献标识号:A　　文章编号:1001-4942(2010)06-0005-05
StudyonCloning, ExpressionandTransformationofNonsymbiotic
HemoglobinGeneGLB1 fromMalushupehensisRehd.
SHIXing-zheng, PENGFu-tian＊ , WANGXin-liang, WANGZhao-yan, ZHAOYu
(CollegeofHorticultureScienceandEngineering, ShandongAgriculturalUniversity/
StateKeyLaboratoryofCropBiology, Taian271018, China)
Abstract　BasedontheESTsequenceofGLB1 fromappleinGenBank, theprimersweredesignedfor
PCR, andthenthegeneMhGLB1 wasclonedfromMalushupehensis, whoseaccessionnumberwasGQ423619
inGenBank.Theful-lengthcDNAcontaineda477 bpopenreadingframeencodinga17.8 kuproteinwith
158 aminoacids.Itssenseexpressionvectorwasalsoconstructedas35S∷MhGLB1, whichcouldbesuccess-
fulyusedforgenetictransformationmediatedbyAgrobacteriumtumefaciensintotomato.Thequantitativereal-
timePCRanalysisshowedthatMhGLB1 expressedinroots, stemsandleavesofMalushupehensis, buttheex-
pressionlevelwasthehighestinroots.ThetreatmentsofNO-3 andSNPcouldinduceitsexpresioninroots.
Keywords　Malushupehensis;MhGLB1;Genecloning;Transgene
　　血红蛋白 (Hemoglobins, Hbs)最初是在动物
中发现的 ,在血液中起运输氧气 、维持血液酸碱平
衡 、活化组织细胞 、增强自身免疫 、抗菌等功
能[ 1] 。而植物血红蛋白发现的较晚 , 1939年 Ku-
bo首次在豆科植物固氮根瘤中发现了血红蛋白 ,
后来人们把它定名为豆血红蛋白 。之后 , Appleby
等从一种与根瘤菌共生的榆科植物 Parasponia
andersoni中分离出植物 Hbs,并证实 P.anderso-
ni拥有一个编码共生 、非共生 Hbs的双重功能基
因。后来 , Landsmann等在非豆科植物山麻黄中
发现了 Hbs的表达 。进一步的研究证实 ,单子叶
植物大麦及其他禾本科植物如玉米 、小麦 、黑麦 、
水稻中也存在植物 Hbs。这些发现表明植物血红
蛋白在植物中广泛存在 ,而并非仅限于豆科植物 ,
并可能具有共生固氮以外的功能 。
平邑甜茶(MalushupehensisRehd.var.pingy-
DOI :10.14083/j .i ssn.1001 -4942 .2010.06.001
iensisJiang)是我国特有的植物种 ,广泛用作苹果
砧木;它具有高度无融合生殖能力 ,实生苗个体一
致性非常好 ,易于检测处理间的差异。本文以平
邑甜茶一年生实生苗新根为试材 ,成功克隆了
MhGLB1全长基因 ,并构建了正义表达载体 ,利用
农杆菌介导的方法进行了 “S以 12粉”番茄的遗
传转化 ,为进一步探索平邑甜茶 MhGLB1基因在
平邑甜茶生长发育中的作用奠定基础。同时利用
荧光定量 PCR法测定了 MhGLB1在平邑甜菜根 、
茎 、叶中的表达 。
1　材料与方法
1.1　材料 、菌种及试剂
平邑甜茶新鲜幼根采自一年生实生苗 ,采集
后的幼根经清洁处理后置 -70°C保存备用 。基
因转化受体为 “ S以 12粉 ”番茄。大肠杆菌
(Escherichiacoli)DH5α和农杆菌 (Agrobacterium
tumefaciens)LBA4404菌株 、植物表达载体 PBI121
由本实验室保存;DEPC、Tris等 RNA提取试剂为
上海生工生物工程公司产品;限制性内切酶 、Taq
DNA聚合酶 、T4 DNA连接酶 、胶回收试剂盒 、
Marker、pMD18-Tvector购自宝生物工程(大连)
有限公司;DNA测序与引物合成由 Invitrogen公
司完成。
1.2　MhGLB1全长基因 PCR扩增
平邑甜茶新根中总 RNA的提取采用 CTAB
法(Chang等 , 1993)进行 ,按照 SMARTTM RACE
cDNAAmplicatingKit的说明书进行 cDNA第一
条链的合成。根据 GenBank上苹果 GLB1基因的
EST序列(AY224132),设计特异引物(上游引物
sp1:5′-GCGGATCCATGGAAGGCAAAGTTTTC-
3′, 下游引物 sp2:5′-GCGAGCTCCTAATTA-
AGGGGAGGCTTCAT-3′)进行 PCR扩增 。 PCR
产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳后 ,按照琼脂糖凝
胶 DNA回收试剂盒说明回收目的片段 。回收的
PCR产物与 pMD18 -T载体 16℃连接 4 h,转化
大肠杆菌 DH5α,对 Ampicilin(Amp)抗性的转化
菌落进行 PCR检测 ,筛选出的阳性克隆进行测
序。
1.3　MhGLB1正义表达载体的构建
以含有 MhGLB1编码区序列的 pMD18 -T载
体为模板 ,用引物 M13 -48和 sp2进行 PCR扩
增 ,筛选出含有 MhGLB1编码区正向插入 pMD18
-T载体的菌落 , 采用碱裂解法提取质粒 , 用
BamHⅠ和 SalⅠ进行双酶切 ,反应条件是 37℃、3
h,经 1%的琼脂糖凝胶电泳 ,回收 MhGLB1目的
基因 。同时 ,用 BamHⅠ和 SalⅠ双酶切植物表达
载体 PBI121, 电泳回收载体片段 。回收的 Mh-
GLB1目的基因与 PBI121在 T4 DNA连接酶的作
用下连接过夜 ,转化大肠杆菌 DH5α,通过 PCR和
双酶切进行鉴定。
1.4　番茄的遗传转化
利用冻融法将构建的植物表达载体导入农杆
菌 LBA4404 ,再通过农杆菌介导叶盘法(王关林
和方宏筠 , 2002)转化 “S以 12粉”番茄 。 PCR检
测阳性的再生植株移至田间进行常规栽培。
1.5　荧光定量 PCR
取平邑甜茶种子 ,消毒层积后 ,播于洗净消毒
的河沙中。当幼苗第 6片真叶刚出现时 ,将其转
移到含 10 mmol/LKNO3的 Hoagland营养液中处
理 2、 6、 12 h, 以 KCl或 NH4Cl作对照;于含 1
mmol/LSNP(硝普钠)的 Hoagland营养液中处理
2、4、8 h;低氧胁迫下处理 12、24 h,然后将根 、茎 、
叶分离后迅速用液氮冷冻后置于 -80℃保存备
用。
采用 TaqMan探针法进行荧光定量 PCR反
应 ,使用 PrimerExpress软件设计引物和探针。引
物 GLB1 -F:CGCATTGTTGGAAACCATAAAG,
GLB1 -R:TCATAAGCTTCTCCCCATGCA。探针:
fma+AGGCCTTACCGGAAATGTGGTCA +tamra。
以 18SrRNA作为管家基因 。
2　结果与分析
2.1　MhGLB1编码基因克隆及同源性分析
以平邑甜茶新根 cDNA为模板 ,采用 PCR扩
增得到一个 477 bp的产物(图 1)。该基因编码
158个氨基酸 ,分子量为 17.8 ku。
利用 CLUSTAL X ver.1.8 软件 (htp://
align.genome.jp/clustalw)将拟南芥 、玉米 、大麦 、
番茄 、棉花等其它植物 GLB1基因与 MhGLB1的
氨基酸序列进行系统进化树分析 ,发现 MhGLB1
与梨 GLB1的同源关系最近(图 2)。用 DNAMAN
软件分析 , 平邑甜茶 MhGLB1氨基酸序列与梨
GLB1基因有 95.57%的同源性。平邑甜茶与其它
6 山 东 农 业 科 学　　　　　　　　　　　　　　2010年　
植物血红蛋白氨基酸序列的同源性分析见表 1。
M:标准分子量;1、2:PCR产物
图 1　MhGLB1编码区
注:括号内为 GenBank登录号。
图 2　MhGLB1与其它植物 GLB1基因的进化树分析
　　表 1　　平邑甜茶与其它植物血红蛋白氨基酸
　　序列的同源性比较
植物种类 编码氨基酸数(个)
序列同源性
(%)
GenBank
登录号
平邑甜茶 158 100 GQ423619
葡萄 168 76.94 XM 002284648
梨 158 95.57 AY224133
橘子 183 65.76 AY026338
拟南芥 160 76.40 NM 127165
番茄 152 75.32 AY026343
马铃薯 152 74.68 AY151389
苜蓿 160 80.12 Q9FVL0
大麦 162 73.01 Q42831
小麦 162 71.17 AY151390
玉米 152 71.69 NM 001111496
水稻 169 67.65 NM 001055972
棉花 163 82.82 AY899302
大豆 161 79.50 U47143
2.2　MhGLB1正义表达载体的构建及番茄的遗
传转化
将构建的表达载体用 BamHⅠ和 SalⅠ双酶
切 ,酶切结果表明 MhGLB1已经插入到 PBI121载
体中 。将含有重组质粒的菌落进行 PCR扩增 ,扩
增产物进行测序 ,测序结果与 MhGLB1的编码区
序列完全一致 ,表明表达载体构建成功。将构建
好的 PBI121 -MhGLB1重组质粒经冻融法转入农
杆菌 LBA4404中。叶盘法转化番茄 “S以 12
粉”,对得到的 7棵抗性植株进行 PCR检测(上游
引物:35S,下游引物:sp2),有 5株转基因植株通
过 PCR扩增出与阳性对照同样大小的片段 ,而未
转化植株则无特异性扩增条带 , 初步证明 Mh-
GLB1基因已经转入番茄植株的基因组中 ,部分检
测结果如图 3。 PCR检测呈阳性的幼苗移至田间
栽培 。
M:标准分子量;1～ 7:转基因番茄;WT:未转基因番茄
图 3　转 MhGLB1基因番茄再生植株的 PCR检测
2.3　荧光定量 PCR
采用荧光定量 PCR方法分析 MhGLB1的表
达特性 。结果显示 , MhGLB1在根 、茎 、叶中均有
表达且在根中的表达量最高(图 4)。由图 5可以
看出 , NO-3 处理能诱导 MhGLB1在根 、茎 、叶中的
表达 。由图 6可以看出 , SNP能够诱导 MhGLB1
在根中的表达 。
图 4　荧光定量 PCR分析 MhGLB1
　　　在不同组织中的表达
7　第 6期　　　史兴征等:平邑甜茶非共生血红蛋白基因 GLB1的克隆 、表达及转化研究
图 5　荧光定量 PCR分析 NO-3 处理
对 MhGLB1表达的影响
图 6　荧光定量 PCR分析 SNP处理
　　　 对 MhGLB1在根中表达的影响
3　讨论与结论
1997年 Trevaskis克隆了拟南芥的两个血红
蛋白基因 AtGLB1、AtGLB2。低氧胁迫下 , AtGLB1
在根和叶中都有表达;AtGLB2受低温的诱导在叶
中有少量表达 。
本研究中以平邑甜茶新根为材料成功克隆了
GLB1的同源基因 MhGLB1。系统进化树分析显
示 MhGLB1与梨的 GLB1基因的同源关系最近 。
为了确定 MhGLB1的功能及表达方式 ,成功构建
了 35S∷MhGLB1正义表达载体 , 并对 “S以 12
粉”番茄进行了农杆菌介导的遗传转化 。
NO是水溶和脂溶性的气体 ,在植物中具有
多种生物学功能 ,可以作为一种信号分子 [ 4 ～ 9] 。
NO还直接参与了生物和非生物胁迫下的反应 ,
比如干旱 、盐胁迫 、高温胁迫 、低氧胁迫 、病原菌入
侵以及细胞程序化死亡 [ 12 ～ 17] 。 NO对于细胞既
可以作为一种保护剂 ,有时又具有毒害作用 ,这都
要依赖于 NO的浓度 、植物种类以及发育阶
段[ 10, 11] 。对 NO在各种有机体中的生物学特性的
研究非常多 ,但对 NO的研究最重要的是其与血
红蛋白相互作用的研究 。
Hunt2002年将 GLB1在拟南芥中超表达 ,发
现 GLB1超表达的拟南芥植株对低氧胁迫的抗性
增强了 ,而且这抗性还依赖拟南芥血红蛋白的配
体结合能力[ 2] 。 1998年 Nie等将大麦的血红蛋
白转入玉米细胞中 ,得到不同血红蛋白含量的株
系 ,他们发现超表达大麦血红蛋白的玉米细胞在
低氧环境下也能够通过氧化 NADH促进糖酵解
途径 ,增强底物磷酸化水平 ,维持细胞的能量水
平。 2003年又将大麦血红蛋白转入紫花苜蓿的
根培养物中 ,得到不同大麦血红蛋白表达水平的
根培养系 。他们发现三个不同大麦血红蛋白水平
的根培养系在低氧胁迫下都能够产生 NO,且 NO
水平与血红蛋白的含量负相关。由此他们对低氧
胁迫下血红蛋白的作用提出了一个假设 ,即血红
蛋白可能调节植物细胞内的 NO水平。最近 Per-
azzoli等的实验证明了这一假设 。研究表明拟南
芥的血红蛋白 1通过与 NO形成 S-亚硝基血红
蛋白来清除拟南芥细胞体内的 NO。但这一反应
并不影响病原体入侵时 NO介导的超敏反应[ 3] 。
本研究采用荧光定量 PCR方法确定 MhGLB1
在平邑甜茶根 、茎 、叶中均有表达且在根中的表达
量最高 。 NO-3 能够诱导平邑甜茶根 、茎 、叶中
GLB1基因的表达 ,且 mRNA的积累达到高峰的
时间不同 ,根中的 mRNA在 2 h内就能达到最大
值。 NO释放剂 SNP同样能够有效诱导 GLB1基
因在根中的表达。
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