全 文 ：中国农业科学 2008,41(5):1548-1553
Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2006-12-25；接受日期：2007-03-12
基金项目：国家自然科学基金（30571285，30671452）和高校博士点基金（20050430009）资助项目
作者简介：孙旭东（1979-），男，山东莱西人，硕士研究生，研究方向为果树生理学。Tel：0538-8249304。通讯作者杨洪强（1965-），男，山东泗水
人，教授，研究方向为果树生理学。Tel：0538-8249304；E-mail：hqyang@sdau.edu.cn



平邑甜茶新根扩展蛋白基因MhEXP1的 cDNA全序列克隆及表达
孙旭东，杨洪强，魏绍冲，徐慧妮，张鑫荣，段凯旋
（山东农业大学园艺科学与工程学院，山东泰安 271018）

摘要：【目的】对平邑甜茶[Malus hupehensis（Pamp）Rehd. var pinyiensis Jiang]新根扩展蛋白基因进
行克隆和表达分析，为揭示扩展蛋白在平邑甜茶根系生长发育中的功能打下基础。【方法】利用 RT-PCR 结合 RACE
技术克隆扩展蛋白同源基因，并通过 Northern 杂交研究其在不同器官中的表达情况及吲哚丁酸（IBA）的处理效
应。【结果】成功地从平邑甜茶白色新根中获得了一个全长的扩展蛋白基因，命名为 MhEXP1，GenBank 登录号为
DQ538346。MhEXP1 cDNA 全长 1 111 bp，含有 771 bp 的完整开放阅读框，编码 257 个氨基酸，预测分子量和等电
点分别为 27.8kD 和 8.9。序列分析表明，MhEXP1 具有扩展蛋白的典型结构，即氨基酸序列 N端有８个半胱氨酸残
基，1 个组氨酸（His-Phe-Asp，HFD）域，C 末端存在 4 个保守的色氨酸残基。Northern 杂交表明，该基因在平
邑甜茶叶片中表达量很低，但在新根中大量表达并受 IBA 诱导，且随着 IBA 处理时间的延长表达量逐渐增加。【结
论】成功地从平邑甜茶中克隆了一个全长的扩展蛋白基因 MhEXP1，该基因在叶片中表达量很低但在新根中大量表
达，并受 IBA 诱导；MhEXP1 参与 IBA 调节的平邑甜茶根系生长发育。
关键词：平邑甜茶；扩展蛋白；cDNA 克隆；序列分析及表达；吲哚丁酸

Cloning and Expression of a Full-length cDNA of Expansin Gene
from New Root of Malus hupehensis Rehd.
SUN Xu-dong, YANG Hong-qiang, WEI Shao-chong, XU Hui-ni, ZHANG Xin-rong, DUAN Kai-xuan
(College of Horticultural Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, Shandong)

Abstract: 【Objective】 The aim of this research is to clone and investigate the expression of the expansin gene from new root
of Malus hupehensis (Pamp) Rehd. var pinyiensis Jiang, which will be helpful to study the action of expansin gene in root
development. 【Method】 With the RT-PCR and RACE methods, a full length cDNA sequence of expansin gene was cloned in root
of Malus hupehensis (Pamp) Rehd. The expression of expansin gene was analyzed by Northern blot.【Result】 Sequencing and
structural analysis showed that the full-length of MhEXP1 consisted of 1 111 bp with an open reading frame of 771 bp that could
code for a protein of 257 amino acids. The predicted MW and PI were 27.8 kD and 8.9. The polypeptide had a N-terminal signal
peptide of 23 amino acids like many other expansins. Essential features of the protein such as the eight cysteine residues and four
tryptophan residues near the C-terminal end are conserved in the sequence. The HFD sequence, which has been shown to be a part of
the endoglucanase active site is also present in MhExp1. Northern blot showed that the expression of MhEXP1 gene was much higher
in roots than that in leaves. The transcriptional level of the MhEXP1 gene in the roots of Malus hupehensis (Pamp) Rehd increased
by 10 µmol/L IBA treatment for 6 h.【Conclusion】All of the results indicated that the obtained gene of MhEXP1 is a new member of
expansin gene family. The expression of MhEXP1 gene is much higher in roots than that in leaves. The transcription of MhEXP1 is
regulated by IBA and it plays an important role in root development of Malus hupehensis (Pamp) Rehd.
Key words: M. hupehensis Rehd. var pingyiensis Jiang; Expansin; cDNA cloning; Sequence analysis and expression; IBA
5 期 孙旭东等：平邑甜茶新根扩展蛋白基因 MhEXP1 的 cDNA 全序列克隆及表达 1549
0 引言
【研究意义】平邑甜茶[Malus hupehensis（Pamp）
Rehd. var pingyiensis Jiang] 属于湖北海棠 [Malus
hupehensis （Pamp）Rehd]的一个类型，原产于山东
省沂蒙山区，是中国特有的植物资源，常用作苹果和
观赏海棠的砧木[1]。砧木根系的生长发育状况对于嫁
接植物的养分和水分吸收以及环境适应性等有重要影
响，从分子水平上探讨根系生长发育机理，可以为通
过基因工程手段或栽培措施有目的地调控根系生长提
供理论依据。同时，平邑甜茶具有很强的无融合生殖
能力，实生后代遗传组成一致，个体差异非常小，是
很好的研究试材[2]。【前人研究进展】1989 年，Cosgrove
研究小组在黄瓜下胚轴中发现了一种蛋白质，该蛋白
质能在离体条件下使植物细胞壁松弛和快速缓释细胞
壁张力[3]，因而，被命名为扩展蛋白（expansin）[4]。
扩展蛋白参与细胞壁的松弛扩展和细胞的增大[5~9]，在
胚轴生长[4,10,11]、胚芽生长[24]、根原基和根毛形成[12,13]、
根系向地性[12,14]、叶原基形成[15,16]、果实成熟和软化[17~21]
及花粉管生长[5]等方面起着重要作用。2001 年，Wu
等[22]报告玉米初生根扩展蛋白基因在低水势下转录
增强。2003 年，Lee 等[23]发现大豆根系扩展蛋白基因
GmEXP1 特异性表达与根系生长密切相关，这些研究
表明扩展蛋白与根系生长发育有密切关系。吲哚丁酸
（IBA）可以调节植物根系的生长发育，明显增加苹
果砧木新根总量，促进根系加长生长[24]。【本研究切
入点】平邑甜茶是中国特有的木本植物资源，揭示平
邑甜茶根系生长发育的分子机理，对于资源利用和果
树生产都具有重要意义，但这方面的研究鲜见报道。
本研究从平邑甜茶根系扩展蛋白基因的克隆入手，比
较扩展蛋白在根系和叶片中的表达，探讨 IBA 对扩
展蛋白基因表达的影响，以期更好地认识根系生长发
育的本质和调控根系发育。【拟解决的关键问题】克
隆平邑甜茶扩展蛋白基因全长序列，揭示扩展蛋白基
因在根系和叶片的表达差异以及该基因对 IBA 的响
应。
1 材料与方法
1.1 材料与处理
试材为两年生平邑甜茶实生苗，克隆受体大肠杆
菌菌株为 DH5α，克隆载体 pMD-19T vector、限制性
内切酶、LA-Taq 酶为大连宝生物产品，胶回收试剂
盒购自上海生物工程技术服务有限公司，氨苄青霉素、
琼脂糖为 Sigma 公司产品，Northern 杂交所用 Dig
Northern Starter Kit 试剂盒购于 Roche 公司，其余试剂
均为国产分析纯。
研究基因表达时，选取生长势一致实生苗，在去
离子水中清洗过渡 3 h 后，转移到 0 µmol·L-1（对照）、
10 µmol·L-1、20 µmol·L-1、30 µmol·L-1 IBA 处理液中，
处理 6 h 进行浓度试验；同时将 10 µmol·L-1的 IBA 处
理时间设定为 0、1、3、6、12 h，进行基因表达对 IBA
处理时间的响应研究；处理后取白色新根和叶片，液
氮速冻、－70℃保存备用。
1.2 RNA 的提取
所有植物材料 RNA 用 CTAB 法提取[25]。
1.3 平邑甜茶新根 MhEXP1 基因克隆
参照 GenBank 登录的植物扩展蛋白基因的 cDNA
序列，在其保守区内设计合成 2 条上游半巢式 3RACE
引 物 P1 ： 5-AC(A/C)ATGGG(A/G/T)GGAGCTTG
TGG-3，P2：5-GC(C/T) CA(C/T)GC(A/C/T)AC(C/T)
TT(C/T)TA(C/T)GG-3 ； 下 游 引 物 为 B26 ：
5-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTT
TTT-3′；反转录按照 MBI 反转录试剂盒操作说明进行
操作。先用 P2 和 B26 进行第一轮扩增，将扩增产物
稀释后用引物 P1 和 B26 进行第二轮扩增。第一轮反
应条件为 94 5 min℃ ；94 45 s℃ ；48 60 s℃ ；72 60 s℃ ，
共 20 个循环，最后一次循环结束后 72℃延伸 10 min。
第二轮反应条件为 94 5 min℃ ； 94 45 s℃ ；55 60 s℃ ；
72 60 s℃ ，共 30 个循环，最后一次循环结束后 72℃
延伸 10 min。将扩增产物从 1%琼脂糖凝胶回收后，
连接到 pMD19-T 载体上，转化大肠杆菌 DH5α感受态
细胞，经 P C R 和限制性内切酶酶切验证后送上海生
工生物技术公司测序。通过 5RACE 得到这个基因的
5端。5RACE 引物为 MS1：5-TGGAAGATCAAAATT
GGGAGGAC-3、MS2：5-TTTGGAACAGGACGGGG
ATGA-3和 AAP。采用 Touch-down PCR 反应扩增，
条件为，第一轮 PCR：94 5 min℃ ，94 45 s℃ ，65 45 ℃
s，每个循环降温 0.5℃，72 60 s℃ ，共 20 个循环，最
后 72℃延伸 10 min。第二轮 PCR 以第一轮产物稀释
20 倍后取 1 µl 为模板，扩增条件为 94 5 min℃ ，94 ℃
45 s，55 45 s℃ ，72 60 s℃ ，共 30 个循环；72 10 min℃ 。
然后根据所得到的序列设计特异的 5端引物 FM1：
5-ATGGCGAAGCTC TTTTTTCCATTA-3和3端引物
RM2 ： 5-CCACCACCGGCTTAATTATGAGAAC-3
进行 PCR 扩增，得到 MhEXP1 基因编码区全长序列。
测序结果用 Blast 软件和 DNAMAN 软件进行序列比
1550 中 国 农 业 科 学 41 卷
较分析。
1.4 MhEXP1 基因 DIG 核酸标记的 RNA 探针制备
根据 MhEXP1 基因设计一对特异引物，FMS1：
5-TGGCATCATCCCCGTCCTGTTC-3′ 和 RMS1 ：
5-taatacgactcactatagggAAATGTGGCGGGCTGCCTCT
T-3，在下游引物 RMS1 5端加上 T7 启动子。PCR 反
应程序如下：94 5 min℃ ，94 45 s℃ ，59 45 s℃ ，72 ℃
45 s，共 30 个循环，最后 72℃延伸 10 min。获得的探
针序列的长度为 446 bp。按照 Dig Northern Starter Kit
说明书进行转录并检测探针的浓度。
1.5 Northern 杂交
将各处理材料提取的总RNA约 15 µg在甲醛变性
凝胶上电泳分离后，转到 Hybond N+尼龙膜上。采用
地高辛（DIG）核酸标记和检测试剂盒（Roche，德国）
中的杂交液在杂交炉内 68℃预杂交 30 min，将尼龙膜
转移到加有探针的杂交液中杂交过夜，杂交结束后进
行检测。
2 结果与分析
2.1 平邑甜茶白色新根 MhEXP1 全长 cDNA 的克隆
利用半巢式扩增得到一条大小约为 1 kb 的片段，
同源性比较发现，此 cDNA 序列与大豆 EXP1 相应片
段的同源性为 66.9%，推导的氨基酸序列与已知 EXP
蛋白的同源性高达 84.9%，由此可以推断其为平邑甜
茶 EXP 的基因片段，命名基因为 MhEXP1。随后经过
5′RACE 获得一条约 300 bp 大小的条带，测序表明它
是 EXP5端序列。为确保该 3端和 5端为同一基因的
两段序列，在拼接序列起始密码子和终止密码子附近
设计一对特异引物，PCR 扩增获得目的条带，测序结
果与拼接的 3端和 5端结果完全吻合。
2.2 MhEXP1的序列分析
本试验得到的MhEXP1基因的cDNA全长1 111 bp
（图1），编码257个氨基酸，预测分子量和等电点分别
为27.8 kD和8.9。该蛋白具有扩展蛋白的典型结构[6]，
即氨基酸序列N端有８个半胱氨酸残基，中间区域有1
个组氨酸（His-Phe-Asp，HFD）域，C末端存在4个保
守的色氨酸残基，N末端有一段信号肽序列（通过http:
//genome.cbs.dtu.dk/services/signalP分析得到）。将不同
的植物扩展蛋白用 DNAMAN 软件的phylogenetic-tree
进行系统进化树分析（图2）。结果显示，MhEXP1属
于EXPA第Ⅴ进化枝，同源性较高的序列均为EXPA，
其中同源性最高的是大豆[23]，在氨基酸和核苷酸水平
上的一致性分别为79%和80%。与属于第三进化枝的
苹果果实扩展蛋白MdoEXP1同源性为60%，由此可以
断定，MhEXP1基因是扩展蛋白家族的一个新成员，
并在GenBank注册，序列号为DQ538346。



8 个*代表 N-末端保守的半胱氨酸残基；4 个＃代表 C-末端保守的色氨
酸残基；HFD 代表葡聚糖酶活性位点；阴影部分为 N-末端的信号肽；
黑点代表终止子
* stands for eight conserved eight cysteine residues in C-terminus; ＃
stands for four conserved tryptophan residues in C-terminus; HFD stands
for a part of endoglucanase active site; Blade stands for N-terminal signal
peptide; Dot stands for terminator

图 1 平邑甜茶新根 MhEXP1 cDNA 的核苷酸序列及推导的氨
基酸序列
Fig. 1 Nucleotide sequence of full-length MhEXP1 cDNA
and deduced amino acid sequence

2.3 MhEXP1 基因在平邑甜茶根叶中的不同表达
平邑甜茶白根和叶片Northern杂交结果见图3。由
图3可看出，平邑甜茶根系和叶片MhEXP1基因的表达
量差异明显，在根中表达量较高，叶片中表达量很低。
杂交结果还显示，IBA处理6 h后，在0～30 µmol·L-1，
10 µmol·L-1处理的植株根系中MhEXP1基因的表达量
5 期 孙旭东等：平邑甜茶新根扩展蛋白基因 MhEXP1 的 cDNA 全序列克隆及表达 1551

分支上数字表示支持强度 (Numbers above the branches indicate
bootstrap values). GenBank 登录号码是(The GenBank accession numbers
are): At (Arabidopsis thaliana), AtEXP2 (NP19648), AtEXP10 (NP173999),
AtEXP11 (AAM61082), AtEXP15 (NP178409); Car (Cicer arietinum);
CarEXP4 (CAD33924); Csa (Cucumis sativus), CsaEXP2 (AAB37749);
Gma (Glycine max), GmaEXP1 (AAO15998); Ghi (Gossypium hirsutum),
GhiEXP2 (AAB59694); Les (Lycopersicon esculentum), LesEXP10
(AAG32921); Mdo (Malus×domestica) , MdoEXP1 (Aam08928); Mtr
(Medicago truncatula), MtrEXP (ABE88930); Nt (Nicotiana tabacum),
NtEXP (AAC96079); Os (Oryza sativa), OsEXP6 (AAF62181), OsEXP13
(AAY63546); Pco (Pyrus communis), PcoEXP (BAC67190); Sni
(Sambucus nigra), SniEXP (AAP48991); Zm (Zea mays), ZmEXP1
(AAK56119), ZmEXP5 (AAK56123)

图 2 MhEXP1 与其它植物扩展蛋白基因蛋白序列聚类分析
Fig. 2 Phylogenetic analysis of the deduced MhEXP1 amino
acid sequence with other plants’ EXPA


A 和 B 分别是 Northern 杂交和总 RNA 电泳图。R 为 IBA 处理后根系表
现；L 为 IBA 处理后叶片表现；0、1、2 和 3 分别代表 IBA 处理浓度为
0、10、20 和 30 µmol·L-1
A and B show Northern blot and electrophoretogram of total RNA
respectively. R shows the result in roots treated by IBA; L shows the result
in leaves treated by IBA; 0, 1, 2 and 3 showed the 0, 10, 20 and 30 µmol·L-1
IBA, respectively

图 3 不同浓度 IBA 处理 6 h 后 MhEXP1 基因在根和叶中的
表达
Fig. 3 Expression of MhEXP1 gene in the roots and leaves of the
Malus hupehensis (Pamp) Rehd after 6 h of IBA treatment
最高，30 µmol·L-1处理的植株叶片 MhEXP1 基因轻微
表达，但表达量仍远低于根系。
2.4 IBA 处理时间对平邑甜茶 MhEXP1 基因表达的影
响
10 µmol·L-1的 IBA 处理平邑甜茶根系 0、1、3、
6、12 h 的 Northern 杂交结果见图 4。由图 4 可见 IBA
处理 1 h 内，白根中 MhEXP1 基因表达量很低，随着
处理时间延长，表达水平逐渐增强，当 IBA 处理 6 h
后达到最高，12 h 后下降，这说明 IBA 可以诱导
MhEXP1 基因的表达，这种诱导表达与处理时间有密
切关系。


A 和 B 分别是 Northern 杂交和总 RNA 电泳图。1、2、3、4 和 5 分别代
表 10 µmol·L-1 IBA 处理 0、1、3、6 和 12 h 的带
A and B show Northern blot and electrophoretogram of total RNA
respectively. 1, 2, 3, 4 and 5 show the lane of 10 µmol·L-1 IBA treatment at
0, 1, 3, 6 and 12 h, respectively

图 4 IBA 处理时间对根系 MhEXP1 基因表达的影响
Fig. 4 Expression of MhEXP1 gene in roots treated with 10
µmol·L-1 IBA in different times

3 讨论
扩展蛋白是一种在离体条件下具有诱导细胞壁松
弛的蛋白质，是一个多基因家族，包括 EXPA、EXPB、
EXLA 和 EXLB，每个家族又有多个亚家族，其中
EXPA 家族分有 12 个亚家族[26]。家族中不同成员可能
参与了不同的生长发育过程[4,12]，但生理功能相似的
亚家族，其基因表达可能受相同的激素调控方式影
响[20]。本试验获得的扩展蛋白基因 MhEXP1 与大豆根
中的 GmEXP1 基因具有较高的同源性，并且都属于
EXPA 家族的第Ⅴ亚家族，GmEXP1 基因对大豆根生
长发育特别是初生根和次生根的起始和伸长起着重要
作用[23]。同属于Ⅴ亚家族的水稻扩展蛋白 OsEXP14、
OsEXP15 等在根原基形成及根系生长发育中也起着
重要作用[12]。因此，MhEXP1 基因也可能参与平邑甜
茶根系的生长发育。
IBA 是调节根系生长发育的物质，能够促进苹果
根系的加长生长[24]，本试验结果显示平邑甜茶经 IBA
1552 中 国 农 业 科 学 41 卷
处理后，根系 MhEXP1 基因表达量明显增加（图 3、
图 4），但 MhEXP1 基因在平邑甜茶叶片中表达量非
常低，几乎检测不到，对 IBA 处理也没有明显响应（图
3），这说明 MhEXP1 基因表达有根系特异性。EXP
的表达产物是扩展蛋白，扩展蛋白可促进细胞壁松弛，
有利于细胞扩展和增大[5]，细胞扩展是植物组织和器
官生长的基础，根系特异表达的 MhEXP1 基因应当能
够促进平邑甜茶根系的生长发育。但 IBA 通过什么方
式调节 MhEXP1 基因的表达，表达产物的具体成分及
其与平邑甜茶新根生长发育的具体关系还有待进一步
阐明。
4 结论
成功克隆到扩展蛋白基因家族的 MhEXP1 基因，
该基因在平邑甜茶叶片中表达量很低但在新根中大量
表达，并受 IBA 诱导；MhEXP1 基因参与 IBA 调节的
平邑甜茶根系生长发育。

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（责任编辑 曲来娥）