全 文 ：中国农业科学 2012,45(14):2904-2912
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.14.013

收稿日期：2012-03-21；接受日期：2012-05-08
基金项目：国家“863”计划项目（2008AA10Z157）、甘肃省科技厅农业科技成果转化资金计划项目（1105NCNE109）
联系方式：王顺才，E-mail：wscai001@sina.com。通信作者马锋旺，E-mail：fwm64@sina.com


平邑甜茶金属硫蛋白基因 MhMT2 的克隆和表达分析
王顺才 1，梁 东 2，马锋旺 2
（1 天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水 748100；2 西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100）

摘要：【目的】克隆平邑甜茶金属硫蛋白（metallothionein，MT）基因，探讨该基因对逆境的响应机理，为
苹果抗逆分子育种提供依据。【方法】采用电子克隆和 RT-PCR 技术从平邑甜茶叶片中克隆 MhMT2 基因，利用生物
信息学方法对获得的 cDNA 序列及推测氨基酸序列进行分析，通过定量 PCR 技术研究在胁迫条件和激素处理下该基
因在叶片中的表达模式。【结果】平邑甜茶 MhMT2 基因 cDNA 全长 534 bp，具有 1 个 243 bp 的完整开放阅读框，
编码含 80 个氨基酸的多肽，其分子量为 7.87 kD。同源性比对显示，MhMT2 编码的氨基酸序列与其它植物的 MT2
蛋白有很高的相似性，其中与小金海棠的同源性最高，达到 96.4%。MhMT2 编码的多肽包含 14 个 Cys 残基，其 N
端富含 Cys 的结构域具有 C-C、C-X-C 和 C-X-X-C 基序，而 C端仅有 C-X-C 基序。聚类分析显示，该基因属于植物
MT2 基因家族。定量 PCR 分析表明，MhMT2 基因在叶中表达量最高，其次是根，在茎中表达量最低。在 ABA、H2O2、
机械损伤及 NaCl 处理下，该基因在叶片中的表达都上调，其中以 H2O2最明显。【结论】对 MhMT2 基因在 ABA、H2O2、
机械损伤及盐胁迫下的表达模式分析，预示该基因表达水平在植物抗逆反应中起着重要作用。
关键词：平邑甜茶；金属硫蛋白基因；克隆；表达

Cloning and Expression Analysis of Metallothionein Gene (MhMT2)
in Malus hupehensis
WANG Shun-cai1, LIANG Dong 2, MA Feng-wang2
(1College of Life Science and Chemistry, Tianshui Normal University, Tianshui 748100, Gansu; 2College of Horticulture, Northwest
A&F University, Yangling 712100, Shaanxi)

Abstract:【Objective】The objective of this study is to clone the full-length cDNA of metallothionein (MT) gene from rootstock
(Malus hupehensis), to understand the mechanism of MT in response to environmental stress and provide fundamental evidence for
molecular breeding of apple trees under stress conditions.【Method】The full-length cDNA sequence of MhMT2 gene was amplified
from the leaves of M. hupehensis using in silico cloning and RT-PCR. Bioinformatics methods were used to analyze cDNA sequence
obtained and putative amino acid sequence. The expression profiles of MhMT2 transcript in control seedlings and those exposed to
various abiotic stresses and hormone treatments were detected by quantitative real-time RT-PCR.【Result】Sequence analysis
indicated that MhMT2 cDNA was 534 bp in length and contained an intact open reading frame of 243 bp, encoding a polypeptide of
80 amino acids with a theoretical molecular mass of 7.87 kD. Homology comparison analysis showed that the deduced MhMT2
protein was highly homologous to other MT2 proteins from plant species, sharing a 96.4% homology with M. xiaojinensis.
Bioinformatic analysis revealed that the putative MhMT2 protein contained 14 cysteine residues occurring as C-C, C-X-C, and
C-X-X-C motifs in the N-terminal, and of C-X-C in the C-terminal region (X are other amino acids other than cysteine).
Phylogenetic analysis suggested that this gene belonged to type 2 plant MT genes family. Quantitative real-time RT-PCR analysis
indicated that MhMT2 showed the highest transcript abundance in leaves, moderate level in roots and the lowest level in shoots.
MhMT2 transcripts in leaves were markedly increased by abscisic acid (ABA), hydrogen peroxide (H2O2), mechanical wounding,
14 期 王顺才等：平邑甜茶金属硫蛋白基因 MhMT2 的克隆和表达分析 2905
and NaCl, especially H2O2 treatment.【Conclusion】The induced expression profiling of MhMT2 gene under ABA, H2O2, mechanical
wounding, and salt stress indicates that the MhMT2 gene may play an important role in response to these abiotic stresses.
Key words: M. hupehensis; metallothionein gene; cloning; expression

0 引言
【研究意义】金属硫蛋白（metallothioneins，MT）
是一类富含半胱氨酸（Cys）、具有金属结合能力的
低分子量（4—8 kD）蛋白质。1957 年，首次在马肾
皮质中发现了 MT[1]，植物 MT 最早是于 1977 年从大
豆根中发现的[2]，现已发现 MT 广泛分布于动物、植
物、真菌及蓝细菌等生物体内[3-4]。据报道，MT 与植
物的生长发育、胚发育、果实成熟、衰老、抗逆反应
以及基因调控等过程有关[3,5-6]。因此，克隆 MT 基因
并分析该基因的表达特征，对探讨平邑甜茶对逆境的
响应机理及抗逆分子育种具有重要价值。【前人研究
进展】人们已从拟南芥（AtMT1—AtMT4）、水稻
（OsMT1—OsMT4）、烟草（Nicotiana glutinosa）、
橡树（Quercus suber）、棉花（Gossypium hirsutum）、
荞麦（Fagopyrum esculentum）、莲花（Nelumbo
nucifera）等植物中克隆了编码 MT 蛋白的基因或
cDNA 序列[6-12]。然而，由于 MT 蛋白含大量巯基，在
空气中极不稳定，在自然状态下难以分离纯化。迄今
为止，除小麦胚乳 Ec-1 等极少数植物 MT 蛋白外，其
它绝大数的植物 MT 蛋白尚未得到分离[5]。与对动物
MT 的研究相比，对植物 MT 的研究远远不足，现有
研究主要集中在基因表达、酵母互补测验及基因敲除
等方面[5,13-14]。近年来，对植物 MT 基因在组织器官特
异性、表达特征、基因组结构和染色体定位等方面的
研究得到快速发展[3]。尽管已从植物中克隆到许多编
码 MT 的基因，但对苹果砧木 MT 基因的研究报道很
少[15]。【本研究切入点】苹果是中国北方栽培面积最
大的落叶果树之一。苹果主要靠嫁接繁殖，其抗逆性
主要来源于砧木。平邑甜茶（Malus hupehensis）是苹
果生产栽培的优良砧木之一。本研究通过筛选干旱诱
导的楸子叶 SSH cDNA 文库，获得一段编码 MT 的基
因序列，经电子克隆（in silico cloning）和 RT-PCR 扩
增，从平邑甜茶叶片中克隆 MT2 基因全长序列，进而
分析该基因的序列特征、组织表达特异性以及表达模
式。【拟解决的关键问题】利用荧光定量 PCR 技术考
察 ABA、H2O2、机械损伤和盐处理对平邑甜茶 MT2
基因的诱导表达变化规律，进而探讨 MT2 基因在植物
抗逆反应中的可能机理。
1 材料与方法
1.1 材料
干旱处理的楸子叶 SSH cDNA 文库，由西北农林
科技大学果树逆境生物学实验室构建保存，该文库的
构建和筛选方法见参考文献[16]。
两年生平邑甜茶盆栽苗，选自西北农林科技大学
园艺场苹果资源圃。盆栽苗试验于 2010 年 7 月下旬在
西北农林科技大学园艺场大棚内进行。取长势良好一
致的盆栽苗各 9 株，用 50 μmol·L-1ABA 或 10 mmol·L-1
H2O2均匀喷植株顶部叶片的正背面，对照各 6 株用清
水喷施。用止血钳垂直挤压叶片中部 2—3 次造成机械
损伤，对照未挤压。盐胁迫试验在园艺学院水培室进
行。一年生平邑甜茶幼苗在 Hoagland 营养液中正常培
养 20 d，每隔 0.5 h 通气 3 min，5 d 换 1 次营养液；
20 d 后选高度一致的幼苗（约 10 cm）转入添加 100
mmol·L-1 NaCl 的营养液中，盐胁迫处理 10 d，对照转
置新的营养液中正常生长。取样后立即投入液氮带回
实验室，置于-70℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 的提取与 cDNA 合成 总 RNA 提取采
用改良 CTAB-LiCl 法[17]。总 RNA 用 RNase-free DNase
（Takara，China）37℃处理 30 min 后用于 cDNA 合
成。以 Oligo d(T)18为反转录引物，用 M-MLV 反转录
酶（Invitrogen，USA）试剂盒合成 cDNA 第一链，用
于 MT 基因的全长 cDNA 克隆。
1.2.2 MT基因的全长cDNA克隆 通过PCR方法筛选
SSH cDNA 文库时，获得编码 MT 的 EST 序列，以该
EST 序列为种子序列，利用 NCBI 的 EST 数据库进行
EST Contig 的拼接和延伸，利用 NCBI 的 ORF finder 软
件结合 BLASTX 程序，进一步筛选可能的全长 cDNA
序列。根据通过电子克隆拼接得到的 MT 基因序列，在
ORF 两端设计基因特异引物（表 1）。PCR 反应程序为：
94℃ 5 min，35 个循环（94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1
min），72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶
电泳分析后切下目的条带，用 PCR 纯化试剂盒
（TaKaRa）回收。将回收产物与克隆载体 pMD19-T 连
接，转化感受态细胞 DH5α 后，涂于添加 100 μg·mL-1
Amp 的LB 平板过夜培养，挑取阳性克隆进行双向测序。
2906 中 国 农 业 科 学 45 卷
表 1 MT 基因克隆及定量 PCR 引物
Table 1 Primers for cloning and real-time RT-PCR of MT gene
编号 code 引物 Primer sequences (5-3) 用途 Remark
F1 TTGTCATCAATCCAAAAATGTCGTC
R1 CAAGTTTTTCATTCATTTCATCACA
全长 cDNA 克隆
Full-length cDNA cloning
F2 CAACGGGTGCGGGATGGCTCCTGAT
R2 GCAGGGGTTGCAGGTGCAGCTATCC
MT 实时定量表达
MT Real-time PCR amplification
EF-1α-F ATTCAAGTATGCCTGGGTGC
EF-1α-R CAGTCAGCCTGTGATGTTCC
EF-1α 内参扩增
EF-1α Real-time PCR amplification
Actin-F CCAAAGGCTAATCGGGAGAA
Actin-R ACCACTGGCGTAGAGGGAAAG
Actin 内参扩增
Actin Real-time PCR amplification


1.2.3 生物信息学分析 正反向测序结果去除载体
序列后，利用 DNAman 和 DNAStar 软件进行序列校
对 ， 拼 接 成 1 条 cDNA 序 列 。 利 用 NCBI
（http://ncbi.nlm.nih.gov/）的 ORF finder 软件预测最
大开放阅读框，用 BLASTn 和 BLASTp 进行序列比对
分析。采用 Compute pI/MW tool（http://www.expasy.
org/tools/pi_tool.html）计算蛋白质的等电点和分子量；
使 用 TMpred （ http://www.ch.embnet.org/software/
TMPRED_form.html）进行氨基酸跨膜预测；利用
ProtScale （ http://expasy.org/tools/protscale.html ） 与
ProtParam（http://expasy.org/tools/protparam.html）进
行 疏 水 性 / 亲 水 性 预 测 ； 利 用 superfamily
（ http://supfam.org/superfamily/hmm.html ） 和 Pfam
（http://pfam.sanger.ac.uk/）进行基因家族预测。采用
MEGA4.0 软件（http://www.megasoftware.net/）构建
系统发生树。
1.2.4 平邑甜茶 MT2 基因的定量分析 利用定量
RT-PCR 方法，对平邑甜茶 MT2（MhMT2）基因的组
织特异性表达进行分析，进而分析平邑甜茶叶片
MhMT2 基因在 ABA、机械损伤、H2O2及盐胁迫下的
表达特征。平邑甜茶根、茎和叶的总 RNA 提取方法
同上。RNA 完整性及浓度分别用 1%琼脂糖凝胶电泳
和 NanoDrop™分光光度计进行检测。定量分析按
PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒
方法（TaKaRa）进行，该试剂盒方法中包含 RNA 样
品中基因组 DNA 的去除及 cDNA 第一链的合成。定
量 PCR 反应程序为：95℃ 3 min，然后 95℃ 20 s、
58℃ 20 s、72℃ 20 s，40 个循环，每个循环结束时采
集荧光信号。40 个循环后 PCR 扩增产物进行熔解曲
线分析（58—95℃）。利用 iQ5.0 实时定量 PCR 仪
（Bio-Rad, USA）自带软件分析实时定量 PCR 数据。
用苹果 EF-1α（DQ341381）和 Actin （GQ339778）作
为内参基因以确定 MT2 基因的相对表达量（表 1）。
2 结果
2.1 MhMT2 基因的克隆与分析
从楸子 SSH cDNA 文库获得一段大小为 318 bp
的 EST 序列，经电子克隆拼接后得到了 611 bp 的
cDNA 序列，其最大开放阅读框为 243 bp。跨 ORF 设
计 1 对特异引物，通过 RT-PCR 在平邑甜茶叶片中扩
增 MT2 基因，其大小约为 500 bp（图 1）。对目的片
段的阳性克隆双向测序后得到该基因的 cDNA 序列，
大小为 534 bp，包含 1 个 243 bp 的 ORF，编码生成 1
条 80 个氨基酸的多肽（图 2）。该蛋白中 Gly（15 个）、
Cys（14 个）和 Ser（9 个）残基含量较高，而 His 残
基仅有 1 个。该蛋白的相对分子质量为 7.87 kD，理论
等电点为 5.09，属于酸性蛋白。
M
500
750
2000
1 2 3 4 5 6
bp

M：DNA 分子量 DL 2000；1—6：CDS 序列
M: DL 2000 DNA marker; lane 1-6: CDS PCR product

图 1 平邑甜茶 MT2 基因的 PCR 扩增电泳图谱
Fig. 1 PCR amplification of the MT2 gene in leaves from M.
hupehensis
14 期 王顺才等：平邑甜茶金属硫蛋白基因 MhMT2 的克隆和表达分析 2907
1 TT GTC ATC AAT CCA AAA ATG TCG TCG TGC TGC GGT GGT AAA TGT GGT TGC GGG TCC GGC TGC
Primer F1
M S S C C G G K C G C G S G C 15
63 GGC TGC GGC AGT GGC TGC AAC GGG TGC GGG ATG GCT CCT GAT CTG AGC TAC ATG GAG GGG TCC
Primer F2
G C G S G C N G C G M A P D L S Y M E G S 36
126 ACC ACT GAG ACC CTT GTC ATG GGA GTT GCT CCC CAG AAG TCG CAC TTT GAG GCA TCT GAG ATG
T T E T L V M G V A P Q K S H F E A S E M 57
189 GGA GTT GCA GCT GAG AAC GGA TGC AAG TGC GGG GAT AGC TGC ACC TGC AAC CCC TGC AAG TGC
Primer R2
G V A A E N G C K C G D S C T C N P C K C 78
252 ACC AAG TGA GTG ACA GAT GCC ACC TTC TGA CGA AGC AAG AGA ATC GTA GGG CTT CTA TGT TTA
T K * 80
315 GCA GTA GTA ATC TAT GTG TGT GTC TGG TAA TTA TGA TCC TAA TGT ACC AAG GTC GTG TTG TTA
378 GAA TAA AGT AGC CAT GGC TTG CCC TCT GAC CTG CGG ATC CAC TAG GCT AGG ATC TGC TGA GGA
441 TGA TCC TAG GTT ATG GCT GCT TGT GTC TGT GTT TCT ATC ATG TGT TGT GTT GAG TTG GAT CAT
504 ACA GTG TGT GAT GAA ATG AAT GAA AAA CTT G
Primer R1

1
5
63
126
189
252
8
315
378
41
504

图 2 MhMT2 基因 cDNA 全长序列及其推测的氨基酸序列
Fig. 2 Complete cDNA sequence of MhMT2 gene and its deduced amino acid sequence

由图 3 可知，平邑甜茶 ORF 编码蛋白与栽培苹果
MT2（AEJ37038）、小金海棠 MT2（ACX49138）及
拟南芥 AtMT2A（AEE74760）与 AtMT2B（AED90465）
具有相同的保守序列，其中，平邑甜茶 MT2 与小金海
棠的同源性最高，达到 96.4%；从 Cys 残基的排列方
式可知，它们都具有典型的 CC、CXC 和 CXXC 排列
方式（C 代表 Cys，X 代表其它氨基酸）。
信号肽预测表明，该蛋白无信号肽结构，为非分
泌性蛋白。疏水性/亲水性预测表明，该多肽的总平均
亲水性值（GRAVY）为负值，为亲水蛋白。由
Superfamily 预测表明，该基因的 ORF 编码蛋白属于
MT 蛋白家族的可能性较高；经 Pfam 预测显示，该多
肽与 Metallothio_2 相似性最高，据 Pfam 注释，该蛋
白属于 II 类 MT。
2.2 MhMT2 基因的聚类分析
对平邑甜茶 MhMT2 基因编码蛋白序列与来自 33
个植物物种的 51 条 MT 蛋白序列进行聚类分析（图 4）
显示，所有植物 MT 分成 4 个分支，每一分支中来自
同一属或物种MT的亲缘关系大于不同属物种的MT。
在 MT2 分支中，苹果属植物形成独立的一簇，其中平
邑甜茶 MhMT2 与小金海棠（ACX49138）的亲缘关系
最近，而与栽培苹果（AEJ37038）的较近。这可能与
栽培苹果的起源及其与苹果属植物不同物种之间的进
化关系有关。
研究表明，MT 在生物进化上较为保守。植物
MT1、MT2 和 MT3 多肽的 N 端和 C 端都具有富含
Cys 的两个结构域，其中 Cys 按 CC、CXC 或 CXXC
的方式排列。MT1 和 MT3 中的 Cys 一般按 CXC 方式
排列，而 MT2 中 Cys 为 CC、CXC 和 CXXC 排列方
式；与 MT1 和 MT2 相比，MT3 多肽链中间区的氨基
酸含量较少，故序列较短。植物 MT4（Pec 蛋白）中
通常具有 3 个富含 Cys 的结构域和高度保守的两个
His 残基，靠近 C 端的富含 Cys 结构域高度保守，严
格按 CXCXXXCXCXXCXC 方式排列，而其它结构域
的Cys一般按CXC方式排列，散布在整个肽链中[3, 13]。
由图 4 可以看出，MT1 分支与 MT2、MT3 分支之间
的亲缘关系比 MT4 分支的近。
以上结果表明，该聚类树是以物种及其 MT 一级
结构为依据构建形成的，MhMT2 基因属于植物 MT2
基因家族。这与上述研究结果相一致。
79
80
80
77
81
M
M
M
.
.
S
S
S
M
M
S
S
S
S
S
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
G
G
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G
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G
G
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K
K
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C
C
K
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K
K
.
K
K
.
.
β-domain a-domain
AtMT2B
AtMT2A
Malus× domestica
M.xiaojinensis
M.hupehensis

图 3 MhMT2 与其它植物 MT2 的氨基酸序列比对
Fig. 3 Multiple alignment of predicted amino acid sequence of MhMT2 with other plant MT2 proteins
2908 中 国 农 业 科 学 45 卷
OsMT3 ABL74404
OcMT3 Oryza coarctata AAF68995
VvMT3 Vitis vinifera CAB85630
MsMT3 Metroxylon sagu ABA43635
MaMT3 Musa acuminata Q40256
GhMT3 Gossypium hirsutum AAW47577
HvMT3 Hordeum vulgare CAD88266
PpMT3 Populus alba×opulus tremula BAD95608
MdMT3 Malus×omestica O24059
MdMT3 AEJ37039
AdMT3 Actinidia deliciosa P43389
CuMT3 Citrus unshiu AAK08209
CuMT3 BAA31562
AtMT3 AAB67234
AtMT3 AEE75656
NcMT3 Noccaea caerulescens ACR46969
FeMT3 Fagopyrum eculentum ABG75913
AtMT1A NP_172239
AtMT1C NP_172240
AtMT1C AEE28148
BnMT1 Brassica napus AAA64489
VaMT1 Vigna angularis BAD18378
CcMT1 Cajanus cajan ADD11816
GmMT1 BAD18376
VfMT1 Vicia faba BAD18380
PsMT1 Pisum sativum BAD18382
MsMT1 Medicago sativa AAF04584
HvMT1a Hordeum vulgare CAD54078
ZmMT1 Zea mays NP_00110546
ZmMT-like Zea mays CAA57676
OsMT1 ACD50949
MdMT2 Malus×omestica AEJ37038
MhMT2 M. hupehensis
MxMT-like M. xiaojinensis ACX49138
PpMT2b Populus trichocarpa×populus deltoides AAT02525
PsMT2 Pisum sativum BAD18383
GmMT2 Glycine max BAD18377
GmMT2 NP_00123550
LpMT2 Lablab purpureus BAD18385
AhMT2 Arachis hypogaea AAZ20290
VaMT2 Vigna angularis BAD18379
AbMT-like Atropa belladonna CAC40742
AtMT2A AEE74760
AtMT2B AED90465
NcMT2b Noccaea caerulescens ACR46961
PmMT4 Plantago major CAH59439
AtMT4 AEC10061
AtMT4a NP_181731
AtMT4b NP_179905
Ec-1 Triticum aestivum CAA48349
95
99
99
99
99
76
90
99
99
97
97
59
97
94
90
68
66
64
48
58
54
54
39
27
22
12
34
35
50
53
71
69
98
96
87
66
99
65
48
28
26
6514
15
14
29
58
0.1
MT3
MT1
MT2
MT4
OsMT3 Oryza sativa AAB53811


图 4 植物 MT 的聚类分析
Fig. 4 Phylogentic analysis of the deduced amino acid sequences of MT genes from plant species

2.3 MhMT2 基因在不同组织中的表达分析
结果表明，MhMT2 基因在叶中表达最强，其次是
根，茎中最弱。其中，叶的表达量是茎的 5.2 倍，而根
为茎的 1.9 倍（图 5）。不同组织中 MhMT2 的表达水平
不同，这可能与植物不同组织的生长发育调控有关。
2.4 MhMT2 基因在 ABA、机械损伤和 H2O2处理下的表
达分析
由图 6 可知，ABA 处理 3 h 时，平邑甜茶叶片
MhMT2基因的表达量达到峰值，比对照增加了5.2倍，
随后逐渐降低，24 h 时仍高于对照表达水平。机械损
14 期 王顺才等：平邑甜茶金属硫蛋白基因 MhMT2 的克隆和表达分析 2909
伤 3 h 时，MhMT2 基因的表达水平略有增加，6 h 时，
其表达水平达到最大值，比对照增加了 5.5 倍，然后
迅速降低并低于原来的表达水平。H2O2处理 6 h 时，
MhMT2 基因的表达量达到峰值，比对照增加了 13.0
倍，随后逐渐降低且高于对照。这表明 MhMT2 基因
受到 ABA、机械损伤及 H2O2处理后均上调表达，但
该基因的表达时序及其表达丰度有所不同。

相
对
表
达
量
R
el
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iv
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ve
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图 5 MhMT2 基因在不同组织中的表达分析
Fig. 5 Expression analysis of MhMT2 gene in various tissues
of M. hupehensis seedling

相
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图 6 ABA、机械损伤与 H2O2处理下 MhMT2 在叶片中的表达
分析
Fig. 6 Expression analysis of MhMT2 gene in leaves of M.
hupehensis in ABA, wounding and H2O2 treatments

2.5 MhMT2 基因在盐胁迫下的表达分析
结果表明，盐处理 8 d 时，幼苗叶片 MhMT2
基因的表达量达到峰值，比对照增加了 3.3 倍，
随后逐渐降低，10 d 时其表达水平仍高于对照（图
7）。
相
对
表
达
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iv
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图 7 盐处理下 MhMT2 在叶片中的表达分析
Fig. 7 Expression analysis of MhMT2 gene in leaves of M.
hupehensis in salt treatment

3 讨论
基于对 MT 多肽的结构分析，许多学者提出了不
同的命名与分类方法。Fowler 等根据 MT 中 Cys 残基
的排列方式，将所有生物的 MT 分为 3 类（Ⅰ、Ⅱ和
Ⅲ类）[18]。而 Binz 和 Kägi 将所有的 MT 定义为一个
超家族（superfamily），并基于其序列相似性及进化
关系，将其细分为脊椎动物、软体动物、甲壳动物、
棘皮动物、双翅目、线虫、纤毛虫、真菌（I—VI）、
原核生物及植物共 15 个家族（family），其中植物
MT 被分在第 15 家族[19]。最初，Binz 和 Kägi 将植物
MT 家族分为 p1、p2、p2v、p3、pec 和 p21 共 6 个亚
家族（subfamily），后来，人们又将植物 MT 分为 4
类：MT1（p1）、MT2（p2）、MT3（p3）与 MT4（pec/Ec
蛋白）[3,7,13,20]。随着多种植物 MT 基因的克隆和分离，
人们发现植物 MT 与其它生物的 MT 具有一定的相似
性，但也有明显的差异[5,21]。植物 MT 基因家族成员
的多肽长度为 45—87 个氨基酸残基，Cys 残基含量在
10—17 个，而 His 残基含量很低[3]。在本试验中，平
邑甜茶 MhMT2 基因编码 80 个氨基酸的多肽，其中含
有 14 个 Cys 残基，占总氨基酸数的 17.5%；与小金海
棠相比，平邑甜茶 MhMT2 多肽在第 52 位 Phe 和第 56
位 Glu 残基发生变异，即 Leu52 (L) → Phe52 (F)、Gly56
(G) → Glu56 (E)，这可能与苹果属植物种间的进化关系
有关（图 3）。
研究报道，植物 MT2 多肽 N 端通常具有高度的
保守序列 MSCCGGNCGCGS，Cys 残基有典型的 CC、
CXC 和 CXXC 排列方式，而且 C 端包含 3 个按 CXC
方式排列的 Cys 基序（Motif）[20]。本试验中，MhMT2
2910 中 国 农 业 科 学 45 卷
基 因 编 码 蛋 白 含 有 与 之 相 似 的 保 守 序 列
M(S)2CCGGKCGCGS，N 端包含 1 个 CC、1 个 CXXC
及 2 个 CXC 基序，在 C 端也有 3 个 CXC 基序（图 3）。
这与水稻 OsMT2（AJ277599）的研究结果相一致[8]。
序列比对发现， MhMT2 蛋白与已鉴定的苹果
（AEJ37038，94.3%）、大豆（NP_001235506，74.1%）、
花生（AAZ20290，70.9%）及拟南芥（AEE74760，
86.1%）等植物 MT2 蛋白具有很高的同源性。聚类分
析表明，MhMT2 与同为苹果属植物的小金海棠、栽培
苹果组成一簇，并与豆类、花生和拟南芥等植物 MT2
形成一大分支（图 4）。鉴于以上阐述，笔者认为
MhMT2 基因为植物 MT2 基因家族成员。
现已表明，植物 MT 基因的器官表达特异性差别
很大。拟南芥 AtMT1 在根中表达丰富，在叶中的表达
量低；AtMT2 在叶中的表达量比根中的高；AtMT3 主
要在果实和叶中表达，Ec主要在种子中表达[3, 5, 22]。水
稻幼苗 OsMT1a 基因主要在根中表达，在叶和花中的
表达量较低，在茎中的表达量最低[23]。Northern 杂交
结果显示，菊芋（Helianthus tuberosus L.）htMT2 在
叶、叶柄、茎及块茎中均有表达，在茎中的表达水平
较高，在根中未检测到杂交信号[24]。但也相反的报道，
RNA 原位杂交显示，橡树 QsMT2 在种子胚根及幼苗
根和茎中均有表达[8]；苹果 MT2 在叶片中几乎检测不
到表达，但在花序和果实发育早期表达丰富；在幼果
中其表达量随着果实的发育而下降，在成熟期降至最
低[5]。荞麦 FeMT3 在种子胚乳发育过程中均有表达，
在叶片保卫细胞和根系维管组织中的杂交信号非常强
烈，而在叶片表皮细胞中检测不到杂交信号[12]。在本
试验中，MhMT2 在根、茎、叶中均有表达，但其表达
量明显不同（图 5）。这表明，MhMT2 基因的表达具
有明显的组织特异性。植物 MT 基因表达特性各异的
原因可能与不同物种组织的生长阶段、不同的基因类
型及发育调控机理有关[22,25]。
据报道，MT 基因表达受金属离子、环境胁迫、
激素、损伤、病毒侵染等因素的调节[3, 6, 25]，其中研究
最多的是金属离子对 MT 基因表达的影响[13,23,26]。在
本试验中，机械损伤使平邑甜茶叶片 MhMT2 上调表
达（图 6）。这与 Choi 等对烟草 MT2 的研究结果相
一致[9]。RNA 原位杂交显示，用 H2O2 处理橡树未成
熟胚诱发氧化胁迫，MT2 在胚根、胚芽分生组织的杂
交信号较强烈[8]。荞麦叶片经 10 mmol·L-1 H2O2处理
4.5 h 后，FeMT3 的 mRNA 水平增加了 2.4 倍[12]。这
与本试验对 H2O2处理的研究结果相一致（图 6）。研
究发现，植物 MT2 能直接清除细胞体内 和·OH 等
活性氧自由基（ROS），在植物抗逆反应中具有重要
的作用[3,5,8,27]。在清除 ROS 的过程中，MT 中的 Cys
残基与 ROS 结合释放出金属离子，金属离子可能参与
植物细胞信号级联反应[3]。在本试验中，平邑甜茶叶
面喷施50 μmol·L-1 ABA诱导MhMT2上调表达（图6）。
在拟南芥种子发育过程中，ABA 在 AtMT4a 和 AtMT4b
的表达调控和功能中起着重要作用[22]。
莲花种子 NnMT2a、NnMT2b 和 NnMT3 在盐胁迫
处理下，基因表达水平明显上调；转 NnMT2a 和
NnMT3 基因的拟南芥植株增强了抗衰老的能力[25]。
转柽柳（Tamarix sp.）MT1 基因的烟草植株增强了耐
盐胁迫的能力[28]。在本试验中，盐胁迫处理使 MhMT2
上调表达（图 7）。但也有相反的报道，水稻 OsMT2b
在根中的表达水平经 NaCl 或细胞分裂素处理后，其
表达水平明显下降，OsMT2b 基因可能参与细胞分裂
素的信号传导途径[6]。
综上所述，当植物遭受逆境胁迫时致使 MT2 基
因表达水平发生改变，从而减轻或抵抗逆境对植物
的不良影响。迄今为止，人们对生物 MT 蛋白的研究
时间已超过半个世纪，但其确切的功能仍不清楚[29]。
近年来，人们对植物 MT 基因及其蛋白在非生物胁
迫中的功能有了初步认识[14,25-26,30]，但植物 MT 基
因是如何调控植物参与逆境反应的分子机制尚不清
楚[22, 30]。因此，对植物 MT 的研究仍将是一个重要
方向[5]。
4 结论
克隆并分析了平邑甜茶 MhMT2 基因序列。生
物信息学分析结果表明，该基因属于植物 MT2 基因
家族。组织表达特异性分析表明，MhMT2 基因表达
水平为叶>根>茎。定量 PCR 分析表明，在盐胁迫、
机械损伤、ABA 和 H2O2 处理下，MhMT2 基因在叶
片中均上调表达，其中以 H2O2 处理尤为明显，植物
可能通过提高该基因表达水平抵抗或适应逆境的影
响。

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（责任编辑 曲来娥）