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艾纳香的组织培养



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严 敏,刘 艳,汤洪敏. 艾纳香的组织培养[J]. 江苏农业科学,2014,42(2):33 - 35.
艾纳香的组织培养
严 敏,刘 艳,汤洪敏
(贵州民族大学,贵州贵阳 550025)
摘要:以贵州药用植物艾纳香的叶片为材料,MS培养基为基本培养基,探讨影响艾纳香组织培养的因素,为艾纳
香的组织培养快速繁殖提供重要的参考依据。结果表明:外植体灭菌组合以 0. 1%氯化汞 8 min + 75%乙醇 5 s最佳;
诱导愈伤组织培养基以 MS + 6 - BA 3. 0 mg /L + NAA 0. 1 mg /L最佳,诱导率为 88. 17%;愈伤组织继代培养基以MS +
6 - BA 3. 0 mg /L + NAA 0. 1 mg /L最佳;愈伤组织分化为芽的培养基以 MS + 6 - BA 3. 0mg /L + NAA 0. 1mg /L最佳,
以试管苗(由野外艾纳香培育出的完整幼苗)叶片为外植体诱导愈伤组织,其分化率为 93%;芽继代培养基以 MS +
6 - BA 3. 0 mg /L + NAA 0. 1 mg /L最佳,平均苗高 4. 3 cm;IBA有利于艾纳香的无根绿苗生根,以 MS + IBA 1. 4 mg /L
培养基培养,生根率为 100%。
关键词:艾纳香;组织培养;愈伤组织;诱导;MS培养基
中图分类号:Q943. 1 文献标志码:A 文章编号:1002 - 1302(2014)02 - 0033 - 03
收稿日期:2013 - 07 - 12
基金项目:贵州省科技厅联合课题(编号:黔科合 J 字 LKM[2011]
27、黔科合处 G字[2011]7034 号)。
作者简介:严 敏(1973—),贵州印江人,硕士,高级实验师,研究方
向为植物化学。E - mail:577977087@ qq. com。
通信作者:汤洪敏。E - mail:thm@ gznc. edu. cn。
艾纳香(Blumea balsamifera DC)为菊科艾纳香属植物,在
我国仅分布在贵州、云南、广东、广西等少数湿热地区[1]。艾
纳香叶提取的挥发油有特殊的清香,具有显著的抗菌、消炎、
消肿、止痛、止痒等作用[2]。艾纳香油的主要成分为 L - 龙
脑,主要用途之一是提制冰片(艾片),冰片具通窍、散热、明
目、止痛等功能。艾纳香属多年生宿根植物,主要以宿根分株
繁殖,分生苗移栽成活率低;艾纳香利用种子育苗,种子结实
率低,休眠期长,发芽率低于 5. 8%[3]。这些情况导致艾纳香
种苗短缺,严重制约艾纳香大规模生产,因此必须研究艾纳香
的组织培养以快速获得批量种苗,扩大种植规模以满足日益
增长的市场要求。国内的报道主要着重在艾纳香药理研究
上[4 - 5],所以对艾纳香进行植物组织培养是一条全面研究艾
纳香的重要途径。通过本项目的实施,以期为贵州省艾纳香
成功培育试管苗作参考,同时也可为贵州省其他特色药用植
物的组织培养快繁提供参考。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
来源于贵州省罗甸县,由贵州大学林学院熊中华副教授
鉴定。
1. 2 培养基
MS培养基;以 MS培养基为基本培养基,附加激素、白砂
糖 30 g /L、琼脂 13 g /L。所有培养基均在 1. 1 kg /cm2、121 ℃
的灭菌锅中灭菌 25 min。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 艾纳香外植体的灭菌处理 将洗净的外植体叶片用
氯化汞和乙醇进行不同灭菌剂、不同时间的比较试验及相同
灭菌剂不同时间的比较试验,以筛选出外植体灭菌的最佳
处理。
1. 3. 2 艾纳香的接种
1. 3. 2. 1 诱导接种 将已冲洗的外植体放入超净台中,并将
其灭菌,然后把叶片剪成大小为 0. 6 cm × 0. 6 cm 的小块,接
入诱导培养基中,每瓶接种 8 块叶片。
1. 3. 2. 2 愈伤组织继代接种 将由外植体诱导出的愈伤组
织接种于继代培养基中。
1. 3. 2. 3 愈伤组织分化接种 将愈伤组织接入分化培养基
中,分化出芽。
—33—江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 2 期
1. 3. 2. 4 芽继代培养接种 将分化出的芽切分,转入继代培
养基,每瓶接 5 株左右。
1. 3. 2. 5 生根壮苗接种 将继代培养出的具有 3 cm左右的
芽剪下来,接种在生根培养基中诱导生根。
1. 3. 3 培养气候条件 诱导愈伤组织阶段:将材料置于
25 ℃ 条件下培养,前 5 d 在黑暗条件下,之后每天接受自然
光照。愈伤组织继代、愈伤组织分化、芽继代及生根壮苗阶
段:将材料置于 25 ℃条件下培养,接受光照。
1. 3. 4 NAA与 6 - BA 对组织培养效果的影响 以 MS 为基
本培养基,探讨不同浓度 NAA 与不同浓度 6 - BA 组合对诱
导愈伤组织、愈伤组织继代培养、愈伤组织分化、芽继代的效
果的影响。
1. 3. 5 生根壮苗试验设计 试验材料为从艾纳香叶片上诱
导的芽。经查阅相关文献可知,IBA 1. 4 mg /L 的生根效果较
好[6],所以生根培养基设计为 MS + IBA 1. 4 mg /L。
2 结果与分析
2. 1 不同灭菌处理对艾纳香外植体的灭菌效果
2. 1. 1 单一灭菌剂的灭菌效果 由表 1、表 2 可知,单独使
用乙醇灭菌没有效果,材料全部被污染。高浓度的氯化汞虽
然能降低外植体的污染率,但是外植体褐化严重,难以诱导出
愈伤组织。所以,单一灭菌剂对外植体的灭菌效果不佳。
表 1 单独使用氯化汞对外植体叶片灭菌效果的影响
氯化汞浓度
(%)
时间
(min)
污染率
(%)
0. 10 7 100
0. 10 8 100
0. 10 9 100
0. 15 7 89. 3
0. 15 8 86. 6
0. 15 9 83. 4
表 2 单独使用乙醇对外植体叶片灭菌效果的影响
乙醇浓度
(%)
时间
(s)
污染率
(%)
75 5 100
75 10 100
75 20 100
80 5 100
80 10 100
80 20 100
2. 1. 2 氯化汞和乙醇混合灭菌剂的灭菌效果 从表 3 可知,
最佳灭菌组合为 0. 1%氯化汞 8 min + 75%乙醇 5 s。由于氯
化汞对外植体的伤害大,难以诱导出愈伤组织,所以其浓度不
宜增大,其作用时间也不宜延长。因为乙醇会使外植体褐化,
影响外植体诱导成愈伤组织,甚至使外植体死亡,所以在能灭
菌的情况下其作用时间越小越好。
2. 2 愈伤组织的诱导试验结果与分析
2. 2. 1 不同浓度 NAA 与相同浓度 6 - BA 组合对愈伤组织
诱导的效果 由表 4 可知,NAA 0. 1 mg /L + 6 - BA 3. 0 mg /L
培养基最适合艾纳香诱导愈伤组织。
表 3 氯化汞和乙醇不同配组对外植体叶片的灭菌效果
不同灭菌剂组合的灭菌时间
0. 1%
氯化汞
(min)
0. 15%
氯化汞
(min)
75%
乙醇
(s)
80%
乙醇
(s)
污染率
(%)
褐化率
(%)
8 — 5 — 6 52. 00
— 8 5 — 5 70. 00
8 — — 5 6 68. 00
— 8 — 5 6 71. 00
表 4 不同浓度 NAA与 6 - BA配组对叶片愈伤组织诱导的影响
NAA浓度
(mg /L)
6 - BA浓度
(mg /L)
出愈数
(个)
出愈率
(%)
0. 05 3. 0 12 14. 81
0. 1 3. 0 82 88. 17
0. 2 3. 0 9 11. 84
0. 25 3. 0 20 24. 39
2. 2. 2 不同浓度 6 - BA 和与相同浓度 NAA 组合对愈伤组
织诱导的效果 由表 5 可知,6 - BA 3. 0 mg /L + NAA
0. 1 mg /L 培养基最适合艾纳香诱导愈伤组织。
表 5 不同浓度 6 - BA与 NAA配组对愈伤组织诱导的影响
6 - BA浓度
(mg /L)
NAA浓度
(mg /L)
外植体数
(块)
出愈数
(个)
出愈率
(%)
0. 1 1. 5 76 11 14. 47
2. 0 0. 1 74 15 20. 27
2. 5 0. 1 69 31 44. 92
3. 0 0. 1 93 82 88. 17
2. 3 愈伤组织的继代培养试验结果与分析
2. 3. 1 不同浓度 NAA 和与相同浓度 6 - BA 配组对愈伤组
织继代培养的影响 由表 6 可知,NAA 0. 1 mg /L + 6 - BA
3. 0 mg /L 处理的愈伤组织增殖倍数最高,为 2. 98 倍,其褐化
率也相对最低,所以 NAA 0. 1 mg /L + 6 - BA 3. 0 mg /L 为最
佳继代培养基。
表6 不同浓度NAA与6 -BA配组对叶片愈伤组织继代培养的影响
NAA浓度
(mg /L)
6 - BA浓度
(mg /L)
20 d后的
增殖倍数
褐化率
(%)
0. 1 3. 0 2. 98 16. 32
0. 2 3. 0 1. 43 16. 91
0. 3 3. 0 1. 57 17. 12
0. 4 3. 0 1. 35 16. 63
2. 3. 2 不同浓度 6 - BA 和与相同浓度 NAA 配组对愈伤组
织继代培养的影响 由表 7 可知,6 - BA 3. 0 mg /L + NAA
0. 1 mg /L 处理的愈伤组织增殖倍数最高,为 3. 2 倍,为最适
宜愈伤组织继代培养的激素浓度
表7 不同浓度6 -BA与NAA配组对叶片愈伤组织继代培养的影响
6 - BA浓度
(mg /L)
NAA
(mg /L)
20 d后的
增殖倍数
褐化率
(%)
2. 0 0. 1 1. 60 15. 80
3. 0 0. 1 3. 20 16. 53
4. 0 0. 1 1. 80 17. 62
5. 0 0. 1 1. 34 17. 59
—43— 江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 2 期
2. 4 愈伤组织的分化培养结果与分析
2. 4. 1 不同浓度 NAA 和与相同浓度 6 - BA 配组对愈伤组
织分化的影响 由表 8 可看出,随着 NAA 浓度的提高,芽分
化率呈先上升后下降的趋势,褐化率随之升高,只有在 NAA
0. 1 mg /L + 6 - BA 3. 0 mg /L 条件下,芽分化率最高,为 4%。
所以,只有添加适宜浓度的 NAA,才能使芽分化率最大。
表 8 不同浓度 NAA与 6 - BA配组对叶片愈伤组织分化的影响
NAA浓度
(mg /L)
6 - BA浓度
(mg /L)
分化率
(%)
褐化率
(%)
0. 05 3. 0 0 79. 8
0. 10 3. 0 4 81. 2
0. 20 3. 0 0 90. 0
0. 25 3. 0 0 91. 2
2. 4. 2 不同浓度 6 - BA 和与相同浓度 NAA 配组对愈伤组
织分化的影响 由表 9 可看出,随着 6 - BA 浓度的提高,芽
分化率呈上升的趋势,褐化率先降低后升高,只有在 6 - BA
3. 0 mg /L + NAA 0. 1 mg /L处理时,芽分化率最高为 4%。所
以,只有添加适宜浓度的 6 - BA,才能使芽分化率达到最大。
表9 不同浓的6 -BA与NAA配组对叶片愈伤组织分化培养的影响
6 - BA浓度
(mg /L)
NAA浓度
(mg /L)
分化率
(%)
褐化率
(%)
1. 5 0. 1 0 88. 0
2. 0 0. 1 0 82. 1
2. 5 0. 1 0 89. 3
3. 0 0. 1 4 80. 1
2. 5 芽继代培养试验结果与分析
2. 5. 1 不同浓度 NAA 和与相同浓度 6 - BA 配组对芽继代
的影响 由表 10 可知,芽在继代培养过程中,芽的增殖倍数
差异不大;其平均苗高呈先升后降再升的趋势。
表 10 不同浓度 NAA与 6 - BA配组对芽继代培养的影响
NAA浓度
(mg /L)
6 - BA浓度
(mg /L)
20 d后的
增殖倍数
平均苗高
(cm)
0. 05 3. 0 2. 0 2. 6
0. 1 3. 0 2. 6 4. 3
0. 2 3. 0 2. 0 2. 7
0. 25 3. 0 2. 1 3. 1
2. 5. 2 不同浓度 6 - BA 和与相同浓度 NAA 配组对芽继代
培养的影响 由表 11可知,不同浓度的激素组合对芽继代培
养的情况不同,以 MS + NAA 0. 1 mg /L +6 - BA 3. 0 mg /L组合
为最佳组合,平均苗高 4. 3 cm。
表 11 不同浓度 6 - BA与 NAA配组对芽继代培养的影响
NAA浓度
(mg /L)
6 - BA浓度
(mg /L)
20 d后的
增殖倍数
平均苗高
(cm)
1. 5 0. 1 2. 1 3. 1
2. 0 0. 1 2. 0 2. 6
2. 5 0. 1 2. 0 2. 7
3. 0 0. 1 2. 6 4. 3
2. 6 生根壮苗的试验结果与分析
经过生根培养基 MS + IBA 1. 4 mg /L 培养出来的幼苗,
1 个月后生根率为 100%,平均根长为 4. 3 cm,平均苗高为
7. 4 cm。图 1 为生根培养基 MS + IBA 1. 4 mg /L培养出来的
幼苗。
3 结论
本试验以艾纳香叶片为材料,筛选出最佳灭菌剂组合及
灭菌时间、诱导愈伤组织的最佳培养基配方、愈伤组织继代培
养的最佳培养基配方、愈伤组织分化的最佳培养基配方、芽继
代的最佳培养基配方、生根壮苗的培养基配方。从外植体的
灭菌到成为一株完整幼苗的过程中每一步都很重要,缺了任
何一个步骤本试验都无法成功。本试验结果表明,对外植体
进行灭菌的最佳组合为 0. 1%氯化汞 8 min + 75%乙醇 5 s;
单独使用氯化汞或者乙醇对艾纳香灭菌效果不好。不同浓度
的激素组合对艾纳香叶片诱导愈伤组织情况不同,以 MS +
6 - BA 3. 0 mg /L + NAA 0. 1 mg /L组合为最佳组合,诱导率为
88. 17%;不同浓度的激素组合对愈伤组织继代培养的情况不
同,以MS +6 - BA 3. 0 mg /L + NAA 0. 1 mg /L组合为最佳组
合;不同浓度的激素组合处理的艾纳香叶片愈伤组织分化为
芽的情况不同,以 MS +6 - BA 3. 0 mg /L + NAA 0. 1 mg /L 组
合为最佳组合,以野外艾纳香叶片为外植体诱导出的愈伤组
织分化率为 4%;以试管苗(由野外艾纳香培育出的完整幼
苗)叶片为外植体诱导出的愈伤组织分化率为 93%;不同浓
度的激素组合处理的叶片的芽继代培养情况不同,以 MS +
6 - BA 3. 0 mg /L + NAA 0. 1 mg /L 组合为最佳组合,平均苗
高 4. 3 cm。IBA有利于艾纳香的无根绿苗生根,以 MS + IBA
1. 4 mg /L 培养基培养的生根率为 100%。
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