全 文 ：收稿日期:2007-04-23
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(04300850);湛江师范学院博士基金资助项目(Z0313).
作者简介:袁长春(1964—),男 ,湖南常德人 , 湛江师范学院教授 ,博士 , 从事植物学及分子生物学研究.
　　 2007年 6月第 28卷 第 3期
湛江师范学院学报
JO URNAL OF ZHANJIANG NORMA L CO LLEGE
Jun., 2007
Vol.28　No.3
西欧绿绒蒿(Meconopsis cambrica)及其
近缘类群 ITS基因的序列分析
袁长春1 , 2 ,吴丹红1 ,袁秋梅1
(1.湛江师范学院 生命科学与技术学院 ,广东 湛江 524048;2.湛江师范学院 自然科学与技术研究中心 , 广东 湛江 524048)
　　摘　要:对西欧绿绒蒿 Meconopsis cambrica (L.)Vig.及其它来自罂粟亚科(Papaveroideae)的17 个种的 nrD-
NA ITS 区(包括 ITS1、5.8S 和 ITS2)的序列进行测定 , 并对这些序列进行排位和统计分析.所得 18个种的 ITS 序
列长度范围为 589-676bp ,这些序列经 ClustalX1.81 软件排序后 ITS 区的序列长度为706 位点(ITS1 为 271bp;5.
8S 为 162bp;ITS2为 373bp;包括 gap),其中变异位点 99 个(占 14.0%).结果显示 ,西欧绿绒蒿与绿绒蒿属其它种
之间的差异较其与罂粟属(Papaver)的种类之间的差异更大 , 表明西欧绿绒蒿与罂粟属具有更近的亲缘关系.因
此 ,将西欧绿绒蒿从绿绒蒿属中划分出来并重新归到罂粟属中较为合理.
关键词:西欧绿绒蒿;罂粟亚科;ITS
中图分类号:Q94　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1006-4702(2007)03-0082-05
西欧绿绒蒿(Meconopsis cambrica (L.)Vig.)在分类上属于罂粟科(Papaveraceae)、绿绒蒿属(Meco-
nopsis)[ 1] ,为一年生或多年生草本 ,主根明显 ,肥厚而延长或萝卜状增粗 。茎分枝或为基生花葶 ,被刺毛 、硬
毛 、软毛或无毛.叶全部基生成莲座状或生于茎上;叶片全缘 、具锯齿 、羽状浅裂或羽状全裂;基生叶和下部
茎生叶具长柄 ,上部茎生具短柄或无柄 ,有时抱茎.花生于花葶上或生于无苞片或具苞片的花序上 ,单生或
总状 、圆锥状排列.花大而美丽 ,蓝色 、紫色 、红色或黄色 ,稀白色;萼片 2 ,早落;花瓣通常 4 ,有时 5 ～ 10;雄
蕊多数 ,花丝大多丝状 ,稀下部或整个为条形;子房近球形 、卵形 、倒卵形至狭圆柱形 , 1室 , 3至多心皮 ,胚珠
多数 ,花柱明显 ,通常短 ,上下等粗或基部扩大成盘而盖于子房上 ,柱头分离或连合 ,头状或棒状 ,常呈辐射状
下延.蒴果近球形 、卵形 、倒卵形 、椭圆形至狭圆柱形 ,被刺毛 、硬毛或无毛.种子多数 ,卵形 、肾形 、镰状长圆
形或长椭圆形[ 1-2].
1814年 ,Viguie r根据康布里罂粟 Papaver cambrica L.(1753)具短花柱的特点 ,将其从无花柱 、仅有盘
状柱头的罂粟属中分立出来 ,并成立一个新的属 ,即绿绒蒿属 Meconopsis , 当时本属只有西欧绿绒蒿
M.Cambrica (L.)Vig.一个种 , 主要分布于威尔士 、爱尔兰西部 、英格兰西南部 、法国西部到西班牙北
部[ 2] ,生长于潮湿的 、隐蔽的岩石的地方 ,海拔通常在 1000 m 以下[ 3-4].后来在亚洲相继发现其它的绿绒蒿
种类 ,目前 ,该属共有 49 种 , 1种产西欧 ,其余 48种均分布于东亚的中国 —喜马拉雅地区 ,我国有 38种 ,集
中分布于西南部[ 1].
在传统的分类上 , 始终将西欧绿绒蒿置于绿绒蒿属中 ,并一直作为该属的模式种[ 1].然而 ,最近 ,
Kirst in 、Joachim 等采用 PCR-AFLP 的方法研究罂粟亚科(Papaveroideae)的系统发育时发现 ,绿绒蒿属和
罂粟属(Papaver)都不是单源的;并且西欧绿绒蒿M.cambrica 与亚洲的绿绒蒿种类及罂粟属构成并系关
系[ 5-6].因此 ,对于西欧绿绒蒿在罂粟亚科内的系统位置及其与近缘种之间的亲缘关系有必要进行重新界
定.
随着植物分子系统学的发展 ,越来越多的核酸分析技术被用于植物系统发育研究.其中 ,DNA 序列分
袁长春等:西欧绿绒蒿(Meconopsis cambrica)及其近缘类群 ITS 基因的序列分析
析因为具有测定相对较快 、方便 ,可比性强 ,能够获得大量不连续性状 ,远远超过可利用的营养性状和生殖性
状 ,并可通过 GeneBank 比较不同的序列等优点而备受青睐 ,成为广泛应用的工具[ 7].核糖体 DNA(nrD-
NA)是编码核糖体 RNA的基因 ,在植物细胞核中以重复连续排列的方式存在 ,每个细胞中的拷贝数可达
500 ～ 40 000[ 8].由于核糖体 DNA中包含了进化速度不等的编码区 、非编码转录区和非转录区 ,因而可以选
取其中保守程度不同的片段用于不同的系统发育和进化研究[ 9].核糖体 DNA 内转录间隔区(I TS 区),位于
小亚基和大亚基 rRNA 基因之间 ,被 5.8S rRNA基因分为两段 ,即 ITS1和 ITS2.在被子植物中 ,由于 ITS
存在于高重复的核糖体 DNA 中 ,进化速度快且片段长度不大 ,加上协调进化使该片段在基因组不同重复单
元间十分一致 ,因而十分适合于进行各种分子操作 ,已成为被子植物系统与进化研究中的重要分子标记 ,广
泛应用于被子植物属内 、近缘属间乃至科内的系统发育研究[ 10-13].因此本研究通过分析西欧绿绒蒿及其相
关类群的 ITS 序列来探讨西欧绿绒蒿与亚洲绿绒蒿的亲缘关系 ,并为西欧绿绒蒿的重新归类提供理论依据.
1　材料与方法
1.1　实验材料
用于 DNA 提取的新鲜材料分别采自中国云南 、西藏地区的野生植株和昆明植物所 、华南植物园 、英国
爱丁堡皇家植物园的栽种植株 ,鲜叶样品经硅胶干燥处理后备用.用于 DNA 提取的标本材料采自美国哈
佛大学标本馆(Harvard University Herbaria)馆藏腊叶标本.另有 4种罂粟科的相关类群的 ITS 序列直接
来源于基因库(GenBank).详细的材料名称 、来源及凭证标本号列于表 1.
表 1　用于核糖体 DNA ITS 序列分析的材料名称 、来源及其凭证标本
样品名称 来　源　　　　　　 凭证标本　　　　 GenBank 编号　　
Meconopsis cambrica 西欧绿绒蒿 英国爱丁堡植物园 200271106 AY328299
M.betonici folia 藿香叶绿绒蒿 西藏灵芝 20020608 AY328292
M.lanci f olia 长叶绿绒蒿 云南中甸大雪山 2000657 AY328282
M.regia 高贵绿绒蒿 尼泊尔(标本) 4627 AY328273
M.torquata 毛瓣绿绒蒿 西藏拉萨(标本) 8777 AY328278
M.graci li pes细梗绿绒蒿 尼泊尔(标本) 980 AY328270
Papaver sp .罂粟属 昆明植物所园内 2000611 AY328298
Papaver somni f erum 罂粟 英国爱丁堡 Mackinnon 花园 200271102 AY328297
Papaver spicatum 英国爱丁堡植物园 200271101 AY328296
Papaver rhoeras虞美人 昆明植物所园内 2000609 AY328311
Argemone mexicana 蓟罂粟 昆明植物所园内 2000607 AY328303
Bocconia f rutescens GenBank 3393053 AJ001951
Bocconia integia f olia GenBank 3393036 AJ001952
Canbya aurea GenBank 8777610 AF098921
Chelidonnium maj us白屈菜 华南植物园栽种 200052707 AY328308
Hy lomecon japonica 荷青花 GenBank 339290 AJ001956
Macleaya cordata 博落迴 昆明植物所园内 2000605 AY328307
Sty lomecon diphy llum 美国加州(标本) 93/ 8 AY328309
1.2　实验方法
1.2.1　总 DNA的提取与纯化
采用 2 ×CTAB法提取总 DNA [ 14] ,具体步骤如下:1)取干叶(0.5 ～ 0.7 g),置于灭过菌的干净研钵中 ,
剪成小片 ,加液氮充分研磨成细粉 ,约 15 min ,直至粉末呈浅灰绿色;2)将磨碎的粉末近等量地分装于 2个
1.5 mL的微量离心管中 ,各加入1 mL 预热(约 50 ℃)的 2×CTBA 缓冲液 ,用力摇匀 ,65 ℃保温 1.5 h ,每隔
15 ～ 20 min摇匀一次.然后室温放置30 min ,其间摇动 1 ～ 2次;3)10 000 r/min离心5 min ,弃沉淀 ,取上清
液移至新管 ,加氯仿-异戊醇(V∶V=24∶1)至满管 ,用力摇匀;10 000 r/min 离心 10 min ,弃沉淀 ,取上清
液移至新管 ,加氯仿-异戊醇(V∶V=24∶1)至满管 ,用力摇匀;4)10 000 r/min 离心 10 min ,弃沉淀 ,取上
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湛江师范学院学报(自然科学) 第 28卷
清液 ,先加 1/10体积预冷(4 ℃)的 3 M N aAc ,再加预冷(4 ℃)的异丙醇至满管 ,将离心管轻轻翻转几次(约
5 s), -20 ℃放置过夜;5)10 000 r/min 离心 5 min ,弃上清液 ,沉淀用70%乙醇洗脱2次 ,再用无水乙醇洗脱
1次.晾干后 ,加 50 ～ 100μL 1×TE液溶解 ,取 2 μL 于琼脂糖凝胶(ρ=1%)电泳检测 ,其余-20 ℃保存备
用.
DNA 的纯化采用玻璃粉纯化系统(SPS)并按以下步骤进行:1)取 50 μL DNA 1×TE 溶液加入 3倍体
积的 6 mol/ L NaI 和3 μL 玻璃粉 1×TE 溶液 ,混匀 ,8 000 r/min离心 2 min;2)弃上清液 ,加洗脱液[含 0.2
mol/L NaCl , 10 mmol/ L Tris-HCl (pH8.0), 1 mmo l/L EDTA , 50%(v/v)E thanol] 100 μL , 混匀 ,
8 000 r/min离心 2 min ,弃上清液 ,重复洗脱 3次 ,晾干;3)加 50μL 1×TE 溶液 , 50 ℃保温 15 ～ 20 min ,至
沉淀完全溶解 , 10 000 r/min离心 10 min ,弃沉淀 ,将上清液移至新管 , -20 ℃保存备用.
1.2.2　PCR扩增与测序
采用引物 ITS4(5 -TCCTCCGCTTA TTGA TATGC-3 , )和 ITS5(5 -GGAAGTAAAAG TCG T
AACAAGG-3 ),按程序(94 ℃4 min;94 ℃1 min ,52 ℃1 min ,72 ℃1 m in ,30个循环;72 ℃6 min)进行
PCR扩增 ,得到核糖体 DNA 的 ITS片段(包括 ITS1 ,5.8S 和 I TS2).PCR产物用上海生工离心柱式 Golden
Beads反应体系 PCR产物纯化试剂盒(Cat .No .SK1 525)进行纯化 ,然后采用 ABI 3 700型自动测序仪(送
中山大学测序中心)进行测序 ,测序引物为 ITS4(序列同上)、ITS5(序列同上)、N18L18(5 -AAG TCG TA-
ACAAGGT TTC-3 )、C5.8 S (5 -TGCG T TCAAAGACTCGA T -3 )、N5.8 S (5 -A TC-
GAGTCTT TGAACGCA-3 ).以上引物的序列均来源于White 等的文献 [ 15].
1.2.3　序列拼接与排序
序列的编辑和拼接用 SeqmanTM Ⅱ(DNASTAR Inc.)软件完成 ,并借助软件 Chromas 2.0 对测序仪误
读和漏读的个别碱基进行人工校对.ITS区序列的边界根据 GenBank中的近缘种序列确定 ,所有序列均输
送到 GenBank ,其登录号见表 1.序列的排列采用 Clustal X1.81软件包[ 16] 进行 ,并采用手工做进一步的校
对.
2　结　果
经过序列的拼装和排序 ,所得西欧绿绒蒿的 ITS 区的序列长度(含 ITS1 , 5.8 S 编码区 , IT S2)为 669
bp ,其中碱基 A为 153个(占 22.87%),碱基 T 为 140个(占 20.93%),碱基G 为 183 个(占 27.35%),碱基
C 为 193个(占 28.85%),GC百分含量为 56.20%.
西欧绿绒蒿和蓟罂粟(A rgemone mexicana)等 18个种的 ITS 区序列长度范围为 589 ～ 676 bp.将 gap
作为缺失处理时 ,全部样品 ITS 区序列排序后的长度为 706个位点 , ITS1为 271 个位点 ,5.8S 为 162个位
点 , I TS2为 373个位点;其中变异位点为 99个 ,占整个序列长度的 14.02%.将西欧绿绒蒿和其他 17个近
缘种进行位点比较 ,发现西欧绿绒蒿与它们之间均存在不同程度的差异.其中西欧绿绒蒿与罂粟属的类群
之间的差异最小 ,例如 ,西欧绿绒蒿与 Papaver sp.之间差异仅为 6.71%,共有45个差异位点 ,其中5个位点
为碱基缺失或插入(ITS1有 2个 ,5.8S有 1个 , ITS2有 2个),40个位点为碱基的替换(ITS1有 15 个 , I TS2
有 25 个).西欧绿绒蒿与 Canbya aurea 的差异最大 ,为 37.33%,共有 252个差异位点 ,其中 74个位点为碱
基缺失或插入 , 178个位点为碱基的替换.具体西欧绿绒蒿与 17个近缘种之间的差异见表 2.
3　分　析
在不同的分类系统中 ,对于西欧绿绒蒿 Meconopsis cambrica 的分类位置的处理有所不同.1814 年 ,
Viguier 根据康布里罂粟 Papaver cambrica L .(1753)具短花柱的特点 ,将其从无花柱 、仅有盘状柱头的罂
粟属(Papaver)中分离出来 ,并成立一个新的属 ,即绿绒蒿属 Meconopsis[ 3-4] , 自此以后 ,传统的有关绿绒
蒿属的分类系统 ,一直将西欧绿绒蒿作为该属的模式种[ 5-6].通过对西欧绿绒蒿和其它相关的罂粟亚科的
17种的 I TS区序列进行碱基比较和位点分析 ,结果显示 ,西欧绿绒蒿并没有显示出与它同属于一个属(绿绒
蒿属)的类群具有最大的相似性 ,相反西欧绿绒蒿与罂粟属的类群在 ITS 基因上最为相似 ,例如 ,西欧绿绒
蒿与 Papaver sp .在整个 ITS 区序列上的差异仅为 6.71%,因而说明西欧绿绒蒿与罂粟属的亲缘关系较其
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袁长春等:西欧绿绒蒿(Meconopsis cambrica)及其近缘类群 ITS 基因的序列分析
与绿绒蒿属的亲缘关系更近 ,更何况 ,最初西欧绿绒蒿本来就被置于罂粟属内.Kirstin 、Joachim 等曾采用
PCR-AFLP 的方法研究罂粟亚科 Papave roideae 的系统发育 ,并对绿绒蒿属进行了较为重点的采样 ,结果
表明绿绒蒿属和罂粟属都不是单源的 ,在其所得系统树上亚洲的绿绒蒿种类包括两个不同的支 ,并且与西欧
绿绒蒿和罂粟属构成并系关系.因此 ,将西欧绿绒蒿从绿绒蒿属划分出来 ,并把它重新归到罂粟属中的处理
较为合理.
表 2　西欧绿绒蒿与其它 17 样品之间在 ITS 区序列上的碱基差异
相比样品的名称　　　　 碱基缺失或插入(位点数)
碱基替换
(位点数)
ITS 区序列
长度/ bp
变异位点
所占比例＊/ %
paver sp . 5 40 671 6.71
Papaver somni f erum 5 53 671 8.64
Papaver spicat um 5 73 700 11.14
Papaver rhoeras 11 79 672 13.39
Sty lomecon heterophy lla 12 83 671 14.46
Meconopsis betonici f olia 9 75 672 12.50
Meconopsis lanci f olia 9 97 672 15.77
Meconopsis regia 17 100 682 17.16
Meconopsis torquata 14 111 675 18.52
Meconopsis gracilipes 13 123 678 20.06
Argemone mex icana 30 123 673 22.73
Bocconia f rutescens 77 131 676 30.02
Bocconia integia f olia 76 137 673 31.65
Chelidonnium ma jus 77 131 673 30.91
Macleaya cordata 73 152 679 33.14
Hy lomecon japonica 87 144 673 34.32
Canbya aurea 74 178 675 37.33
　　＊　变异位点所占百分比=碱基的缺失或插入位点数+碱基的替换位点数/ ITS 区序列长度
从表 2还可以看出 ,西欧绿绒蒿与亚洲绿绒蒿的种类也有相对较近的亲缘关系 ,这是因为罂粟属和绿绒
蒿属之间本身就具有较多的共同特征 ,在其它学者的研究结果中 ,均显示出二者为罂粟亚科内亲缘关系较近
的属.此外 ,西欧绿绒蒿与蓟罂粟属(Argemone)也显示出相对较近的亲缘关系 ,蓟罂粟属(Argemone)在
传统分类上与罂粟属 、绿绒蒿属同属于罂粟亚科 Papaveroideae 、罂粟族 Papave reae ,在庄璇 1993 年的系统
中将其从罂粟族中分离出来 ,并置于古罂粟族 Platystemoneae[ 17] ,说明从形态上反映出蓟罂粟属与罂粟族
有近的亲缘关系.对于其它同属于罂粟亚科的类群来说 ,西欧绿绒蒿与它们在 ITS 区序列上的差异均较大
(均超过 30%),例如 ,西欧绿绒蒿与 Canbya aurea 之间的差异达到 37.33%.这也表明 ,西欧绿绒蒿与它们
之间的亲缘关系相对较远.
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Differences Between Meconopsis cambrica and Its Allies Based
on the Evidence of ITS Sequence Analysis
YUAN Chang-chun1 , 2 , WU Dan-hong1 , YUAN Qiu-mei 1
(1.Schoo l of Life Science and Techno log y , Zhanjiang No rmal Co llege , Zhanjiang , Guangdong 524048 , China;
2.The Center of Natural Science and Techno lo gy , Zhanjiang No rmal Co llege , Zhanjiang , Guangdong 524048 , China)
Abstract:The sequence of the inte rnal t ranscribed spacers (I TS)of the nuclear ribosomal DNA of
West European Meconopsis cambrica (L.)vig .was determined and compared w ith the I TS sequences of
other 17 species from subfamily Papaveroideae.The leng ths of the 18 samples w ere 589-676bp.The total
sequences w ere aligned by the sof tw are C lustalX1.81 and the leng th of the aligned sequences w as 706 bp
(ITS1 271bp , 5.8S 162bp , ITS2 373bp , including the gap), of w hich 99 variable loci (14.0%)were pro-
vided.The resul ts show ed that the dif ference of Meconopsis cambrica f rom the species of the genus Papa-
ver was least and even w as smaller than its difference f rom the o ther species of the genus Meconopsis ,
which suggested that Meconopsis cambrica was clo ser to g enus Papaver than to the genus Meconopsis.
Therefo re , It seems that Meconopsis cambrica should be separated from the genus Meconopsis and be trea-
ted as a member of the genus Papaver.
Key words:Meconopsis cambrica;Papaveroideae;ITS
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