全 文 ：不同培养方式和ｐＨ对草地早熟禾原生质体分裂和
生长的影响
白生军，马晖玲，马　祥，安惠惠
（甘肃农业大学 草业学院／草业生态系统教育部重点实验室／甘肃省草业工程实验室／
中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州　７３００７０）
　　摘要：以３个草地早熟禾品种午夜Ⅱ号、新格莱德和橄榄球Ⅱ号继代培养２０次的愈伤组织为材料，
设置不同的ｐＨ水平，通过２种培养方式进行了原生质体培养，观测其原生质体的分裂和生长状况。结
果表明：３个草地早熟禾品种原生质体最适宜的培养方式为固液双层培养，固液双层培养中液相ｐＨ为
５．８（新格莱德ｐＨ６．０）时原生质体分裂率达最高值，午夜２号４２．８％、新格莱德５０．１％和橄榄球２号
２９．４％。基因型的差异对于原生质体培养成功与否有着密切的关系。
　　关键词：液体浅层培养；固液双层培养；原生质体分裂率；ｐＨ
　　中图分类号：Ｓ　５４３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９－５５００（２０１２）０１－００５０－０４
　　草地早熟禾（Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）是禾本科早熟禾属一
种优质冷季型草坪草。草地早熟禾抗寒性较差［１］，植
物生殖方式复杂多样，常以兼性无融合生殖方式进行
繁殖［２－６］，有些品种无融合生殖率高达９８％以上［３，６］，
有性杂交率低，很难获得杂种优势品种。以原生质体
培养为基础和前提条件的体细胞杂交技术不失为选育
草地早熟禾杂种细胞可行而有效的育种途径之一。
Ｖａｎｄｅｒ等［７］开创了草地早熟禾原生质体培养的先河，
Ｋｉｓｔｅｎ等［８］的研究进一步奠定草地早熟禾原生质体培
养的基础，但目前来看，早熟禾体细胞杂交技术还不成
熟，研究相对不够深入，仅获得一些阶段性成果［９，１０］。
　　实验以草地早熟禾午夜２号（ＭｉｄｎｉｇｈｔⅡ）、新格
莱德（Ｎｕｇｌａｄｅ）和橄榄球２号（ＲｕｇｂｙⅡ）３个品种的
优质愈伤组织为材料，研究不同培养方式和ｐＨ 对原
生质体分裂和生长的影响，探索不同品种原生质体的
最佳培养方式，以期为进一步完善草地早熟禾的原生
质体培养奠定基础。
　　收稿日期：２０１１－０５－０３；修回日期：２０１１－０６－１０
　　基金项目：甘肃省教育厅项目（０７０２－０３）资助
　　作者简介：白生军（１９８５－），男，甘肃榆中人，在读硕士。
Ｅ－ｍａｉｌ：１０７３３０８０２２０３＠ｓｔ．ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
马晖玲为通讯作者。
１　材料和方法
１．１　实验材料
　　将３个草地早熟禾午夜２号、新格莱德和橄榄球２
号品种的成熟种子接种于添加各品种诱导愈伤组织适
宜浓度激素的 ＭＳ培养基上（午夜２号：１ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ
＋０．３ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ；新格莱德：３ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ＋０．５
ｍｇ／Ｌ　６－ＢＡ；橄榄球２号：３ｍｇ／Ｌ　２，４－Ｄ＋０．１ｍｇ／Ｌ
６－ＢＡ；），诱导并优化培养得到生长状态质地良好的愈
伤组织。
１．２　实验方法
挑选各品种继代２０次生长状态良好的愈伤组织
１ｇ，置１０ｍＬ酶液（１３％甘露醇ＣＰＷ＋１％的纤维素
酶＋１％的离析酶＋０．３％的崩溃酶＋０．３％的果胶酶
和５ｍｏｌ／Ｌ的 ＭＥＳ，ｐＨ　５．８），２５±１℃，５０ｒ／ｍｉｎ摇
床暗中酶解１６ｈ。用２００目和３００目尼龙网过滤混合
液，离心５ｍｉｎ，依次用ＣＰＷ－１３溶液和原生质体培养
液清洗２～３次后用培养液调整原生质体密度为２×
１０５个／ｍＬ后进行培养［１１］。
用液体浅层培养和固液双层培养进行草地早熟禾
原生质体培养。其中，液体浅层培养以 ＫＭ８Ｐ为基本
培养基，添加不同品种各自愈伤组织诱导时适宜浓度
的激素（０．４５μｍ微孔滤膜抽滤灭菌），将纯化得到的
０５ 　　　　　　ＧＲＡＳＳＬＡＮＤ　ＡＮＤ　ＴＵＲＦ（２０１２）　　　　　　　　　　　　Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．１
DOI:10.13817/j.cnki.cyycp.2012.01.013
原生质体悬浮于其中，滴加２ｍＬ悬浮液到直径６ｃｍ
的培养皿底部，形成一薄层，用保鲜膜封口，于２６±
１℃下，恒温培养箱中静置培养；固液双层培养法：在
培养皿底部先铺８～１０ｍＬ　ＭＳ培养基（不添加激素，
ｐＨ　５．８），再在上面滴加２ｍＬ含有原生质体的ＫＭ８Ｐ
培养液进行浅层培养，用保鲜膜封口，于２６±１℃下恒
温培养箱中静置培养，每天轻轻晃动培养皿数次，使原
生质体与氧气充分接触。ＫＭ８Ｐ培养液的ｐＨ值设置
５．６、５．８、６．０共３个水平。
原生质体培养１５ｄ后在倒置显微镜下统计分裂
频率。比较不同品种的草地早熟禾原生质体的分裂生
长及再生能力差异。
　　原生质体分裂频率（％）＝（分裂的原生质体数／接
种原生质体数）×１００
２　结果与分析
２．１　不同培养方式及培养基ｐＨ对３个品种原生质
体分裂的影响
　　培养方式和培养基的ｐＨ对午夜２号原生质体的
分裂生长均有影响。固液双层培养比液体浅层培养更
能得到较高的原生质体分裂率（图１）。
图１　不同培养方式和培养基ｐＨ对午夜２号原生质
体分裂生长的影响
Ｆｉｇ．１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｐＨ
ｏｆ　ｍｅｄｉｕｍ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ＭｉｄｎｉｇｈｔⅡｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
　　ｐＨ对原生质体的分裂率具有明显影响。固液双
层培养中，ｐＨ５．８时原生质体分裂率最大（４２．８％），显
著高于ｐＨ 为５．６和６．０时的分裂率。研究表明，午
夜２号原生质体培养过程中，最适宜的培养条件是固
液双层培养方式，ｐＨ为５．８。
　　新格莱德的培养基ｐＨ 为５．６时，原生质体分裂
率在２种培养方式中均最低，而ｐＨ为５．８和６．０时，
２种培养方式中原生质体分裂率相近，均在４５％，固液
双层培养，ｐＨ６．０时原生质体分裂率达到最大值，为
５０．１％（图２）。
图２　不同培养方式和培养基ｐＨ对新格莱德原生质体
分裂生长的影响
Ｆｉｇ．２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｐＨ　ｏｆ
ｍｅｄｉｕｍ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｎｕｇｌａｄｅ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
培养方式和ｐＨ对橄榄球２号原生质体分裂的影
响不甚明显，原生质体分裂率均保持在２２．５％～
２９．４％。同一ｐＨ值下，相对液体浅层培养，橄榄球２
号原生质体培养采用固液双层培养可得到较高的原生
质体分裂率；下层固体培养基和上层液体培养基ｐＨ
均为５．８时，原生质体分裂率达到最大值，为２９．４％
（图３）。
图３　不同培养方式和培养基ｐＨ对橄榄球２号原生质体
分裂生长的影响
Ｆｉｇ．３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｐＨ　ｏｆ
ｍｅｄｉｕｍ　ｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ＲｕｇｂｙⅡｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
２．２　３个草地早熟禾品种原生质体形态及其变化
原生质体培养初期，３个草地早熟禾品种的原生
质体状态基本相似，在倒置显微镜下观察均表现为形
状规则、边缘清晰、大小均一和内含物较多的特性（图
４Ａ）。培养２～３ｄ后，可观察到原生质体再生细胞的
第１次、第２次分裂（图４Ｂ，Ｃ）。随后再生细胞持续分
裂，在低倍镜下即可观察到再生细胞形成的小细胞团
（图４Ｄ）。比较３个品种原生质体分裂率发现，新格莱
德原生质体的分裂率最高（图２），午夜２号略低于新
格莱德（图１），而橄榄球２号原生质体的分裂率远低
于前两者（图３）。
１５第３２卷　第１期　　　　　　　　　　　草 原 与 草 坪２０１２年
图４　Ａ优质的原生质体；Ｂ原生质体再生细胞第一次分裂；Ｃ原生质体再生细胞第二次分裂；Ｄ原生质体分裂产生的小细胞团
Ｆｉｇ．４　Ａ　Ｓｕｐｅｒｉｏｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ；Ｂ　Ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｃｅｌ；Ｃ　Ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｃｅｌ；
Ｄ　Ｔｈｅ　Ｃｅｌ　ｃｌｕｓｔｅｒｓ　ｆｏｒｍｅｄ　ｆｒｏｍ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
３　讨论
３．１　不同培养方式对原生质体分裂和生长的影响
不同的培养方式为原生质体提供不同的生长环
境，液体浅层培养适用于较易分裂的原生质体，操作比
较简单，对原生质体损伤较小，能有效防止有害物质过
多积累，且易于添加新鲜培养基。但该方法也存在诸
如原生质体分布不均匀、原生质体粘连、难以定点观察
原生质体等缺点。固液双层培养是对液体浅层培养的
改善。培养过程中，固体培养基中的营养成分可以被
上层液体中的原生质体吸收利用，同时，原生质体产生
的有害代谢物可被固体培养基吸收，尤其在固体培养
基中添加吸附剂时这种吸附作用更明显。黄文川等［１２］
研究了液体浅层培养和固液双层培养对烟草原生质体
分裂率的影响，发现固液双层培养的原生质体分裂率
显著高于液体浅层培养时的分裂率，当加厚双层培养
基中的固相至液相厚度的４～５倍时，更有利于烟草愈
伤组织的快速形成和植株再生。实验以２种培养方式
对３个草地早熟禾品种的原生质体进行培养，结果表
明，固液双层培养比液体浅层培养效果好，在固液双层
培养中原生质体具有较高的分裂频率。
３．２　培养基ｐＨ对原生质体分裂和生长的影响
　　原生质体在液体培养过程中，被完全浸没在培养
液中，液体培养基的ｐＨ 值通过影响渗透压稳定剂活
性而影响原生质体的分裂、生长，酶液的ｐＨ值条件主
要影响溶壁酶系统和渗透压稳定剂活性［１４］。当培养基
ｐＨ低于６．０时，新格莱德原生质体分裂率下降，午夜
２号和橄榄球２号原生质体在培养基ｐＨ为５．８时也
达到最大分裂频率。这与马向东等［１３］的研究结果一
致，但金凌云研究［１５］认为，原生质体再生率与ｐＨ关系
不大，今后有待进一步研究。
３．３　基因型的差异与原生质体生长和分裂的影响
实验研究中，选取２０次继代后第８ｄ生长状态相
近的愈伤组织进行原生质体游离和培养，培养条件和
培养密度相同，但３个品种原生质体分裂率呈现出较
大差异。培养初期未见品种间差异，持续培养发现橄
榄球Ⅱ号再生细胞在培养过程中停止分裂生长，而新
格莱德和午夜Ⅱ号再生细胞能持续分裂，长势良好。
可见不同品种之间原生质体培养效果差异很大，赵小
强［１１］对于草地早熟禾原生质体培养的研究结果也证实
了这一结论，可能是由于原生质体供体材料的生理状
态的差异造成的［１６］。故合适的基因型是进行草地早熟
禾原生质体培养成功的重要条件［５］。
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ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ＢＡＩ　Ｓｈｅｎｇ－ｊｕｎ，ＭＡ　Ｈｕｉ－ｌｉｎｇ，ＭＡ　Ｘｉａｎｇ，ＡＮ　Ｈｕｉ－ｈｕｉ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇｒａｓｓｌａｎｄ　Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ，
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ／Ｓｉｎｏ－Ｕ．Ｓ．
Ｃｅｎｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｇｒａｚｉｎｇｌａｎｄ　Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ　Ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ　Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｃａｌｕｓ　ｓｕｂ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　２０ｔｉｍｅｓ　ｆｒｏｍ　３ｖａｒｉｅｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ（ＭｉｄｎｉｇｈｔⅡ，Ｎｕｇｌａｄｅ　ａｎｄ
ＲｕｇｂｙⅡ）ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ｐＨ　ｖａｌｕｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ
ｔｈａｔ　ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ　ｄｏｕｂｌｅ　ｌａｙｅｒ　ｗａｓ　ｂｅｔｔｅｒ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ　ｐｅａｋｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｗｅｒｅ
４２．８％ｆｏｒ　ＭｉｄｎｉｇｈｔⅡ（ｐＨ　５．８），５０．１％ｆｏｒ　Ｎｕｇｌａｄｅ（ｐＨ　６．０）ａｎｄ　２９．４％ｆｏｒ　ＲｕｇｂｙⅡｉｓ　２９．４％（ｐＨ　５．８）ｒｅ－
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｇｅｎｏｔｙｐｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｓｈｏｗｅｄ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ．
　　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌｉｑｕｉｄ　ｓｈａｌｏｗｃｕｌｔｕｒｅ；ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ　ｄｏｕｂｌｅ　ｌａｙｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ；ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｒａｔｅ；ｐＨ
３５第３２卷　第１期　　　　　　　　　　　草 原 与 草 坪２０１２年