全 文 ：江苏农业学报(Jiang su J. of Ag r. Sci. ), 2006, 22(3):217～ 221
草地早熟禾转葡萄糖氧化酶基因植株的获得
佘建明 1 , 　张保龙 1 , 　梁流芳2 , 　何晓兰 1 , 　姚　姝1 , 　陈志一 2 , 　倪万潮 1
(1. 江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所 , 江苏 南京 210014;2. 杭州白云草业研究所有限公司 , 浙江 杭州 310006)
收稿日期:2005-09-14
基金项目:浙江省科技厅科研项目 “农杆菌介导法培育抗病虫草坪
禾草新品种(2003C32067);江苏省农业科学院重点学科
领域(研究领域)建设课题 “转基因林草抗病虫资源创新 ”
(6420301)
作者简介:佘建明(1945-),男,江苏苏州人 , 大学 ,研究员 ,从事农业
生物技术研究。 (E-m ai l) Sh eJM 101@yahoo. com. cn
　　摘要:　以从大青山草地早熟禾 、超级伊克利和午夜等 3个草地早熟禾品种的成熟种子诱导产生的颗粒状胚
性愈伤组织为受体材料 ,应用农杆菌介导法将含有葡萄糖氧化酶基因(GO)和新霉素磷酸转移酶基因(NPT II)的
重组质粒导入草地早熟禾。愈伤组织经携带 pBGO质粒的农杆菌 LBA4404的感染和共培养后 , 转到添加筛选剂
G-418 20 ～ 50 m g /L的愈伤组织继代培养基上进行筛选 , 选择对卡那霉素具有抗性的愈伤组织 ,进而获得再生植株。
试管植株的叶片经淀粉-碘化钾显色反应后 , 检测到转基因植株中产生了过氧化氢。 PCR分子检测证明 , GO基因
已整合到转化植株的基因组中。抗病性鉴定结果显示 ,转 GO基因植株对水稻纹枯病具有不同程度的抗性。
关键词:　草地早熟禾;颗粒状胚性愈伤组织;葡萄糖氧化酶;农杆菌介导;转基因植株;过氧化氢;水稻
纹枯病
中图分类号:　S688. 4　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2006)03-0217-05
Acquirement ofTransgen ic P lantsw ith G lucoseO xidaseGene inKentucky
B luegrass(Poa pra tensis L. )
SHE Jian-m ing1 , 　ZHANG Bao-long1 , 　LIANG Liu-fang2 , 　HE X iao-lan1 , 　YAO Shu1 , 　CHEN Zhi-y i2 ,
N IW an-chao1
(1. In stitu te of Agrobiolog ica lGenetics and P hysiology, J iangsu Academy of Ag ricu ltura lSciences, Nan jing 210014, Ch ina;2.Hangzhou B aiyun Pratac-
u ltura l In st itu te Ltd, Hangzhou 310006, Ch ina)
　　Abstract:　The pelle t em bryogenic ca lli induced from ma tu re seeds o fPoa pratensis L. cv. Daq ing shan, Tota l ec lipse
andM idnigh t we re used fo r the rec ip ient m ateria .l Through ag robac terium-m ediated transform a tion, the recom binant plas-
m id carring g lucose ox idase gene(GO) and neomyc in pho spho transferase gene(NPT II) was introduced in to Poa pratensis
L. A fter infected w ith agrobacte rium tum efac iens strain LBA4404 /pBGO , 20— 50 m g /L G-418 we re added to the ca llus
subcu ltu re medium. Regene ra ted p lan tsw ith kanamyc in resistancew e re obtained. By color reac tion w ith starch-K I, H2O2
had been exp ressed in lea f of the transgenic plan ts. PCR ana ly sis confirm ed tha tGO gene had been integ rated in to genome
o f the transgen ic p lants. By inocula ting leaves in vitro, the identifica tion o f disease resistance showed tha tGO transgen ic
p lants had resistance to Rhizoctonia solani.
K ey words:　Ken tucky b lueg rass(Poa pra tensis L); pe lle t em bryogenic ca llus; g lucose oxidase; ag robac te rium-
m ed ia tion; transgenic plant;hydrogen perox ide; rice shea th blight fungus(Rhizoctonia solani)
　　葡萄糖氧化酶 (G lucose oxidase, GO)催化 β-D-
葡萄糖氧化生成过氧化氢 (H2O 2)和葡萄糖酸。过
氧化氢是植物和病原微生物互作中快速合成的一种
早期活性氧类 ,在植物受到病原微生物侵染后引发
的一系列防御反应中起着非常重要的作用 ,如直接
杀死病原菌 、氧化交联细胞壁结构蛋白阻止病菌侵
入 、作为超敏反应组织者 、诱导植保素生成 、通过激
217
活水杨酸合成以诱导防卫系统基因的表达以及最终
诱导系统获得性抗性等[ 1] 。Wu等 1995年首次将
从黑曲霉中克隆到的 GO基因导入马铃薯 ,转 GO基
因的马铃薯植株内有明显的 H 2O 2积累 ,对软腐病和
晚疫病有明显的抗性 ,并提出利用 GO 基因产生
H2O2来提高植物的抗病性 [ 2] 。
草地早熟禾 (Poa pratensis L. )属冷季型草坪
草 ,具有生长缓慢 、不需频繁修剪 、耐践踏 、坪用性状
好等优点 ,是建植运动场和绿地草坪的优良草坪草
种 。但草地早熟禾易受病虫危害 。在草坪草病害
中 ,真菌性病害是最主要的一大类。在现有的草地
早熟禾草种中缺乏抗病的种质材料和品种 ,因而 ,用
常规育种方法难以选育抗病品种。本研究在已建立
起适用于开展农杆菌介导基因转化的草地早熟禾组
织培养植株再生受体系统和优化基因转化技术体系
的基础上[ 3, 4] ,将葡萄糖氧化酶基因导入草地早熟
禾 ,以期获得抗病转基因工程植株 ,为选育草地早熟
禾抗病品种开辟新的育种途径 。
1　材料与方法
1.1　供试品种与受体材料
以 3个草地早熟禾品种:大青山草地早熟禾
(Poa pra tensis L. cv. Daqingshan )、超级伊克利
(Poa pratensis L. cv. To tal eclipse )和午夜 (Poa
pratensis L. cv. M idnigh t )的成熟种子为外植体材
料;以成熟种子诱导产生的浅黄色 、干燥 、颗粒状胚
性愈伤组织为基因转化的受体材料。
1.2　培养基
基本培养基由 MS无机盐 、B5维生素组成 [ 5, 6] ,
其中蔗糖 3%、琼脂条 0. 8%。愈伤组织诱导和继代
培养基附加 2, 4-D 2.0 mg /L、BAP 0.2mg /L。绿苗
分化培养基添加 CPPU 2.0 mg /L、NAA 0.05mg /L。
各种培养基在高压灭菌前调整 pH值至 5.8。
1.3　质粒与菌株
携带 pBGO质粒的农杆菌菌株 LBA4404由中
国农业科学院生物技术研究所贾士荣先生惠赠 ,其
T-DNA区结构示意图为:RB-N os. P-Npt Ⅱ-N os. T-
35SP-Ψ-GO-Nos. T-LB。
1.4　卡那霉素抗性筛选
颗粒状愈伤组织在农杆菌菌液中浸泡 2m in
后 ,于愈伤组织继代培养基上培养 1 d,然后转入含
20 ～ 50 mg /L G-418、 250 mg /L 羧苄 青 霉素 、
250 mg /L头孢霉素的愈伤组织筛选培养基上进行
卡那霉素抗性筛选 。 20 d后 ,在卡那霉素筛选培养
基上挑选外观保持浅黄色的颗粒状愈伤组织 ,转入
附加 250mg /L羧苄青霉素 、250 mg /L头孢霉素的
绿苗分化培养基上再生植株 。
1.5　过氧化氢检测
在超净工作台上 ,取具有卡那霉素抗性的转基
因试管植株和对照非转基因试管植株的叶片 ,切成
约1 cm长的片段 ,平铺在经过高压灭菌的淀粉-碘化
钾(2.5%淀粉 、100mmol /L K I、1%琼脂糖 、1%葡萄
糖)上 ,观察叶片片段切口处的颜色变化 。
1.6　DNA提取和 PCR分子检测
DNA提取采用 CTAB法[ 7] , GO基因的检测采
用 PCR方法 。 PCR扩增程序为:94 ℃ 30 s, 58 ℃
50 s, 72 ℃ 80 s, 35个循环 , 扩增产物为 600 bp。
RCR扩增引物序列为:上链 GTCTTTGGAAAT-
GAGGGCTGGAA , 下链 CTCCAGGATGGACTTCAT-
TCCGATA。
1.7　抗病性鉴定
水稻纹枯病菌菌系 Rhizoctonia solan i R46由江
苏省农业科学院植物保护研究所提供。
抗病性鉴定采用叶片离体接种法[ 8] 。取盆钵
内植株新展开的叶片 ,置于培养皿内 ,平铺在湿纸巾
上 ,将活化的菌丝块接种到叶片的中部 。每个处理
3片叶 ,在培养室光照条件下 ,保湿 , 4 d后调查发病
情况 。
2　结 果
2.1　颗粒状胚性愈伤组织的诱导
以草地早熟禾:大青山草地早熟禾 、超级伊克利
和午夜 3个品种的成熟种子为外植体材料 ,在琼脂
为常规用量的愈伤组织诱导培养基上诱导产生的愈
伤组织绝大多数为半透明 、粘状结构 。当愈伤组织
诱导培养基中作为固化剂琼脂的用量增加 1倍时
(从 8 g /L提高到 16 g /L), 3个品种诱导产生的浅黄
色 、干燥 、颗粒状愈伤组织占愈伤组织诱导总数的比
例均从原有的 4% ～ 7%提高到 40%以上 (表 1、图
1)。
　　以大青山草地早熟禾和超级伊克利 2个品种的
成熟种子为外植体材料 ,在愈伤组织诱导培养基中
添加 3%的甘露醇 ,诱导产生的浅黄色 、干燥 、颗粒
状愈伤组织的比例为 15%左右。
218 江 苏 农 业 学 报 　2006年 第 22 卷 第 3期
表 1　培养基中不同琼脂用量培养的颗粒状愈伤组织诱导频率
Table 1　 Induction rates o f pellet call i cultured in the m edium sw ith different agar quantities
品种
Variety
琼脂 Agar
8 g /L 16 g /L
颗粒状块数
No. of pellet
粘状块数
No. of s ticky
比率
Rate(%)
颗粒状块数
No. of pellet
粘状块数
N o. of sticky
比率
Rate(%)
大青山 Daq ingshan 5 77 6.10 39 49 44. 32
伊克利 Tota l eclipse 5 119 4.03 56 73 43. 41
午夜 M idnigh t 11 146 7.01 63 65 49. 22
2.2　卡那霉素抗性愈伤组织再生植株
大青山草地早熟禾品种的成熟种子诱导产生的
颗粒状胚性愈伤组织 ,经农杆菌感染和共培养后 ,在
愈伤组织继代培养基上添加 20mg /L G-418进行抗
性筛选 ,具有卡那霉素抗性的愈伤组织在绿苗分化
培养基上可再生出植株。
超级伊克利和午夜品种的成熟种子诱导产生的
颗粒状胚性愈伤组织 ,经农杆菌感染和共培养后 ,在
愈伤组织继代培养基上添加 50mg /L G-418进行抗
性筛选 ,具有卡那霉素抗性的愈伤组织转到绿苗分
化培养基上亦可再生出植株(图 2)。
　　　　　　　　图 1　颗粒状愈伤组织
　　　　　　　　F ig. 1　Pellet ca lli
2.3　葡萄糖氧化酶的表达
具有卡那霉素抗性的试管植株的叶片片段置于
淀粉-碘化钾上 ,阳光照射 4 ～ 5 h,叶片的切口处显
现深蓝色。在培养室内日光灯照射 24 h,叶片的切
口处呈现浅蓝色;照射 36 h,叶片的切口处呈现蓝
色并向叶片片段中部扩展;照射 48 h,蓝色进一步加
深并继续向叶片中部扩展 (图 3)。对照试管再生植
株的叶片片段在淀粉-碘化钾上 , 48 h内无颜色反
应;72 h叶片的切口处呈现浅褐色 。
　　图 2　具有卡那霉素抗性的再生植株
　　F ig. 2　R egenera ted plan tletw ith kanamycin resistance
对大青山草地早熟禾 、超级伊克利和午夜等 3
个品种的 59株转化试管苗进行过氧化氢检测 ,测定
结果 ,葡萄糖氧化酶在 52株转化植株上得到了表
达。
2.4　PCR分子检测
随机取葡萄糖氧化酶得到表达生成过氧化氢的
6株移栽成活的超级伊克利转化植株 ,对这 6株的
基因组 DNA进行 PCR扩增。结果显示 ,这 6株植
株与阳性质粒的条带一致;而水 (空白对照 )和对照
非转基因植株均无相应的条带(图 4)。分子检测证
明 , GO基因已整合到这 6株伊克利转基因植株的基
因组中。
2.5　抗病性鉴定
采用叶片离体接种法 ,对 3株葡萄糖氧化酶得
到表达的大青山草地早熟禾和 6株经 PCR分子检
测确证为转 GO基因的超级伊克利的当代植株进行
抗病性鉴定的结果显示 , 2株大青山草地早熟禾和 4
219佘建明等:草地早熟禾转葡萄糖氧化酶基因植株的获得
图 3　转基因试管植株叶片片段在淀粉-碘化钾上的颜色反应
F ig. 3　Co lor reaction of leaf segm ent o f transgen ic plantlet in
starch-KI
1:为空白;2～ 5:对照非转基因植株;6 ～ 11:超级伊克利转基因
植株;12:为质粒;13:标记。
1:B lank;2 - 5:CK(non-transgenic p lan ts);6 - 11:Transgen ic plants
of total eclipse;12:pBGO;13:M arker.
　　　　　图 4　转基因植株的 PCR检测
　　　　　F ig. 4　PCR assay of transgenic p lants
株超级伊克利转基因植株对水稻纹枯病具有较高程
度的抗性。而对照非转基因植株的叶片病斑显著扩
增 ,转基因植株的叶片呈现出大小不等的病斑 ,个别
转基因植株的叶片肉眼观察不到病斑 (图 5、图 6)。
3　讨 论
水稻组织培养和农杆菌介导基因转化过程中 ,
在愈伤组织继代培养阶段和预分化阶段 ,培养基中
附加一定量的甘露醇或山梨醇进行高渗处理 ,有利
于产生干燥 、颗粒状愈伤组织和提高植株的再生频
率 [ 9, 10] 。本试验在愈伤组织诱导培养基中添加 3%
的甘露醇 ,颗粒状愈伤组织占愈伤组织诱导总数的
比例为 15%左右;愈伤组织诱导培养中琼脂的用量
1:对照非转基因植株;2、3:转基因植株。
1:CK(non-transgenic p lan ts);2, 3:Tran sgenic p lan ts.
图 5　大青山转基因植株叶片的抗病性
F ig. 5　B ioa ssay on Rhizoctonia so lani in leaves of transgen ic
plant of D aq ing shan
1:对照非转基因植株;2、3:转基因植株。
1:CK(non-transgenic p lan ts);2, 3:Tran sgenic p lan ts.
图 6　超级伊克利转基因植株叶片的抗病性
F ig. 6　B ioa ssay on Rhizoctonia so lani in leaves of transgen ic
plant of To tal eclipse
增加 1倍时 ,颗粒状愈伤组织占愈伤组织诱导总数
的比例则高达 40%以上 。由此可见 ,通过调控愈伤
组织诱导培养基的渗透压 ,有利于诱导草地早熟禾
成熟种子产生高频率的颗粒状愈伤组织 。以颗粒状
胚性愈伤组织为受体材料 ,应用农杆菌介导法基因
转化技术在参试的 3个草地早熟禾品种上都获得了
转 GO基因工程植株 。试验结果再次佐证了作者的
观点 ,即草地早熟禾农杆菌介导法基因转化成败的
关键因子在于建立适宜的转基因受体系统 [ 4] 。通
过调控愈伤组织诱导培养基的渗透压可获得高比例
220 江 苏 农 业 学 报 　2006年 第 22 卷 第 3期
的颗粒状胚性愈伤组织 ,从而建立起适用于开展农
杆菌介导基因转化的受体系统 ,为在草地早熟禾上
成功地运用农杆菌介导法基因转化技术奠定了基
础 。
过氧化氢能将碘化钾氧化形成碘 ,在淀粉存在
时显现出深蓝色 ,因此 ,可以用此方法检测外源基因
GO在转基因植株中表达产生的过氧化氢 。这种检
测方法能够在转基因试管苗早期培养阶段及时淘汰
逃逸的非转化植株 ,选择出过氧化氢酶得到表达的
转 GO基因工程植株。试验中 ,葡萄糖氧化酶得到
表达的再生植株在 PCR分子检测时均呈阳性 ,结果
显示 ,过氧化氢检测是一种适用于转 GO 基因工程
植株的简易 、快速 、高效的检测方法。
外源 GO基因表达产生的过氧化氢能够显著地
提高植物的抗病能力 ,在马铃薯 、棉花 、烟草和甘蓝
等多种双子叶植物中已经得到证实。彭昊等 (2003
年 )首次报道了转 GO基因水稻对稻瘟病具有良好
的抗性 ,证明 GO基因也可在单子叶植物中正常表
达 [ 11] 。转 GO基因香蕉对枯萎病具有抗性 [ 12]和转
GO基因草地早熟禾对水稻纹枯病具有抗性的试验
结果 ,进一步证明外源 GO基因表达产生的过氧化
氢能够显著地提高单子叶植物的抗病能力 。
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221佘建明等:草地早熟禾转葡萄糖氧化酶基因植株的获得