全 文 ：植 物 学 报 l, 9 0 , 3 2 ( 1 0 ) : 7 4 9一 7 5 3
再。 t o B o t四 `e o 反n i ` 口
滇紫草愈伤组织中的紫草色素
朱汝幸 曹日强 王曼丝 潘大谦
(南京大学生物系 ,南京 2 10 0 0 8 )
杜争鸣 陆婉芳 施耀曾
(南京大学化学系 , 南京 2 10 0 0 8 )
摘 要
滇紫草 ( 0 0 0 5 , a 户。 , 挤c u l a ` “ ` B u r · e , F r a o e h )的幼嫩根茎经二步法诱导产生的愈伤组织 ,含
有较原植物较高的紫草色素 。 经薄层层析鉴定 ,此种紫草色素由 6 种单体组成 ,其 R f 值与原
植物中的紫草色素各类衍生物非常近似 。 进一步采用硅胶 H 柱层析进行分离 , 最后得到 4 种
单体 。 经结构分析证明它们是 : 去氧紫色素 ( d eo xy ` ih k on in ) 、 口, 口一二甲基丙烯酸阿卡宁
(产, 月一 d i m e ` 五y l a c r y l a l k a n n i n ) 、 乙酞阿卡宁 ( a c e 仁; l a k a n n i。 ) 和 价乙酞氧基异戊酞阿卡 宁 (尽-
a e e t o x y i s o v a l e r y la l k a n n i n )
。
关健词 滇紫草 : 愈伤组织 ; 紫草色素 ;去氧紫草素 ; 俘 , 月一二甲基丙烯酸阿卡宁 ; 乙酸阿
卡宁 ;户一乙酚氧基异戊酞阿卡宁
护U R P L E — R E O P I G M E N T F O R M E D IN C A L L U S O F
O N O S M A P A N I C U 乙A T 以M B U R . E T F R A N C H
Z h u R u 一 x i n g
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C a o R i月 i a n g , W a n g M a n 一 51 a n d
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P a n D a阅i a n
2 1 0 0 0 8)
D u Z h e n g一 i n g , L u W a n 一 f a n g a n d
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c 户a r , , , , , o j C人e , i t: r , , N a ” j i , 9 U o i , e r : i : , -
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一 z e n g
N a n ii n g 2 10 0 0 8)
A bs t r a e t
孔 e e a l lus o f O n o 了功 a P a n i c u l a z u m p r o d、 l e e d b y y o u n g r o ot s a n d s t em s w i t h Z一 s t a g e d e u l t u -
er m et ho d e o n t
a i n s s li g h t l y h i g he r e o n r e n t s o f t h e Pu r p l e
一 r e d Pi g m e n r t h a n t h e o
r i g i n a l P la n r
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x s h ik o n i n d e r i v a t i v e s
,
w h os e R f
v a l u e s a r e ve r y e l o s e t o r h o
s e o f s h ik o n i n d e r iv a t i v e s i n t he i n t a e r r o o t a n d s re m
.
F o u r m o n om
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o f s hi k o n i n ha ve be e n obt
a i n e d w it h t h e e o l u m n e d c h r o m a t叩 r a P h y o f s i l i c a g e l H f r o m r h e e a l-
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.
T be tS r uc ut r e a n a l y
s i s s h o w s t h at t ha
s h ik o n i n d e
r iv at i v es a r e d e o x y hs ik o n i n
,
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,
p峨 i献h y ·
l a c r y l a lk a n n i n
, a c et y la l k a n n i n a n d 日一 ce t o x y i s o v a l e r y l a l k a n n i n .
本文于 ” 的 年 3 月收到 , 1 , 8 , 年 10 月收到修改稿。
植 物 学 报 3 2 卷
K e y wr od sO
: n o协 aP a” ic“ l az u衍 B ur. et F r ane h:p urp l e 一 re dp ig me nt ; d e ox y s hk i on i n;
日滔一 i met hy l e ar vl alk an n i n: e e at y l alk an n i n; 日一 e e at ox y i s ov ale ry l alk n an i n
紫草色素为紫草属L ( it o h: 娜 r m“ , L . ) 植物中的蔡醒类化合物 ,有多种衍生物 。 紫
草属植物有重要的药用价值。 其有效成分经鉴定证明为紫草素 ( s h i k o in )n 及其衍生物 。
T a b a t a ( 1 9 74
,
1 9 8 5 ) 报道硬紫草 ( L i t h o s户。 r . 。。 。 r , t h r o r h i z o n Si e b . e t Z u e c ) 通过
细胞培养能产生含量高于原植物的紫草色素 , 而且还能合成 4 类同原植物的紫草色素衍
生物 10[, ` 1。 我国目前未见经细胞培养的紫草色素形成的报道 。 本文报道了以滇紫草的组
织培养产生紫草色素的研究结果 。
材 .料 与 方 法
(一 ) 材料
滇紫草 ( o n o s , a 夕a , i c “ l a , “ 。 B u r . e t F r a n e h ) 采 自云南 , 本系植物园栽培 。
·
(二 ) 愈伤组织培养
取成年植株根茎部的幼嫩组织 `洗净 ,分别用 75 务 酒精和 0 . 1务 H g 1C 2 表面消毒 。 将
髓部 3一 5 m m 切段接种于诱导培养基 sL 中奋暗中培养 2 周后出现透明的白色愈伤组织 。
然后转人继代培养基 B , 中 , 暗中再继续培养 。 愈伤组织经过 6 代的转移后再转人色素形
成的培养基 M g 中。 大约 3 天可见到愈伤组织开始变红 , 3 周后取样 、 烘干 、 待用 。
1
. 诱导愈伤组织培养基 sL 基本培养基叨附加 2 , 4一 D 0 . 2 m g八、 B A P Zln g八、 。 . 8佑
琼脂 、 3 0 9 / l 蔗糖 。
2
. 愈伤组织继代培养基 B , 基本培养基附加 队 P 1 m g l/ 、 IA A 0 . 0 25 m g八、 N A A
o 一 m g / 1 、 蔽酸 1 m g / l 、 0 . 残沁琼脂。
醇
3
. 色素形成培养基
B A P 1 m g /l
`
I A A
氛;鲁 一
崛 基本培养基 「` 0J改加 M s
0
.
0 2 5 m g / l
、
N A A 0
.
1 m g / l
、
上述培养基 p H 6 . 5。
培养基的铁 盐、 另加 10 0 m g / l 肌
0
.
8% 琼脂 、 3 0 9八蔗糖 。
温度均为 26 ℃ 士 2℃ 。 暗中培养 。
图 1 滇紫草愈伤组织薄层层析
F i g
·
1 T h e l a y e r记c h r o m a t o -
g r a m
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f e a l l u s e x t r a e t o f
O移 o s m a 尸 a 那 i c “ l a 若“ 仍
(三 ) 提取与薄层层析定性检查
将愈伤组织置 50 ℃ 左右的烘箱中洪干 , 粉碎 。 用石油醚
(沸程 30 一 60 ℃ ) 进行渗晚 , 渗橇液经浓缩后得深紫红色浆状
物 。 最后以硅胶 H (青岛海洋化工厂生产 , 30 。一 40 。 目 )薄层
层析进行鉴定。 展开剂为石油醚 (沸程 60 一 90 ℃ ) : 乙酸乙
醋一 9 : 1 。 检查结果如图 1。
(四 ) 分离与结构分析
所得石油醚浆状物利用硅胶柱层析进行分离 , 以不同比
例的石油醚与乙酸乙醋混合液为洗脱剂 。 石油醚 : 乙酸乙
醋 ~ 9 :9 1 , 石油醚 : 乙酸乙醋 ~ 9 8 : 2 。 经过一次层析结果
得到组分 I 和 n , 再经过一次层析可得 到 组 分 1 和 IV 4 个
单体 。
将柱层析所得到的滇 I 、 n 、 1 、 VI 单体 , 分别以正己烷 一乙酸乙醋或石油醚为溶剂进
1 0 期 朱汝幸等 : 滇紫草愈伤组织中的紫草色素
行重结晶纯化 , 然后再进行结构分析 。
结构分析 : 温度计未经校正 。 熔点选用 Y an ac o M P一 , 0 型显微熔点测定仪 。 ’ H -
N M R 用 v a r i a n x L一 2 0 0 型仪测定 , T M S 为内标 , M s 用 V G Z A B一 H S 型仪测定 , 离
子源为 EI 。
(五 ) 紫草色素及其衍生物含 t 测定
分别取原植物和愈伤组织粉碎物以石油醚 (沸程 30 一 60 ℃ ) 浸泡 、 渗滴 、 浓缩 。 浓缩
物用石油醚 : 乙酸乙醋 ~ 9 :1 定溶至 10 m l 。 最后在波长为 , 2 0 n m 处进行比色 , 以测定
紫草色素的总含量 。
另各取上述母液的稀释液 10 川 进行薄层层析分离 , 待紫草素各衍生物斑点清晰以
后 , 晾干 、挖下斑点 , 并在无斑点处挖下同样面积的硅胶作为空白对照。 用石油醚: 乙酸
乙酷 ~ 9 : 1浸泡过夜 。 取出上清液在 5 2 0 n m 处进行 比色 , 以测定紫草素主要衍生物的含
量 。
实 验 结 果
(一 ) 结构鉴定
滇 l( ” : 1) 将滇 I 单体在正 己烷一乙酸乙醋 ( 20 : 1) 中重结晶 , 得红色原气状晶体 。
m p
.
9 0一 9 1 . 5℃ , M S m / 2 (多 ) 2 7 2 ( M 卞 , 1 0 0 ) , 2 2 9 ( 3 0 ) , 2 1 6 ( 3 2 ) , 2 0 4 ( 7 5 ) , 6 9 ( 2 5 ) 。
`
H
一
N M R ( C d C I
,
) 占 : 1
.
6 1 , 1
.
7 1 (
5
.
3H x Z
, f )
, 2
.
1 1 , 2
.
3 1 ( d t
.
,J ~ 7
, ZH
,
d )
, 2
,
6 6 ( t
,
J ~ 7
, ZH
, C )
, 5
.
1 7 ( t
, J ~ 7
, I H
, e
)
, 6
.
8 7 ( d
, J ~ l
, zH
,
b )
, 7
.
2 2 , 7
.
2 7 (
s ,
I H x Z
, a
)
, 1 2
.
5 0 , 1 2
.
6 6 (
s , Z A r 一 o H , D ZO 交换消失 )数据与文献 [ 1 ]一致 。 证 明此单
体为去氧紫草素 。
滇 H ( ” : l) 滇 1 单体在石油醚 ( 60 一 90 ℃ ) 一乙酸乙醋 ( 20 : 1) 中重结晶 , 得紫红
色针状结晶 。 m p . 10 4一 1 0 6℃ , M S m / 2 (多 ) , 3 7 0 (M 卞 , 弱 ) , 2 7 0 ( 1 0 0 ) , 2 , , ( 7 0 ) , 2 2 9
( 15 )
, 2 2 7 ( 10 )
, 10 0 ( 9 )
, 8 3 ( 2 0 )
, 6 9 ( 8 )
, 5 7 ( 1 2 )
, 5 5 ( 10 )
。 ’
H
一
N M R ( C D c l , ) 占 : 1
.
5 8 ,
1
.
7 0 ( s
, 3 H x Z
, f )
, 1
.
9 5 , 2
.
1 7 ( d
, J ~ 1
, 3 H x Z
, h )
, 2
.
5 2 (m
, ZH
,
d )
, 5
.
1 5 ( t
, J ~
7 , I H
, e
)
,
5
.
7 8 ( t
, J ~ 7
, I H
, g )
,
6
.
0 1 ( t
, J ~ 7
, I H
, e
)
, 6
.
9 5 ( d
, J一 1 , I H , b ) ,
7
.
1 8 , 7
.
2 6 (
s , I H x Z
, a
)
, 1 2
.
4 4 , 1 2
.
5 9 (
: , Z A r 一 O H , n Zo 交换消失 ) 。 数据与文献 [一]
一致 。 证明是 月, 夕一二甲基丙烯酸阿卡宁 。
滇 n l( 9 8 :2 ) 滇 川 单体在石油醚 ( 60 一 90 ℃ ) 一乙酸乙醋 ( 20 : l) 中重结晶 ,得紫红
色针状晶体 。 m p . 1 0 8一 1 1 0℃ , M s m / 2 (多 ) 3 3 0 ( M 卞 , 弱 ) , 2 7 0 ( 10 0 ) , 2 5 5 ( 5 0 ) ,
2 2 7 ( 7 )
, 2 2 0 ( 3 6 )
, 2 19 ( 5 6 )
, 6 9 ( 9 )
, 5 5 ( 5 )
o ’
H
一
N M R ( C D e l
3
) 子: 1
.
, s , 1
.
7 0 (
s , 3 H x Z
,
f )
, 2
.
15 (
s , 3 H
, g )
, 2
.
5 1 ( m
, ZH
,
d )
, 5
.
1 3 ( t
, J 一 7 , I H , e ) , 6 . 0 3 ( t , J ~ 7 , I H ,
e )
,
7
.
0 1 ( d
, J 一 l , I H , b ) , 7 . 2 0 , 7 . 2 7 ( s , l x Z , a ) , 1 2 . 4 6 , 1 2 . 6 1 ( s , 2 ^ r 一 O H , D ZO
交换消失 ) 。 数据与文献 〔 l] 一致 。 证明是乙酸阿卡宁 。
滇 w ( 9 8 : 2 ) 滇 w 单体在正己烷一乙酸乙醋 ( 20 : l) 中重结晶 , 得紫色粉 末 。 。 .P
5 0吧 (分解 ) , M s m / 2 ( 多 ) 4 3 0 ( M t , 弱 ) , 4 14 ( 1 1, 3 ) , 2 7 0 ( 10 0 ) , 2 5 5 ( 4 2 ) , 2 2 9 ( 9 ) ,
2 1 9 ( 5 )
, 19 1( 3 )
, 1 4 3 ( 4 )
, 8 3 ( 1 8 )
, 6 9 ( 4 )
, 5 9 ( 3 )
, , 5 (丘 )。 ` H一 N M R ( C D Q s )
`
a : 1
.
, 4 ,
1
.
, 7
,
一
1
. ` , (。 , 3 H , 6H , 3H , f , h ) , 2 . 0 1 ( s , 3 H , i ) , z . 5 a( m , z H , d ) ,
’
3
,
o试 , , J ~ 15 ,
3 2卷
Z H
, g )
, 5
.
1 5 ( t
, J ~ 7
, I H
, e )
, 6
.
0 8 (
t , J ~
0
。
4 8 1
0
。
4 1 1毛匀
1 0
。
4 5
1 0
.
3 8
O
。
30 m
1 0
.
3 0拿今肚
愈伤组舞 e a 一u s 原植物 o r i: i n a一 p 一a n -
滇紫草愈伤组织、 原植物紫草素衍生物薄层图 谱
以及 R f 值
18094200图
F i g
.
2 T h e l a y e r e h r o m a t o g r a m o f s h i k o
d e r i v a t i v e : o f c a l l u s a n d o r i g i n a l P l a n t
th e i r R f v a l u e s
黑
7 , I H
, c
)
, 7
.
0 4 ( d
, J ~ 1
, I H
, b )
.
7
.
2 6 , 7
.
2 8 (
s , I H
x Z , a )
, 1 2
.
4 4 , 1 2
.
6 1
(
s , ZA r 一 O H , n Zo 交换消失 ) 。 数据与
文献 〔l] 一致 。 证明是 户乙酸氧基异
戊酸阿卡宁 。
(二 ) 原植物和愈伤组织紫草 色 素
及其主要衍生物含 t 比较
采用硅胶薄层层析法进行原植物和
愈伤组织紫草总色素和主要衍生物的定
性定量 比较 。 从层析 图谱 以及 fR 值来
看 , 二者的紫草衍生物是相似的 。 紫草
色素的总含量比愈伤组织较高一些 。 主
要衍生物— 乙酞阿卡宁和 夕, 月一二甲基丙烯酸阿卡宁的含量也均不相同 。 愈
伤组织中的乙酞阿卡宁比原植物高 , 而
声, 夕一二甲基丙烯酞阿卡宁却是原植物比愈伤组织中的高 (图 2 ; 表 1 ) 。
T a b l e
农 1
T h 。
该策草愈份组织 、 原植物簇草色素及主要衍生物含 t 比较
e o n t e n t s o f m a i n s h i k o
t h o s e o f o r
乎,
1 g
n d e r i v a t i v e s o f e a l l u s e o m P a r e w i t h
i n a l P l a n t
材 料 紫草色素 ( m g / g ) 乙酞阿卡宁 ( m g / g ) 月, 月一二甲基丙烯铣阿卡宁
M a t e r i a l P i g m e n t o f P u r P l e h e r b A e e t y l a k a n n i n ( m g / g )
( m g l g ) ( m g / g ) 月 , 月一 d i m e rh y l a c r y l a l -
k a . n i n ( m g / g )
愈伤组 织 5 。 9 9 l 。 2 4 l 。 1 7
C a l l u s
原植物 5 。 1 0 0 。 8 5 3 。 l 斗
o r i g i n a l p l a n t
P < 0
.
0 5 P < 0
.
0 5 P < 0
.
0 5
讨 论
本文实验表明 ,通过二步法培养的滇紫草细胞能产生较高于原植物的紫草色素 , 而且
其衍生物也同原植物 。这一结果与文献报道相同 “ .1 1] 。通过结构鉴定证明它们是 : 去氧紫
草素 、 乙酞阿卡宁 、 月, 夕一二甲基丙烯酞阿卡宁以及 户乙酸氧基异戊酚阿卡宁 。 另外两种
衍生物的 fR 值也与原植物相同 (图 2 ) , 但由于量太微 , 尚未得到纯品 , 结构将有待进一步
鉴定 。
愈伤组织与原植物中的紫草素主要衍生物经过比较 , 发现其含量悬殊很大 。 表 1的
结果可看出 ,在原植物中 声, 夕一二甲基丙烯酞阿卡宁含量很高 ,约 占总紫草色素的 62 多 以
上 , 而同样成分在愈伤组织中只占总紫草色素的 19 . 6多。 反过来 , 乙酸阿卡宁在愈伤组织
中可 占总紫草色素的 2 .0 7多 , 而在原植物中只占总色素 16 . 7外。另外 , 从薄层图谱也发现 ,
去氧紫草素也有类似情况。 我们认为 : 这种含量的变化 , 一方面可能是衍生物之间的棍
1 0期 朱汝幸等 : 滇紫草愈伤组织中的紫草色素 7 5 3
互转化听引起 。 因为它们的结构主要区别是在侧链上 。 另一方面可能是由于植物在进行
细胞培养过程中 , 所选用的外界条件影响着紫草色素的形成 t` 81 。 据 T a ha t a 等 ( 19 8 5 ) 报
道 : 光抑制紫草色素的形成 ,而目噪乙酸是紫草色素形成的有效促进剂比10J 。 第三 , 不少
报道指 出 [,: ] 次生物质与细胞生长和分化有着密切的关系 。 作为次生物质的紫草色素衍
生物的变化也肯定受培养细胞的动态变化所影响。 我们将开展这方面的研究 , 以便找出
能形成比原植物更多的某种有效成分的最佳时期 。 从而提高滇紫草的经济价值 。
在我们对滇紫草愈伤组织诱导形成色素时期 , 选用了一些与文献不同的条件 ,其中包
括蔡乙酸 。 从实验中观察到蔡乙酸并不像文献所报道的那样 ,会抑制色素的形成 。不仅如
此 , 如果除去蔡乙酸 , 组织很快萎缩 。 细胞生长不仅受到妨碍 , 而且色素形成也受到影响 。
参 考 文 献
,J .I, .J
ó 胜、 .J百几23月,rJf`一卫`.r
.Lr.
[ ` 」
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, .J工..U.`
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砂夕了五尸。 尸五12 0爪 P人夕多 o c 五` 仍 f了 r r ” 1 3 : 92 7一 9 32 .
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