全 文 ：收稿日期:2015-11-15; 修订日期:2016-03-20
基金项目:湖南师范大学蛋白质与发育生物学教育部重点实验室(2014
年)开放课题(No． 2015DF03);
西藏自治区科技厅自然科学基金项目(No． 2015ZＲ － 13 － 5)
作者简介:郝豆豆(1992-)，女(汉族)，山西吕梁人，西藏大学在读硕士研
究生，主要从事植物学工作．
* 通讯作者简介:张勇群(1976-)，女(汉族)，湖南益阳人，西藏自治区人
民政府成都办事处医院副教授，硕士研究生导师，博士学位，主要从事藏
药材基因与功能研究工作．
拉萨蒲公英基因组 DNA
不同提取方法的比较及 PCＲ检测
郝豆豆1，雷 鸣1，武俊喜2，拉 多1，张勇群3*
(1．西藏大学，西藏 拉萨 850000; 2．中国科学院地理科学与资源研究所，西藏 拉萨 850000;
3．西藏自治区人民政府成都办事处医院，四川 成都 610000)
摘要:目的 比较不同研磨方式、不同提取方法提取的拉萨蒲公英叶片基因组 DNA的效果。方法 分别用液氮和提取缓
冲液两种研磨方式对拉萨蒲公英叶片进行研磨处理，用 5 种方法提取拉萨蒲公英叶片基因组 DNA，分别用紫外分光光度
计法、琼脂糖凝胶电泳、PCＲ扩增检测 DNA的质量。结果 用提取液研磨可以充分除去色素、酚类、蛋白质等物质，提取
的 DNA纯度高，降解少，用液氮研磨提取的 DNA 杂质多，降解严重;高盐低 pH 法提取的 DNA 的 A260 /A280 接近 1． 8，
A260 /A230 为 1． 93，Ezup柱式试剂盒法提取的 DNA的 A260 /A280 为 2． 01，A260 /A230 大于 2． 0，说明这两种方法提取的
DNA的纯度比较高，其余 3 种方法提取的 DNA的纯度都比较低。结论 用提取缓冲液研磨提取的 DNA的质量高于液氮
研磨，并且缓冲液研磨能降低 DNA提取成本，操作安全，因此是一种经济适用的方法;Ezup柱式试剂盒法操纵简单，但是
价格昂贵，且 DNA的得率低，高盐低 pH法成本低，但是提取时间比试剂盒长，两种方法提取的 DNA的 PCＲ效果相差不
大，高盐低 pH法适用于需要大批量提取拉萨蒲公英叶片 DNA的研究。
关键词:拉萨蒲公英; 研磨方法; 提取方法; PCＲ扩增
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 08． 091
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)08-2034-03
拉萨蒲公英(Taraxacum sherriffii)为多年生草本，生长于海拔
2300 ～ 4500m的山坡草地，青海及西藏都有［1］，本种外层总苞片
先端有显著小角及较宽的边缘。蒲公英(Taraxacum mongolicum)
为常用的传统中药，最早在唐朝《新修本草》已有记载曰:“味甘，
平，无毒。主妇人乳痈肿”，明代李时珍《本草纲目》及以后的草
本均有相应记述［2］。现代药理研究显示，蒲公英具有抗内毒素、
抗肿瘤、抗氧化自由基、抑菌、免疫调节、健胃等作用［3］。
目前对蒲公英的研究有核型研究［4］、化学成分分析［5］、药理
药化［6］等方面，在分子生物学方面的研究比较少，近年来，DNA
分子标记技术已在药用植物资源利用与保护方面得到广泛应用，
并成为研究热点［7，8］，而提取高质量的基因组 DNA 是顺利进行
分子生物学实验的基础。朱田田［9］、马帅［10］、张玲［11］等对不同
保存条件对植物叶片基因组 DNA提取质量的影响进行了比较研
究，发现植物叶片在低温条件下保存能有效防止 DNA的降解，提
取的 DNA质量最好，所以本研究所用的拉萨蒲公英叶片保存在
－ 80℃备用。经典的植物基因组 DNA提取之前需用液氮充分研
磨植物材料，以保证 DNA的提取质量，而液氮需贮藏在特殊的容
器(液氮罐)中，价格昂贵，且运输和使用时具有一定的危险
性［9］。该实验利用了液氮和提取液两种研磨方式研磨拉萨蒲公
英叶片，结果发现提取缓冲液研磨更有利于及时除去蛋白质、多
糖、酚类等次生代谢物质，使提取的 DNA 杂质更少、DNA 完整性
更高［12］。所以不需液氮即可充分研磨植物材料，减少了 DNA 的
提取成本，且提取的 DNA质量较高，能满足后续的分子生物学研
究。目前植物基因组提取方法有很多种，但是由于不同的植物所
含代谢产物的组成和含量各不相同［13］，所以相应的最佳基因组
DNA的提取方法也不同。本实验用了 5 种不同的提取方法，旨
在寻找提取拉萨蒲公英叶片基因组的最佳方法。
1 材料与方法
1． 1 实验仪器 Eppendorf 5417Ｒ型高速冷冻离心机，Milli － Q纯
水仪(购自 Millipore)，超低温冰箱，水浴锅 － CD3192 型恒温控制
器，研钵，1． 5ml离心管，不同量程的移液器及相应的枪头(购自
上海生物公司)，核算蛋白测定仪(Eppendorf BioPhotometer
plus) ，WD －9413B凝胶成像分析仪(购自北京市六一仪器厂)，
电泳槽(购自 BIO － ＲAD公司)，PCＲ － T100(购自 BIO － ＲAD 公
司)。
1． 2 实验试剂 液氮，无水乙醇，氯仿，异戊醇，异丙醇，CTAB，
NaCl，PVP，DTT，Tris，EDTA，SDS，NaOH，HCl，λ － marker，marker －
D，核苷酸染料，loading buffer，石英砂，Agarose M，Taq 酶，BPB，
dNTP，MgCl2，10 × Taq 酶配套缓冲液，ITS2 引物。［均购自生工
生物工程(上海)有限公司］。
1． 3 实验材料 拉萨蒲公英采自西藏大学新校区校园，新鲜的拉
萨蒲公英叶片于 － 80℃保存。
1． 4 DNA提取方法 每种方法分别对应两种不同的研磨方式:
液氮研磨:称取 － 80 ℃下保存的新鲜叶片 150 mg 放入研钵中，
加入液氮迅速充分研磨，然后将其转移到 1． 5 ml的离心管中;提
取液研磨:称取 － 80℃下保存的新鲜叶片 150 mg放入研钵中，加
入 1 ml提取液以及适量的石英砂迅速研磨成浆，然后将其转移
到 1． 5 ml的离心管中。
1． 4． 1 传统 CTAB法［14］ ①在上述用液氮研磨好的叶片中加 1
ml的提取液，混匀，然后和用提取液(0． 2 mol·L －1 Tris·HCl
(pH8． 0)，2%可溶性 PVP，2% β －巯基乙醇，0． 03 mol·L －1EDTA
(pH8． 0)，3%CTAB)研磨好的叶片一起放置于 65 ℃中保温 30
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min，不时轻轻颠倒。②取出稍冷却后，10000 r /min，4℃离心 10
min，取上清，加入等体积的氯仿 /异戊醇(24∶ 1)，震荡至出现乳
浊状，静止分层后 10000 r /min，4℃离心 10 min。③取上清加入
1 /3 体积无水乙醇轻微混匀后加入等体积氯仿 /异戊醇(24∶ 1)
混匀，立即 12000 r /min，4℃离心 10 min。④取上清液加入等体
积的 － 20 ℃预冷的异丙醇，混匀，－ 20 ℃静置 30 min，14000 r /
min，4 ℃离心 22 min。⑤弃上清，用 70%的乙醇洗涤沉淀 2 次，
风干后溶于 50 μl TE。做好标记，保存于 4℃冰箱中备用(－
20℃进行长期保存)。
1． 4． 2 改良 CTAB 法［15］ 改良 CTAB 提取液:0． 1 mol /L Tris －
HCl(pH 8． 0)，0． 2 mol /L EDTA(pH 8． 0) ，0． 5 mol /L NaCl，3%
CTAB，2% PVP，3% DTT。
第①步同传统 CTAB法中的第①步。②稍冷却后 4℃，10000
r /min离心 10 min，取上清加入等体积苯酚 /氯仿(1∶ 1)，震荡混
匀后 4℃，12000 r /min 离心 10 min。③取上清加入等体积的氯
仿 /异戊醇(24∶ 1)，振荡混匀后 4℃，12000 r /min 离心 10 min。
取上清加入等体积 － 20℃预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀于 － 20℃
静止 30 min。④于 4℃，12000 r /min离心 20 min，弃上清，用 70%
的乙醇洗涤沉淀两次，风干后溶于 50 μl TE。做好标记，保存于
4℃冰箱中备用(－ 20℃进行长期保存)。
1． 4． 3 改良 SDS法 ①将用液氮研磨好的叶片中加入 1 mL提取
液，混匀，然后和用提取液［0． 05 mol /L Tris·HCl(pH 8． 0)，3%
可溶性 PVP，2% β －巯基乙醇，0． 06 mol /L EDTA(pH8． 0)］研磨
好的叶片一同于冰上放置 10 min。②10000 r /min，4℃离心 5
min，弃上清，加入提取液重悬沉淀，离心后弃上清，在沉淀中加入
700 μl 65℃预热的裂解缓冲液［0． 06 mol /L Tris·HCl(pH 8． 0)，
0． 03 mol /L EDTA(pH 8． 0) ，0． 06 mol /L NaCl，2% SDS］，充分混
匀后于 65℃中保温 30 min，不时轻轻颠倒。③取出稍冷却后加
入 500 μl氯仿 /异戊醇(24∶ 1)，颠倒成乳浊状，于 10000 r /min，
4℃离心 10 min，重复抽提，直到中间没有蛋白质层。④取上清加
入 1 /4 体积的乙醇和 1 /3 体积的 5 mol /L NaAc(pH4． 8)，混匀后
立即 10000 r /min，离心 10 min，取上清加入等体积的 － 20℃预冷
的异丙醇，于 － 20℃静置 30 min。⑤14000 r /min，4℃离心 22
min，弃上清，用 70%的乙醇洗涤沉淀 2 次，风干后溶于 50 μl TE。
做好标记，保存于 4℃冰箱中备用(－ 20℃进行长期保存)。
1． 4． 4 高盐低 pH法 高盐低 pH法提取液:0． 2 mol /L NaAc，2%
可溶性 PVP，3% β －巯基乙醇，0． 05 mol /L EDTA(pH8． 0)，1． 5%
SDS。
①同传统 CTAB 法中的第①步。②取出稍冷却后，于 4℃，
10000 r /min离心 10 min，取上清液加 2 /3 倍体积 5． 0 mol /L NaAc
(pH 4． 8)溶液，混匀后于 0℃放置 15 min。③4℃，12000 r /min离
心 10 min，取上清液加入等体积的氯仿 /异戊醇(24∶ 1)，震荡至
出现乳浊状，静置分层后于 4℃，10000 r /min 离心 10 min。④取
上清液加入等体积的 － 20℃预冷的异丙醇，于 － 20℃静置 30
min，然后于 14000 r /min，4℃离心 22 min。⑤弃上清液，用 70%
的乙醇洗涤沉淀 2 次，风干后溶于 50 μl TE。做好标记，保存于
4℃冰箱中备用(－ 20℃进行长期保存)。
1． 4． 5 Ezup柱式试剂盒法 试剂盒购于生工生物工程(上海)有
限公司，将拉萨蒲公英叶片按照上述两种方式分别研磨，然后按
照 Ezup柱式植物基因组 DNA 抽提试剂盒的使用说明对拉萨蒲
公英叶片基因组 DNA进行提取。
1． 5 DNA的检测方法
1． 5． 1 紫外分光光度计检测法 利用核酸蛋白测定仪(Eppendorf
BioPhotometer plus)检测基因组 DNA 的质量浓度和纯度:取 2 μl
DNA溶液，稀释 50 倍，然后测定浓度及 A260 /A280、A260 /A230
的值，从而判断所提 DNA的纯度。
1． 5． 2 琼脂糖凝胶电泳检测 ①配置 0． 8%琼脂糖凝胶，胶块凝
固后放入呈有 TAE缓冲液的电泳槽中(将胶孔端置于负极)②取
4 μl基因组 DNA样品，与加有核苷酸胶体染料的 BPB 1 μl 充分
混合后点样于胶孔中;用 λDNA作为对照。③电压为 100 V条件
下电泳 50 min，用凝胶成像系统(北京六一仪器)照相保存。
1． 5． 3 PCＲ扩增检测 用以上 6 种方法提取的基因组 DNA为模
板，采用核糖体基因 ITS － 2F(ATG CGA TAC TTG GTG TGA
AT)、ITS － 2Ｒ(GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT)为引物进行
PCＲ扩增。25 μl 体系包括:双蒸水 15． 8 μl，10 × Buffer 2 μl，
MgCl2 2 μl，(2． 5 mmol /L)dNTP 2 μl，(10 mmol /L)引物(F、Ｒ)各
自 1 μl，Taq 酶 0． 2 μl，DNA 1 μl(10 μl 体系中 DNA 模板为 40
ng)。
PCＲ扩增程序为:94℃预变性 5 min;进入 PCＲ循环，94℃ 30
s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，40 个循环;72℃延伸 10 min。
PCＲ产物用琼脂糖凝胶电泳检测，胶浓度为 1． 5%，以 D －
Marker为对照，在 100 V的电压下，电泳 50 min。
2 结果
2． 1 5 种方法提取的 DNA 的浓度、纯度及提取过程的比较 由
表 1 可以得出:提取液研磨处理后，传统 CTAB 法和改良 SDS 法
提取的 DNA的 A260 /A280 的值小于 1． 6，说明 DNA样品残留有
大量蛋白质或酚类物质，并且改良 SDS 法提取的 DNA 沉淀的颜
色为褐色，说明酚类物质被氧化，没有除去。改良 CTAB 法和高
盐低 pH法的 260 /A280 的值接近 1． 8，说明这两种方法去除蛋白
质和酚类物质的效果很好。Ezup 柱式试剂盒法的 A260 /AA280
的值大于 2，说明有 ＲNA的污染。传统 CTAB法、改良 CTAB法、
改良 SDS法提取的 DNA 的 A260 /A230 的值远远小于 2，说明有
大量的小分子物质的残留，DNA 污染较严重;高盐低 pH 法提取
的 DNA的 A260 /A230 的值接近于 2，小分子物质基本去除干净;
试剂盒法提取的 DNA 的 A260 /A230 的值大于 2，说明这种方法
去除小分子物质的效果最好。从最后提取的 DNA 的量来看，传
统 CTAB法提取到的 DNA 最少。由表 1 还可以得到:液氮研磨
处理后，用五种方法提取得到的 DNA 的 A260 /A280 的值和
A260 /A230 的值均不如提取液研磨所得到的 DNA。
2． 2 琼脂糖凝胶电泳结果及分析 由图 1 得出:用两种不同的研
磨方式处理后，同一种方法提取到的 DNA的效果明显不同，液氮
研磨处理得到的 DNA极易降解，而提取液研磨得到的 DNA的完
整性较好;用提取液研磨后，5 种方法中，高盐低 pH 法和试剂盒
法得到的 DNA的条带整齐明亮，且点样孔中没有残留物质，改良
CTAB法和改良 SDS法得到的 DNA 条带也较整齐，但点样孔中
残留物较多，说明小分子物质污染严重，传统 CTAB 法得到的
DNA降解较严重。
2． 3 PCＲ扩增检测 由图 2 得，传统 CTAB法和改良 SDS法都得
不到 PCＲ产物，很可能是由于用这两种方法提取的 DNA所含杂
质太多，抑制 PCＲ反应。另外 3 种方法都能得到 PCＲ产物，说明
用这 3 种方法提取到的 DNA都能满足后续的分子生物实验。
3 讨论
3． 1 研磨方式比较 通常为了保证提取到的 DNA 浓度，提取植
物基因组 DNA都采用液氮研磨。本研究提取的 － 80℃保存的新
鲜拉萨蒲公英叶片基因组 DNA 采用两种研磨方式，一种是液氮
研磨，另一种是用 65℃预热的提取液研磨。液氮研磨叶片整个
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提取过程中提取液的颜色都比提取液研磨叶片的提取液颜色深，
且液氮研磨最后得到 DNA 的纯度比提取液研磨所得的 DNA 纯
度低，说明在提取液研磨叶片的过程中可以及时且充分的除去色
素和蛋白质、防止多酚类物质的氧化等［16］。液氮研磨操作过程
中有一定的危险性，容易冻伤。由于操作的不熟练，比如:研磨不
是很迅速，研磨过程中液氮完全挥发干净，造成 DNA 的严重降
解［17］;叶片磨碎后要及时装进加有提取缓冲液的离心管中，如果
暴露在空气中稍一冻化，材料中的多酚类物质会很氧化成棕褐色
与 DNA不可逆的结合，最终导致提取的 DNA残留大量杂质［18］。
用提取液研磨相对安全、操作方便、易掌握，且成本比液氮要低的
多，所以建议使用提取液研磨提取植物 DNA，是一种方便、安全、
廉价行之有效的方法。
表 1 五种方法提取的 DNA的浓度、纯度及提取过程的比较
研磨方式 提取方法 编号 A260 /A280 A260 /A230 浓度 /μg·ml －1 抽提液颜色 DNA颜色
提取缓冲液研磨 传统 CTAB 1 1． 06 0． 64 70 浅绿 白色
改良 CTAB 2 1． 84 1． 32 450 无色 白色
改良 SDS 3 1． 42 0． 76 580 浅绿 浅褐色
高盐低 pH 4 1． 82 1． 93 610 无色 白色
Ezup柱式试剂盒 5 2． 01 2． 38 155 无色 白色
液氮研磨 传统 CTAB 6 1． 09 0． 64 40 深绿 棕色
改良 CTAB 7 1． 65 1． 18 360 浅绿 白色
改良 SDS 8 1． 18 0． 68 415 深绿 褐色
高盐低 pH 9 1． 52 1． 18 525 浅绿 白色
Ezup柱式试剂盒 10 2． 08 1． 77 115 浅绿 白色
M:λDNA;1 ～ 4:传统 CTAB法;5 ～ 8:改良 CTAB法;
9 ～ 12:改良 SDS法;13 ～ 16:高盐低 pH法;
17 ～ 20:Ezup柱式试剂盒;
1，2，5，6，9，10，13，14，19，20:
提取液研磨;3，4，7，8，11，12，15，16，17，18:液氮研磨
图 1 两种不同方式研磨后用 5 种方法提取的基因组 DNA电泳图谱
M:D － Marker;1，2:传统 CTAB法;3，4:改良 SDS法;
5，6:高盐低 pH法;7，8:改良 CTAB法;9，10:Ezup柱式试剂盒法
图 2 提取液研磨后用 5 种方法提取的 DNA的 PCＲ扩增电泳图谱
3． 2 提取方法比较 提取 DNA首要的是保证其一级结构的完整
性，排除其他生物大分子(蛋白质、多糖、脂类等)的污染，以及核
酸分子之间的污染，并且不应存在过高浓度的有机溶剂和金属离
子，以避免化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏和对后续的酶
反应产生抑制作用，尽量简化操作步骤，不但可节省时间，更重要
的是可减少提取过程中各种有害因素对核酸的破坏［19］。因为
DNA在紫外区有强吸收，最大吸收波长为 260 nm，而蛋白质在
280 nm 波长处有强吸收，因此可以根据 A260 /A280 和 A260 /
A230大致判断出 DNA的纯度。纯 DNA样品的 A260 /A280 应为
1． 8 或在 1． 7 ～ 1． 9 之间;如果 A260 /A280 值大于 1． 9，表明有
ＲNA污染;A260 /A280 小于 1． 6，表明样品中存在蛋白质、多糖、
多酚污染［17］;A260 /A230 应大于 2． 0，如果 A260 /A230 值小于
2． 0，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚
等［20］。传统 CTAB法虽然过程比较简单，但是 DNA 浓度低，杂
质较多，完整性差，得不到 PCＲ 扩增产物，这种方法不适合提取
拉萨蒲公英叶片 DNA;改良 SDS 法过程繁琐、耗时长，所提 DNA
杂质较多，抑制 PCＲ 反应，此法也不可取。高盐低 pH 法、改良
CTAB法、Ezup柱式试剂盒提取的 DNA都符合 PCＲ反应的要求，
即所提 DNA 可以用于以后分子生物实验，但是改良 CTAB 法中
应用到了饱和试剂酚，成本较高，增加了操作步骤，对实验人员的
健康也有一定的损害，所提取的 DNA的 A260 /A230 的值较低，小
分子污染较严重，而 Ezup柱式试剂盒成本较高，所以综合各个因
素，高盐低 pH为此 5 种方法中提取拉萨蒲公英叶片基因组 DNA
的最佳方法。
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收稿日期:2015-09-24; 修订日期:2016-02-28
基金项目:国家重点基础研究发展计划(“973”计划)
(No． 2012CB518500)
作者简介:张晓露(1989-)，女(汉族)，辽宁大连人，辽宁中医药大学在读
硕士研究生，硕士学位，主要从事针灸机理研究工作．
* 通讯作者简介:陈以国(1957-)，男(汉族)，辽宁朝阳人，辽宁中医药大
学针灸推拿学院教授，博士研究生导师，博士学位，主要从事针药并举药
代动力学研究工作．
电针内关对心肌缺血 ASIC3 － / － 小鼠
内向整流钾离子通道蛋白表达的影响
张晓露1，王 颖1，戴俭宇1，许亚涵1，杨恩达1，荆 秦1，王琪格2，陈以国1*
(1．辽宁中医药大学针灸推拿学院，辽宁 沈阳 110847;
2．辽宁中医药大学第一临床学院，辽宁 沈阳 110847)
摘要:目的 研究电针内关穴对心肌缺血酸敏感离子通道亚基 3 基因敲除(ASIC3 － / －)小鼠心肌细胞内向整流 K +通道相
关蛋白表达的影响，在离子通道层面探讨电针改善心肌缺血的可能机制。方法 ASIC3 － / －小鼠 36 只，随机分为空白组、
模型组、内关组、列缺组、足三里组和非经非穴组，每组 6 只，皮下注射盐酸异丙肾上腺素建立心肌缺血模型。检测小鼠
电针治疗前后心电图 ST段变化，Western blot检测内向整流钾离子通道(即 Kir2． 1、Kir． 2 和 Kir2． 3)相关蛋白表达量。结
果 治疗后，与模型组相比，内关组、列缺组和足三里组小鼠 ST段幅值均有所回落，内向整流钾离子通道相关蛋白表达量
则均显著回升(P ＜ 0． 05)，其中内关组优于列缺组及足三里组(P ＜ 0． 05)，列缺组优于足三里组(P ＜ 0． 05) ;非经非穴组
与模型组之间无明显差异(P ＞ 0． 05)。结论 内关穴可明显改善小鼠心肌缺血状态，其可能机制是引起 Kir2． 1、Kir． 2 和
Kir2． 3 蛋白表达量的回升。
关键词:电针; 内关穴; 心肌缺血; 内向整流钾离子通道
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2016． 08． 092
中图分类号:Ｒ2 －03 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2016)08-2037-04
心肌缺血是指心脏因血供减少、心肌代谢障碍而引起的一种
病理状态［1］。持续的心肌缺血可引起缺血性心脏病。目前为
止，心血管疾病仍为引起我国城乡居民死亡的首要原因［2］，超过
30%的心血管疾病患者死亡原因为缺血性心脏病［3］。而缺血性
心脏病致死的重要原因之一是缺血性心律失常［4］，其病理基础
为缺血状态下心脏离子通道失衡［5］。钾通道参与心脏的复
极［6］，其中内向整流钾通道(Kir)可调控心肌细胞的兴奋性并维
持心肌细胞的静息电位［7，8］。心肌细胞中的 Kir 通道由 Kir2． 1、
Kir2． 2、Kir2． 3 三种亚基构成［9］。已有许多研究证明 Kir 通道是
治疗心率失常的关键［10 ～ 12］，可减轻心肌缺血所带来的负面影响。
目前关于针刺治疗心肌缺血机制的研究多为对神经系统的
影响［13 ～ 15］、对心肌内源性保护物质及血管生成的调节［16，17］以及
对心肌酶的调节［18，19］等方面，鲜有文献研究其在离子通道层面
的机制。本实验通过观察电针酸敏感离子通道亚基 3 基因敲除
(ASIC3 － / －)小鼠心包经内关穴、肺经列缺穴、胃经足三里穴以及
非经非穴点对其 Kir2． 1、Kir2． 2 和 Kir2． 3 蛋白表达的影响，在离
子通道层面揭示电针对心肌缺血的可能性保护机制，为针刺改善
心肌缺血症状提供新的可能性依据。
1 材料与材料
1． 1 动物 8 周龄雄性 ASIC3 － / －小鼠(C57BL /6)，SPF 级，体重
(22 ± 5． 5)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。在
温度(24 ± 1)℃、相对湿度(50 ± 5)%条件下适应性喂养小鼠 1
周。整个实验过程均严格按照实验动物伦理规范操作。
1． 2 主要试剂 盐酸异丙肾上腺素(ISO，东京化成工业株式会
社，批号:PTAPE － LJ)，Kir2． 1 抗体(Abcam 公司，货号:
ab65796)，Kir2． 2 抗体(Abcam公司，货号:ab84821)，Kir2． 3 抗体
(Abcam公司，货号:ab84822)，β － actin(北京全式金生物科技有
限公司)，蛋白提取试剂盒(碧云天生物研究所)，蛋白 marker(北
京全式金生物科技有限公司)，PVDF膜(北京索莱宝生物科技有
限公司)，ECL发光试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)，SDS
－ Page凝胶试剂盒(北京天恩泽生物科技有限公司)。
1． 3 主要仪器 华佗牌针灸针(φ 0． 19 × 13mm，苏州医疗用品厂
有限公司)，电针仪(G6805 － AⅡ型，汕头市医用设备厂有限公
司)，电子天平秤(BS223S型，赛多利斯科学仪器有限公司)，Pow-
erlab八通道生理记录仪(PL3508 型，AD Instrument 公司)，高速
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2016 VOL． 27 NO． 8 时珍国医国药 2016 年第 27 卷第 8 期