全 文 ：遗 传 学 报 , 2 5 (5 ) : 4 4 9一 4 53 , 199 8
月 e at G e n e价a iS n ic a
长穗堰麦草酸性磷酸酶与碱性磷酸酶
编码基因的染色体定位
李玉京` 李 滨 ’ 刘建中` 李继云 “ 姚树江 , 李振声 ’ ①
( 1 中国科学院遗传研究所 北京 1 0 01 0 1)
(2 中国科学院生态环境研究中心 北京 1 0 00 8 5)
摘要 以一套中国春一长穗堰麦草二体异附加系与二体异代换系为材料 , 用等电聚焦 ( IE )F 研
究长穗堰麦草基 因组中酸性磷酸酶 (cA hP )与碱性磷酸酶 (AP H )编码基因的染色体定位 。 结
果表明 , cA hP 大多聚焦于 p H S一 7 范围内 ,其编码基因位于 3 E染色体 ,而 AP H 编码基因则位
于 4 E染色体 。 由于 S E染色体的附加 , cA hP 活性带强度显著减弱 。
关键词 长穗堰麦草 , 二体异附加系 , 二体异代换系 , 酸性磷酸酶 , 碱性磷酸酶 ,基因定位 , IE F
分类号 0 3 42
磷酸化酶是一类水解磷酸单醋键的水解酶 l, ’ ] , 根据发挥生理活性的最适 p H 范围可
将其分为酸性磷酸酶 (A cP H ) ( E . C . 3 . 1 . 3 . 1) 与碱性磷酸酶 (A P H ) ( E . C . 3 . 1 . 3 . 2) 。 研究表明 ,
cA hP 与细胞的许多生理生化过程有关 , 包括细胞 防御 、 细胞 自身降解 、 细胞质 P代一库的
维持等 3[] 。 高等植物中该酶与细胞壁 的转 化 、 果实成熟以及 种子发芽等过程有密切关
系 t4一 6] 。 植物在低磷营养胁迫下 , 根系分泌到生长环境 中的 cA hP 量显著增加 、 活性加强 ,
这对于活化土壤中的无效态有机磷成为有效磷起到重要作用 。 此外 , 营养胁迫条件下 , 植
物体内 cA hP 的诱导合成增加 、 活性提高 , 对于充分利用体内有限的磷源 , 确保与耐低磷胁
迫有关的生化过程对磷的急需具有重要意义 7[] 。 因此 , 动物 、 植物与微生物体内的 A cP h 一
直受到有关学者的重视 。 但 cA P h 同工酶极其复杂 , 淀粉凝胶电泳及聚丙烯酞胺凝胶电泳
(PA G E )对其分辨率很低 8[ 一 ` ,
· ’ ] , 虽然 IE F 对其分辨率有较大提高 , 仍难 以清晰地分辨该酶
的同工酶 1[ ’ ] 。 尽管如此 , 前人已对普通小麦 、 黑麦及中间堰麦草 (奄 r op y r on in et r m e id u , )
等 物 种 的 cA hP 编码 基 因 进 行 了染 色体定 位 {9, ’ 3, ’ , ’ 2] 。 然 而 , 迄 今 为 止 长 穗僵 麦 草
(奄 r op y r on e ot gn a ut m) 基因组 中酸性磷酸酶 (cA hP )与碱性磷酸酶 (妙H )编码基 因的染
色体定位 尚未见报道 。 长穗堰麦草是普通小麦的野生近缘物种 , 具有普通小麦基因组所
不具有的耐盐碱 、 耐痔薄 、 抗病等优 良性状 , 是对普通小麦或其他作物进行遗传改 良的重
要基因资源 , 而改 良的重要手段之一是利用染色体工程的原理和方法将外源染色体 (或片
段 )导人普通小麦 。 因此 , 寻找其基 因组的生化标记以鉴定外源染色体具有重要意义 。 本
实验 以一套 中国春一长穗堰麦草二体异附加系 与一套二 体异代换系为材料 , 用等电聚焦
本文于 1 9 9 7刃6一 4收到 , 19 9 8刃 5一 1 2修回
国家自然科学基金重大课题资助项目 (编号 : 3 9 7 9 01 0 0)
① 通讯联系人
4 50 遗 传 学 报 25 卷
(I E F )的方法研究长穗僵麦草基因组 (Z=n Zx = 14 , E )中 cA hP 与 AP H 编码基因的染色体定
位 , 旨在寻找长穗僵麦草基因组的生化标记 , 以期 为进一步从事长穗僵麦草耐低磷营养胁
迫的生理生化机制研究提供信息 。
1 材料和方法
1
.
1 植物材料
一套中国春一长穗恨麦草二体异附加系与一套二体异代换系 以及双二倍体 (2 n =
x8 二 56 , A A B B D D E E )和 普通 小麦中 国春均 由美国加 利福 尼亚大 学 (U C , L地v is) Jan
VD
O r a k 教授和仲干远博士提供 。 附加系分别标记为 D A I E 、 D A Z E 、 … … D A 7 E , 异代换系
分别标记为 D S I E ( I A ) 、 E巧 I E ( I B ) 、 DS I E ( I )D 、 E 6 2 E ( ZA ) 、 … … D S 7 E (7 )D .
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 附加系及双二倍体的染色体鉴定 采用常规压片法 , 醋酸洋红染色 。
1
.
.2 2 cA Ph 与 A P H 种子用 3% 的过氧化氢消毒后催芽 , 选取镜检符合要求的植物材
料置于 25 ℃的光照培养箱 中生长 7天 , 用残留的胚乳提取 cA P h 和 AP H
。 每一胚乳加 50 川
提取液 (0 . l m of / L N石A c , p 7H . 0) , 匀浆研磨 , 室温提取 l h , 4℃ , 1 5 o 0 pr m离心 5而 n , 取上
清液 一 20 ℃保存备用 。
1
.
2
.
3 I E F 凝胶制备 : 3 0% CA r / B i s ( 2 9 : l ) 2 . 2 8 lnI ; 16% 甘油 14 . 7ml ; Am p h o l i n e 1 0 50
产 l ; 10% AP s 6单 l ; T EM E D Z如 l 。 A m pho lien 的 p H 范 围分别 为 : p 4H 一 6 ; p H S一 8 ;
p珊一 9 . 5 。 电极缓冲液 : ( + ) : o . s m o l / L H A c , ( 一 ) : lm o l / L 卜伯O H 。 IEF 用 hP amr 时 i a
/ L K B 公司 M u l it p h or n 等电 聚焦仪 , 终电压为 3 0 0 0 v , 电流 80 Il l A , 功率 s w , 预 电泳
2 0而 1 , V h = 9 0 0 0伏特小时 。
1
.
2
.
4 染色 参照 T a n k s l e y 等 ( 1 95 3 )的方法 [ , ` 1略加修改 。
cA hP
: 卜恤A c 5 0
nmr
o l / L, p H S
.
1 10 iln ; M g CI
: · 2乓 o , l m o l / L l m l : R s t C冶m e t
GB C 10 0m g
; l % p一磷酸茶醋 ( 50 % 丙酮为溶剂 ) 3而 。 凝胶在染色液中 30 ℃保温 hl , 自
来水冲洗 , 拍照 。 Ap H : irT s一H C I o . l m of / L pSH . 5 10 0而 ; gM a Z
·
2坟 0 l m of 厂L l m七
asF
t B lu e 双 S al t l o om g : l % p一磷酸蔡醋 ( 50 0, 丙酮 为溶剂 ) 3时 ; 3 0℃保温 3 0而 n 。
cA Ph活性染色的专一性检测 : 染色液 中加人 0 . s om l/ L aN F (sA hP 活性的专一性抑制
剂 ) , 以检测是否有 cA hP 活性酶带产生 。
2 结果与讨论
2
.
1 cA hP 活性染色的专一性检测
染色液 中 cA hP 活性 的专一性抑制剂 aN F 的浓度为 0
.
s n ln l o l L 时 , 几乎观察不到
sA hP 活性带 。 这表明该染色方法对 cA P h 活性带的染色是高度专一的 , 即图版 1一A和 卜 B
中所显示 的均为 A c Ph 活性带 。
.2 2 A c P h 编码基 因的染色体定位
分别以 p 4H 一 6 、 p H S一 8 和 p3H 一 9 . 5 范围的 Am p h o l ien 对胚乳 cA hP 作 IE F 分析 (图
版 l - A 、 图版 卜B) , 均能清晰地分辨出 cA hP 的活性带 , 且其活性区域在 p H S一 7 的范围内 。
这表明 cA hP 酶蛋白的等电点 ( IP )为州5一 7 。
以 p4H 一 6 和 pSH 一 8 的 A m p ho l ien 的 IE F 分析结果表明 , 3E 附加系 ( D A 3 )E 与代换系
【sD 3 E ( 3A ) 、 D s3 E ( 3B) 、 sD 3E (3 )D 」以及双二倍体均出现特征带 (图版 卜A 与图版 卜8中箭
5期 李玉京等 :长穗堰麦草酸性磷酸酶与碱性磷酸酶编码基因的染色体定位
r
头所示) , 而其他附加系 、 代换系及背景亲本则不具有 。 由此推测 3 E染色体可能携有 A cP h
同工酶的编码基因 ,根据 cM ln ot hs 的命名规则 1[ 51 , 将该基因命名为 A c Ph - lE 。
’
A c hP 同工酶由多基因家族编码 , 普通小麦的 A c P h基因位于 4 A L 、 4 B S 、 4 D S 与 SA 、
S B
、
s d
, ’ · ’ 0] , 中间堰麦草位于 7 A罗2] , 黑麦则位于 7sR (胚乳 cA P h) 与 7RL (叶片 与根系 A c P h) l0[ , ’` , ’ ] , 而不是位于 4 R 染色体 。 _ 据此 , S ial an s 等 s1I 认为 ,进化过程 中黑麦的 4RL 与
7SR 曾发生过相互易位 。 然而 , C var al ho 等 l[ 3] 发现普通小麦第 5部分同源群 ( SA 、 S B 、 SD 染
色体 )也携有 cA hP 编码基因 。 因此 , S ial n as 等的结论似乎不太全面 。 进化过程中 , 小麦族
植物中广泛存在基因组内染色体之间重排现象 。 例如 , 黑麦中除 I R染色体外 , 其余 6条染
色体均发生过易位【, 6J , 长穗堰麦草 (2n = x2 = 14 , E )E 染色体组中不存在 4 E / S E 及 4 E /
7 E 易位 〔” ] , 但不能排除其他染色体之间的易位 。 本实验结果表明 , 长穗堰麦草胚乳 cA P h
编码基 因位于 3E 而不是位于 4 E 或 7 E染色体 ,说明 3E 与 4 E 或 3 E 与 7 E染色体有可能发
生过易位或重排 。 此外 , 由于 S E染色体的附加 , 与其他附加系和背景亲本相 比 , D A S E 的
cA P h 活性带显著减弱 。 低磷胁迫下根系分泌到生长介质 中的 A c P h 活性升高 , 然而 D A S E
的 A c Ph 活性升高幅度显著低于其他附加系和背景亲本 。 这些结果表明 , SE 染色体可能携
有 cA hP 活性的抑制基因 。
.2 3 胚乳 A P H 编码基 因的染色体定位
以 p 3H 一 9
.
5 的 A m p h o li n e 对胚乳 AP H 作 I E F分析 (图版 卜C ) , 4 E 的附加系 (D A 4 E )
及双二倍体均出现特征带 , 而其他附加系及背景亲本均不具有 。 因此 , 长穗堰麦草 A P H编
码基因位于 4 E 染色体 , 根据 cM l nt os h 的命名规则 l[ ’ l , 将该基 因命名为 Ap H-[ lE 。
3 小结
长穗僵麦草 3 E染色体携有耐盐碱特性的基 因 1 8] , 而 4 E 染色体则与耐低磷胁迫特性
密切相关 (李玉京等 , 19 9 7 , 待发表 ) 。 因此 , 通过染色体工程手段将 3 E 与 4 E染色体导人普
通小麦育成异代换系或易位系是改 良小麦耐盐碱与耐低磷胁迫特性 的重要手段之一 。 可
靠而简便的生化标记对于外源染色体的鉴定具有重要意义 。 本实验结果表明 , 长穗恨麦
草 cA hP 编码基 因可能位于 3 E染色体 , 而 A P H基因则位于 4 E 染色体 , 因此可作为长穗堰
麦草 3 E 与 4E 染色体的又一生化标记以检测该染色体与普通小麦的易位系与代换系 。
参 考 文 献
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2 l
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L l B i n
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LI U iJ an 忆 h o n g LI iJ 一un Z Y A o
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5期 李玉京等 : 长穗堰麦草酸性磷酸酶与碱性磷酸酶编码基因的染色体定位 4 5 3
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c P h w as lo e a ot d o n e hr o m o s o m e 3E
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an d het
s e e o id n g fo r e dn o s ep mr
A P H o n e h r o m o s o p n e 4 E
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nI ad id it on
, 也 e ac it v iyt b an d s o f cA P h i n D A SE w as
ifa n Uy d u e ot ht e ad d i it o
n o f e h r o m o s o me SE
.
K e y w o r d s 奄 r侧刃声r o n e lo n g a tU m, lA i e n id s o r n l e ad id it o n l i n e s, 压 5 0而e s u b s it ut it o n
l i n e s
,
cA id hP
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IE F, C h
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图 版 说 明
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.中国春一长穗僵麦草二体异附加系与二体异代换系及背景亲本中国春胚乳 cA hP 同工酶的 I E F图谱
( Am hP of i
n e p H范 围 为 5一 8 )。 1 .跳 l (E l )A : 2 . DS 1(E l B ); 3 .邵 l (E l )D : 4 .哪 2 (E 2 )A ; 5璐 2 (E 2 B );
6
.
DS 2 (E 2 )D
: 7
.
DS 3 (E 3 A )
: 8
.
DS 3 (E 3 B); 9
.哪 3 (E 3 )D : 1 0. 双二 倍 体 ; 1 r . DS 4 (E 4 A ); 12 .眺 4 (E 4 B );
13邵 4 (E 4 )D : l 4 DS 5 (E 5 B ): l 5 . DS s (E 5 )D : 16哪 6 (E 6 A ); 17 .眺 6 (E 6 B ): l s DS 6 (E 6 )D : 19 .双二倍体 ;
20
.
sD 7域 7 )A ; IZ . sD 7玫 7)D ; 2 . 中国春 ; 24 .双二倍体
B
. 中国春一长穗很麦草二体异附加系与背景亲本中国春胚乳 A chP 同工酶的 IE F图谱 ( Am p h iol en p H范
围为 4一 6) 。 l . D A I;E .2 D AZ氏 .3 D A 3;E 4 . D A 4;E 5 . D A S E; 6 . D A6;E 7 . D A 7 ;E 8 .双二倍体 ; 9 .中国春 ;
10
. 邵 3域 3 A ); 1 1 . DS 3玖 3 B ); 12 . DS 3玖 3 )D
C
. 中国 春 一长穗惬麦草二体异 附加系 、 双二倍体及背景亲本 中国春胚乳 A卫 H同工酶的 IE F图谱
(A
n l ph o li en 的 p H范围为 3一 9 5 )。 I D A I E: 2 . D A ZE: 3 D A3 E ; 4 . D A 4 E ; 5 . D A S E ; 6 . D A 6 E: 7 . D A 7 ;E 5 .
双二倍体 ; 9 . 中国春
xE lP an a it o
n o f P laet
A
.众 ag r a n l o f e dn o s沐 mr ac i d hP o s Ph a枉巧 e i s o z yme s i n al i e n id s o而 e a d d jit o n an d s u bs it ut it o n li n e s o f
C ih en s e s p ir n旷 gA r oP y r o挂 e ot昭 a扭川 (Z n = Zx = 14, E )E , 翻 p ih IP iO d a n d hte i r b a c k g or u n d 孙re n t
C ih ne s e s p ir n g
·
l
·
DS l (E l )A ; 2
·
sD l (E l B )1 3
·
DS l (E l )D
; 4
·
sD 2 (E 2 A )
; 5
·
sD 2 (E 2 B ); 6
·
DS 2 (E 2 )D ;
7
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D S 3玖3 )A : 8 .现 3域 3B ) : g DS 3域3 )D ; 10 . A」11 Pih lP o id : 1 1 . DS 4城4 )A : 12 . DS 4域4 B ): 13 .邵 4斌4 )D :
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DS S玖S )D ; 16 .邵 6域6 )A ; 17 . DS 6域6 B ): 18 . DS 6班6 )D : 1 9决 m p ih P lo id : 2 0 . DS 7域7 )A :
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S P ir n g 一奄 r op y r o n e ot gn a 似 , (Z x = Zx = 14, E )E , am ihP P IiO d a n d hte i r b ac gk or u n d P别陀 n t C h ine s e
S P ir吧 (Am户 ol ine p H 4 ~ 6 ) . 1 . D A I E ; 2 . D A Z E : 3 D A 3 E ; 4 . D A 4 E ; 5 . D A S E : 6 . D A 6 E : 7 . D A 7 E ;
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S P ir gn
一奄 r q yP r o n e ol n g a栩 m ( Z n = Z x = 14 , E )E , am Phi lP io d an d het i r b ac kg or t l n d Paer n t C ll in e s e
S P ir ng (A
」11 P h o line : p 3H ~ 9
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