全 文 ：菘蓝和马蓝基因组 DNA ＲAPD指纹图谱的建立
于英君，肖井仁，姜颖，杨欣*
(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘 要:目的:采用 ＲAPD法研究菘蓝和马蓝的遗传差异性，药材的真假和优劣。方法:利用随机扩增多
态性 DNA( ＲAPD) 技术，对菘蓝和马蓝的基因组 DNA 进行了遗传差异性分析。结果:指纹图谱显示出
了马蓝和菘蓝资源丰富的遗传多样性。结论: ＲAPD 技术为鉴别中药材菘蓝和马蓝真伪和优劣提供了
理论依据和现实意义。
关键词:菘蓝;马蓝; ＲAPD;遗传差异性
中图分类号:Ｒ282． 5 文献标识码:A 文章编号:1002 － 2392(2013)06 － 0026 － 02
收稿日期:2013 － 09 － 27 修回日期:2013 － 10 － 21
作者简介:于英君(1953 －) ，男，教授，主要从事中药有效成分抗肿瘤作
用及延缓衰老作用。
* 通讯作者:杨欣(1987 －)，女，博士研究生，主要从事分子生物学研究。
随着中国医药行业的迅速发展，人们越来越重视
中药材的鉴别，中药材的质量和真假直接影响着人们
的身体健康，甚至影响着人们的生命安危，很早人们用
自己多年的经验看药材表面、看颜色、看断面等来鉴别
药材的真假和好坏，随着分子生物学的快速发展，人们
又从分子水平上来鉴别药材的真假，其中 ＲAPD 技术
(random amplified polymorphic DNA)［1 － 3］是 20 世纪 90
年代发展起来的分子标记技术，ＲAPD 技术有许多优
点，能准确的证明供试材料间 DNA 的特征性和差异
性，具有操作简便、灵敏性高、省时省力、不易受环境因
素的影响等优点，目前该技术被广泛应用到中药材中，
也为中药现代化的快速发展提供理论依据和现实
意义。
1 材料与方法
1． 1 实验材料
供试材料为菘蓝(Isatis tinctoria L)和马蓝(Strobi-
lanthes cusia(Nees)Ktze．) ，经黑龙江中医药大学王振
月教授鉴定，材料用硅胶干燥室温保存。详见表 1。
表 1 供试材料
药品名及编号 产地 来源 拉丁学名
1 菘蓝 黑龙江省哈尔滨 栽培品种 Isatis tinctoria L
2 马蓝 广西壮族自治区 栽培品种Strobilanthes cusia(Nees)Ktze．
1． 2 方法
1． 2． 1 CTAB法［4 － 6］提取基因组 DNA操作步骤
详见康为世纪公司产品说明书。
1． 2． 2 DNA的浓度及纯度检测(UV － 1700 紫外可见
光分光光度仪)
取待测样品 300μL，用蒸馏水稀释 10 倍，加入到
石英比色皿中，放入待测室的池架上，测定 260nm、
280nm 波长时的 OD 值，并计算出 DNA 的浓度及
OD260 /OD280 的比值。
1． 2． 3 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA完整性
0． 8%琼脂糖凝胶:取 0． 8g琼脂糖溶于 100mL1 ×
TAE缓冲液，加热至完全溶解，等待琼脂糖凝胶液冷
却至 50 ～ 60℃，缓慢倒入电泳槽，防止出现气泡，等胶
液完全凝固后轻轻的拔下梳子，将其放入电泳槽中，向
电泳槽中加入 1 × TAE刚好高于胶面 1 ～ 2mm，插上电
源，打开电泳仪，开机预热 10min，让缓冲液充分混合。
琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液:取 DNA5μL 和
1μLGel － Dye Super Buffer Mix 混合，混合均匀后直接
上样电泳，直接取 1kb DNA marker 5μL 上样电泳，估
计片段大小，将电压调到 80 ～ 100V，电泳 40 ～ 50min，
当 Gel － Dye Super Buffer 移到距凝胶前沿约 2cm 处，
停止电泳。观察拍照，检测 DNA的完整性。
1． 2． 4 随机扩增引物的筛选
从 30 个 ＲAPD随机引物中进行筛选，先用样品比
较多的菘蓝进行筛选，选取电泳条带清新、稳定的随机
引物，用于 PCＲ扩增和遗传差异的分析。
1． 2． 5 ＲAPD随机扩增反应
PCＲ循环
94℃ 2 ～5min
72℃ 10min
94℃ 30s
37℃ 30s}72℃ 80s 41cycles
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中 医 药 学 报
Acta Chinese Medicine and Pharmacology
2013 年第 41 卷第 6 期
Vol. 41，No. 6，2013
表 2 ＲAPD反应体系
成分 25μL反应体系 50μL反应体系
ＲAPD引物 1μL 2μL
DNTPs 0． 5μL 1μL
Taq酶 0． 5μL 1μL
10 × PCＲ buffer 2． 5μL 5μL
模板 1μL 2μL
ddH2O 19． 5μL 39μL
1． 2． 6 琼脂糖凝胶电泳检测
扩增产物进行电泳检测，于 1． 5%琼脂糖凝胶电
泳检测，在紫外灯下观察结果。
2 结果与分析
2． 1 基因组 DNA提取的纯度和浓度
试剂盒法提取菘蓝和马蓝基因组 DNA，用 UV －
1700 紫外分光光度仪检测其纯度和浓度，理想的 DNA
的 OD260 /OD280 比值在 1． 8 ～ 2． 0 之间，可以满足
ＲAPD分析的要求。
表 3 试剂盒法提取基因组 DNA浓度和纯度
样本 OD260 OD280 OD260 /OD280 Conc(μg /mL)
菘蓝 0． 310 0． 170 1． 824 151． 750
马蓝 0． 297 0． 164 1． 812 145． 250
2． 2 DNA的完整性
提取的 DNA条带较清晰，没有拖尾现象，没有降
解，质量很高，DL 1 500 DNA Marker (参照片段:15
000bp，10 000bp，7 500bp，5 000bp，2 500bp，1 000bp，
250bp)。根据标准 DNA marker，知道板蓝根 DNA 片
段大约为 15 000bp。见图 1。
注:M为标准 DNA marker ，菘蓝:
1 － 4，马蓝:5 － 8，空白对照:9。
图 1 菘蓝和马蓝基因组 DNA琼脂糖电泳
2． 3 菘蓝和马蓝基因组 DNA指纹图谱
采用 1． 4%琼脂糖凝胶电泳，DL 2 000 DNA Mark-
er购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(参照片
段:2 000bp，10 000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
结果如图 2 ～ 3。
3 讨论
采用 ＲAPD技术对菘蓝和马蓝药用植物进行分子
水平上的鉴定，获得清晰可靠的 DNA指纹图谱。指纹
注:M为标准 DNA marker，1． gcctgccgtg，2． catccccgtg，
3． tgatgctctc，4． agtcctcaac，5． aggtttccgt，
6． acccgcgaac，7． cacttcgcgt，8．空白对照
图 2 菘蓝基因组 DNA指纹图谱
注:M为标准 DNA marker，1． gcctgccgtg，2． gtcctgatgc，
3． atcagtggtg，4． acctggaatc，5． aggtttccgt，6． acccgcgaac，
7． ccgattccgt，8． catcctctcg，9．空白对照
图 3 马蓝基因组 DNA指纹图谱
图谱显示菘蓝和马蓝之间有共同的位点，又有特征性
位点，指纹图谱可以用于鉴别中药材菘蓝和马蓝的真
假和质量的好坏。
ＲAPD技术［7 － 8］对品种鉴定，尤其是目前鉴于中
药材品种真假，品种质量的优劣等前景非常的广泛，在
本次研究基础上，为中药现代化快速发展提供理论依
据和现实意义。
样品采自黑龙江哈尔滨和广西壮族自治区两个不
同地区，由于地域不同，生长的环境不同，土壤的酸碱
度不同等受外界条件的影响，因此菘蓝和马蓝具有一
定差异性，本实验为以后能种植和土壤酸碱度相适应
的作物和植物提供理论依据。
参考文献:
［1］ 马小军，汪小全，孙三省，等．野生人参 ＲAPD 指纹的研究［J］．药
学学报，1999，34(4) :312 － 316．
［2］ 黄芸，秦民坚，杨光，等． ＲAPD 法鉴定射干类中药［J］． 中草药，
2000，33(10) :935 － 937．
［3］ 张进忠，王永芬，王建波．地黄品种遗传多样性 ＲAPD分析［J］．河
南农业科学，2000(12) :97 － 100．
［4］ 陈德富．现代分子生物学实验原理与技术［M］． 北京:科学出版
社，2006:101 － 103．
［5］ Golenberg EM，Giannassi DE，Giannassi，et al． Chcoroplast DNA se-
quence from a Miocene Magolia species［J］． Nature，1990，344(3) :
656 － 658．
［6］ 童大跃，伍新尧，陆惠玲，等． DNA提取方法的比较及改良［J］．中
山大学学报(医学科学版) ，2003，24(4) :411 － 412．
［7］ Williams J GK，Kubelik AＲ，Livak KL，et al． DNA polymorphisms am-
plified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］． Nucleic
Acid Ｒesearch，1990，18(22) :6531 － 6535．
［8］ Zhou YH，Yang JL，Zheng YL，et al． ＲAPD study on inter － species
relationships in Ｒoegneria［J］． Acta BotSin，1999，41:1076 － 1081．
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2013 年第 41 卷第 6 期
Vol. 41，No. 6，2013
中 医 药 学 报
Acta Chinese Medicine and Pharmacology