全 文 ：两种早熟禾超氧物歧化酶活性测定的适宜条件
魏臻武 , 王得贤 , 刘瑞俊 , 张春梅
(青海大学农牧学院 , 青海 西宁　810003)
　　摘要:以冷地早熟禾(Poa crymophi la)和草地早熟禾(P .pratensis)为材料 ,探讨光照反应时间 、酶
浓度以及酶反应体系等对 NBT 光化还原反应的影响 。随着光照反应时间的延长 ,最大光还原值直线上
升。25 min后光化还原值逐渐趋于稳定。光照反应开始后 ,酶液对 NBT 光化还原反应速率的抑制百分
率迅速升高 ,在 15 ～ 25 min时 ,酶液对 NBT 光化还原反应的抑制百分率保持稳定 , 25 min后下降速率
较大 。光照反应时间对 SOD酶活性测定的影响较大 ,确定为 25 min较为适宜 。酶浓度在 40 ～ 60 mg/
mL 时光化还原值变化速率较一致。测定中反应体系 NBT 、核黄素的加样量以及光照强度在一定范围
内时光化还原值较为稳定 。
　　关键词:早熟禾;超氧物歧化酶;NBT 光化还原反应;光照反应时间;酶浓度
　　中图分类号:S 543.01　　　文献标识码:A 　　　文章编号:1003-1863(2000)03-0015-04
　　常用的酶测定方法中 ,一般以一定时间内产物生
成量或底物消耗量作为酶活力单位 。超氧物歧化酶
(SOD)的作用底物 O-2 具有不成对电子 ,氧化能力强 ,
化学性质极不稳定 ,而且不易制备 ,因此 SOD活性测
定一般采用间接方法 。氮蓝四唑(NBT)光化还原法是
测定超氧物歧化酶活性的常用方法 。王爱国等[ 1]用
NBT 光化还原法研究了大豆种子 SOD的活性特征 。
刘鸿先 、林植芳等[ 2 , 3]分别按Giannophlisis等[ 4]并参照
王爱国的方法修正后测定了水稻叶片 SOD 的活性 。
邵从本 、沈文飚等[ 5 , 6]分别对 NBT 光化还原等方法测
定SOD 活性的反应机理和适宜条件进行了论述和
探讨 。
　　NBT 在甲硫氨酸和核黄素存在的条件下 ,光照后
能发生光化还原而生成蓝甲　。蓝甲　在 560 nm 波
长处有最大光吸收 。SOD能抑制 NBT 的光化还原 ,
抑制强度与酶活性在一定范围内成正比[ 1 , 4 , 7 ,8] 。对于
影响 NBT 光化还原反应的因素已有许多试验研究 。
Beauchamp 等[ 7] , Giannopolitis等[ 4] ,邵从本等[ 5]对温
度 、过氧 化 物 酶 、 NBT 浓 度 、光 照 反 应 时 间 、
收稿日期:1999-11-18;修回日期:2000-03-13
基金项目:青海省自然科学基金资助项目(项目号:9702)
作者简介:魏臻武(1966 ～), 男 ,甘肃省靖远县人 , 副教授 ,
硕士 , 主要从事牧草栽培生理 、饲草料储藏加工
等方面的科研教学工作。
酶液浓度等因素对 NBT 光化还原反应的影响进行了
试验研究 。通常条件下光照反应时间和粗酶液浓度是
影响 NBT 光化还原反应的主要因素 。本试验以冷地
早熟禾(Poa cryimophila)和草地早熟禾(P .pratensis)
为材料 ,研究光照反应时间 ,粗酶液浓度以及酶反应体
系等对 NBT 光化还原的影响 ,对 NBT 光化还原法测
定高寒地区牧草 SOD活性的适宜条件进行探讨 ,为研
究 SOD在牧草逆境生理中的作用提供实验依据 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
试验材料取自青海大学农牧学院草原系牧草试验
地 ,试验地海拔 2285.2 m ,年平均气温 5.6 ℃,最热月
(7月)平均温度 17.2 ℃, 最冷月(1 月)平均温度为
-15.7 ℃。土壤类型为灌溉灰钙土 。试验材料冷地
早熟禾于 1997年 6月15日播种 ,6月23日出苗 ,1998
年 4月 6日返青。草地早熟禾 1996年 6月播种 。取
样日期为 1998年 5月 23日 。
1.2　试验方法
1.2.1　粗酶液的制备　选取大小颜色均匀一致的牧
草叶片 ,剪成 1 cm 叶段 ,取样称量后加入磷酸盐缓冲
液(PBS 50 mmol/L pH 7.8)匀浆后 , 13000 r/min离心
25 min ,上清液即为粗酶液 ,冰箱保存待用。粗酶液浓
度分别为 20 、40 、60 、80 、100 、200 、300 mg/L。
15草原与草坪　　季刊　　2000年　　第 3期　　总第 90期
DOI :10.13817/j.cnki .cyycp.2000.03.004
1.2.2　NBT 光化还原反应体系　取质量和口径相同
的光照比色管作为光化还原管 ,标准反应体系为:
加样次序 体积(mL) 浓度
(1)磷酸盐缓冲液
　　(pH 7.8) 2.1 50 mmol/ L
(2)核黄素 0.4 60μmol/ L
(3)甲硫氨酸 0.1 39μmol/ L
(4)EDTA 0.1 3 μmol/ L
(5)粗酶液 0.1
(6)NBT 0.2 1.125 μmol/ L
反应液总体积为 3 mL
1.2.3　光照反应和比色　在不同光照强度下进行光
化还原反应 ,黑布遮光中止反应 ,使用 721型分光光度
计在波长 560 nm 下测定光密度 ,比色时以不照光的相
应比色管为空白管 ,以不加酶液(用 PBS 代替)作为最
大光还原管。光照反应时间每隔 5 min 测定一次酶活
性 ,50 min后测定最后一次 。光照强度设置为 2000 、
3000 、4000 、5000 、6000 lux 5个处理 。
2　结果和讨论
2.1　光照时间对 NBT光化还原反应的影响
　　在最大光还原管的光化还原反应体系中加入
NBT ,光强 4000 lux 条件下 ,立即照光开始反应。每隔
5 min测定光密度值。在不同光照反应时间最大光还
原值的变化如图 1 。在反应开始 0 ～ 25 min 内光化还
原值直线上升 , 25 min后光化还原值逐渐趋于稳定 。
沈文飚等[ 6] 研究显示光化还原产物的形成在 15 min
内呈非常好的线性关系 , 35 min后趋于稳定 。
图 1　不同光照时间下最大光还原值的变化
　　酶液对 NBT 光化还原反应有明显的抑制作用 。
图2为 40 mg/mL 浓度的酶液对 NBT 光化还原抑制
百分率的变化情况。在光照反应 10 min后 ,抑制百分
率迅速升高。15 ～ 25 min时抑制百分率保持稳定。在
光照反应 25 min后 ,抑制百分率下降速率较大。由此
可以看出 ,在 SOD 活性测定时光照反应时间对 SOD
活性测定值的影响较大 ,测定过程中应准确掌握反应
时间 。在图 1中 ,25 min后 NBT 最大光还原值趋于稳
定。在图 2中 , 25 min时酶液的抑制百分率相对稳定
并且在 50%。因此 ,光照反应时间确定为 25 min较为
适宜 。
图 2　酶液对 NBT光化还原反应的影响
2.2　酶液浓度对 NBT 光化还原反应的影响
　　用不同浓度的酶液抑制 NBT 光化还原反应 ,结果
如图 3。随着酶液浓度的增大 ,SOD 对光化还原反应
的抑制百分率也增大 。酶液浓度在 10 ～ 100 mg/mL
之间增加 ,NBT 光化还原速率直线上升 ,粗酶液浓度
在 100 mg/mL 以上时抑制百分率趋于稳定。图 4为
不同酶液浓度的光化还原反应体系在 50 min 光照时
间内的光化还原值曲线。从图中可以看出 ,在酶液浓
度为 20 mg/mL 的反应体系中光化还原值增大速率最
快 ,而 80 mg/mL 的反应体系光化还原值增大速率最
慢 , 40 mg/mL 和60 mg/mL 酶液浓度的反应体系光化
还原值变化速率较一致 ,而且在 25 min时两者的光化
还原值差异较小。结合图 3 、图 4 ,可以确定酶液浓度
在 40 ～ 60 mg/mL 左右较为适宜。从图 4中还可以看
出 ,在 25 min 左右各条曲线均有转折的趋势 ,这证明
确定 25 min为适宜光照时间是比较准确的。
16 Grassland and Turf 　　(Quarterly)　　2000　　No.3　　(Sum　No.90)
图 3　不同浓度酶液对 NBT光化还原反应的影响
图 4　不同浓度酶液对 NBT光化还原反应的影响
2.3　反应体系对光化还原反应的影响
2.3.1核黄素对光化还原反应的影响　在标准反应体
系中改变核黄素的加样量 ,最大光化还原值的变化如
图 5。核黄素加样量为 0.05 mL 和 0.1 mL 时最大光
化还原值较小且变化较快 ,当核黄素加样量为 0.2
mL 、0.3 mL 时最大光化还原值较为稳定 ,如果加样体
积继续增大则光化还原值变化较大 。
2.3.2　NBT 对光化还原反应的影响　在标准反应体
系中改变 NBT 的加样体积则光化还原值变化相对较
小(如图 6),说明 NBT 浓度对光化还原反应的影响相
对较小 ,邵从本等[ 5]研究指出随着 NBT 浓度的升高 ,
反应速度有提高的趋势 , NBT 浓度在30μmol以下时 ,
光化还原反应速率缓慢 , NBT 浓度在50 ～ 100μmol时
光化还原速率变化不大。同时这与反应温度有关 。
2.4　不同光照强度对 NBT光化还原反应的影响
　　本试验将光照强度由弱到强设置为 5个处理 ,测
图 5　核黄素对 NBT光化还原反应的影响
图 6　NBT对光化还原反应的影响
定光照时间为 25 min时不同光照强度下 NBT 光化还
原反应速率的变化 , 结果如图 7 , 当光照强度在
3000 ～ 5000 lux 范围内时 , NBT 光化还原反应速率较
小。当光照强度达到 6000 lux 时 ,光化还原反应速率
才有显著增加 。
图 7　不同光照强度对 NBT光化还原反应的影响
17草原与草坪　　季刊　　2000年　　第 3期　　总第 90期
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The Suitable Conditions for Assaying SOD Activity by
Nitrogen Blue Tetrazolium Photoreduction Method
on Alopine Forage
WEI Zhen-wu , WANG De-xian , LIU Rui-jun , ZHANG Chun-mei
(Faculty of Agricul ture and Animal Sciences , Qinghai University , X ining , 　810003)
　　Abstract:Leaves of poa crymophila and poa Pratensis were analy zed for their superoxidedismutase content by
using a photochemical assay system consisting of nit roblue tetrazolium.The ef fects of illumination reaction time ,
crude SOD extract and enzyme reaction system on the nit ro-blue tet razolium photo reduction were investigated.The
results show the photoreduction value linearly goes up w ith illumination reaction time , and the maximum can be
reached in 25 min.After 25 min i t keeps stable.The percentage that the crude SOD extract inhibit the reduction of
NBT increases rapidly at the beginning of the illumination reaction , betw een 15 and 25 min after reaction it keeps sta-
ble , and af ter 25 min i t drops dramatically.Illuminat ion reaction time has significant effect on assay of SOD activity ,
25 min is relatively suitable time required.The percentage of inhibi tion keeps constant at the range of 40 mg/mL to
60 mg/mL of SOD ex tract.When the illumination intensity and concentrations of riboflavin and NBT are fixed w ithin
certain ranges , the pho toreduction w ill be constant basically.　　　
Key words:poa crymophila NBT photo reduction;illumination time;SOD ex tract;inhibition(%)
18 Grassland and Turf 　　(Quarterly)　　2000　　No.3　　(Sum　No.90)