全 文 ：西 北 师 范 大 学 学 报 (自然科学版) 第 46卷 2010 年第 4 期
Journal o f No r thw est No rmal Univer sity(Na tur al Science) Vo l.46 2010 No.4
收稿日期:2010-03-05;修改稿收到日期:2010-05-19
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30960029 , 30570110);西北师范大学科技创新工程资助项目(KJCXGC-03-49).
作者简介:孙坤(1965—), 男 , 甘肃民勤人 , 教授 , 博士 , 博士研究生导师.主要研究方向为系统与进化植物学.
E-mail:kunsun@nw nu.edu.cn
青藏高原东缘块茎堇菜克隆多样性
及其与生境特征的相关性分析
孙 坤 , 孙文斌 , 苏 雪 , 虎 瑞 , 巩明明
(西北师范大学 生命科学学院 , 甘肃 兰州 730070)
摘 要:采用 ISS R(inter-simple sequence repeat)分子标记技术 , 分析了青藏高原东缘甘南地区不同生境块茎堇菜
(Viola tuberi f era)4 个居群的克隆多样性.结果表明块茎堇菜具有很高的克隆多样性 , 平均克隆大小(NC)均值为
1.1029 , Simpson 指数(D)平均值为 0.9921 , 不同基因型比率(PD)平均值为 0.9081 , 块茎堇菜居群都为多克隆居群.
4 个居群内的基因型都为局限基因型 , 未发现广布基因型 , 居群间克隆多样性分化明显.克隆多样性各项指数与生境
特征没有明显的相关性.
关键词:块茎堇菜;克隆多样性;生境特征;相关性
中图分类号:Q 89 文献标识码:A 文章编号:1001-988Ⅹ(2010)04-0074-04
Clonal diversity of Viola tuberi f era and their co rrelation w ith
characteristics of habitats in eastern Qinghai-Tibetan plateau
SUN Kun , SUN Wen-bin , SU Xue , HU Rui , GONG Ming-ming
(Co llege o f Life Science , Nor thw est No rmal Univer sity , Lanzhou 730070 , Gansu , China)
Abstract:Clonal diver sity of four Viola tuberi fera populations in eastern Qinghai-Tibe tan plateau are
dete rmined by using ISSR(inter-simple sequence repeat)mark.The result show a relativ ely high clonal
diversi ty existed in four populations.Ave rages o f average size of g eno types (NC), propo rtion of
distinguishable variations(PD)and Simpsons index(D)are 1.1029 , 0.9921 and 0.9081 , respectively.
The result indicate that four populations of V.tuberi fera are mult i-clone s.T he genotypes w i thin four
populations are local , but no widespread geno types are found , indicating a signif icant clonal
dif ferentiation betw een four populations.The cor relat ion analy sis indicate no significant co rrelation
between index of clonal diversi ty and characteristics of habitats.
Key words:Viola tuberi f era;clonal div ersity ;characte ristics of habitats;correlation
许多植物 , 特别是生长在逆境中的植物 , 常具
有有性生殖和克隆繁殖两种繁殖方式.其中克隆繁
殖可在短期内占据不同生境 , 尤其具有适应不良环
境的优势[ 1 ] , 对极端环境下物种的繁衍具有重要
意义.因此 , 在高纬度 、 高海拔地区 , 克隆植物出
现频率都很高[ 2 ] .克隆多样性是居群进化过程中
适应环境的结果 , 生长在高海拔环境下的克隆植
物 , 其居群的形成 、维持和衰退机制都可以通过研
究居群的克隆多样性加以了解[ 3 ] .影响植物克隆
多样性的因素虽然很多 , 但在高海拔环境中 , 生活
史特征和生境因素是其中最主要的方面[ 4 ] , 尤其
是海拔的变化对植物居群克隆多样性的影响尤为重
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2010 年第 4 期 孙 坤等:青藏高原东缘块茎堇菜克隆多样性及其与生境特征的相关性分析
2010 No.4 Clonal diversity of Viola tuberi fera and their correlation with characteristics of habitats in Qinghai-Tibetan Plateau
要.研究表明 , 随着海拔的升高 , 高山克隆植物克
隆繁殖会增加 , 克隆多样性水平下降[ 5 ] , 亦有研
究表明海拔与克隆多样性呈负相关性[ 6 ] 或没有明
显的相关性[ 7-8] .可见 , 环境胁迫强度与克隆多样
性之间的关系尚不明确.
块茎堇菜(Viola tuberi f era Franch)为青藏高
原特有种 , 产于海拔 2 500 m 以上的高寒草甸[ 9 ] .
块茎堇菜是堇菜属植物中繁殖方式最为特殊的种
类 , 除通过完全开放花(chasmogamous f low ers ,
CH)异交 或 自 交 繁 殖 和通 过 地 上 闭 锁 花
(cleistog amous f lowe rs , CL)严格的自交繁殖外 ,
还可以通过在地下匍匐茎上产生大量的闭锁花进行
自交繁殖.此外 , 块茎堇菜也可通过地下匍匐茎和
肉质鳞茎以出芽的方式克隆产生新的个体[ 10] .这
种混合繁育系统是其适应高海拔环境的对策[ 10] .
克隆繁殖在该物种的繁殖中的贡献如何以及是否是
其适应高海拔环境的主要对策 ?海拔等环境因子对
块茎堇菜的克隆多样性有何影响? 对上述问题目前
还缺乏了解.本文利用 ISS R技术研究了青藏高原
东缘 4个块茎堇菜居群的克隆多样性以及其与不同
生境特征的相关性 , 为揭示克隆植物的繁殖策略 、
克隆多样性与生境特征的关系提供依据.
1 材料与方法
1.1 取样方法
实验材料采集于青藏高原东缘甘南藏族自治
州 , 选取 4个代表其典型生境的样地 , 每个样地随
机选取 10个 1 m ×1 m 样方 , 测定其盖度 、 草场
质量指数 、海拔等生境特征.块茎堇菜为多年生小
草本 , 其开放花和地上闭锁花种子散布距离约为
2.5 m , 地下闭锁花种子和鳞茎散布距离为 3 ～
30 cm[ 10] .从 4个样地中分别随机选取 1个样方 ,
将样方内所有个体逐个取样 , 共 125株个体 , 个体
间平均距离 10 cm.每株采集成熟植株幼嫩 、 无虫
叶片 , 放入装有变色硅胶的密封袋中干燥保存.各
居群的基本信息和生境特征如表 1.
1.2 ISSR反应
1.2.1 总DNA提取 采用 CTAB 法[ 12] 提取基因
组总 DNA , 方法略有改进.提高温育后将离心速
度由 100 g 提高到 10 000 g , 第二次抽提时加入抽
提液的量由原来的 800 μL 变为 900 μL , 并且
10 000 g离心.加入异丙醇后 , 放到常温下沉淀
30 min.提取完成后用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳 ,
EB染色 , 用 UVI 凝胶图像分析系统拍照记录结
果.最后将样品稀释到 5 ～ 10 ng·μL-1备用.
表 1 块茎堇菜 4个居群基本信息和生境特征 a
Tab 1 Gene ral info rmation and cha racteristics o f habita ts
of the four studied populations o f Viola tuberi f era
居群
popul-
ation
地点
local-
i ties
个数
No.of
sam-
ples
生境
habitat
海拔
alti-
tude
/m
光照强度
light
intensity
/ lx
盖度
cov-
erage
/ %
草场质
量指数
IGQ
Lb 合作 40 杨树疏林下草甸 2900 2775 68.75 0.66
Tb 合作 21 退化矮嵩草草甸 2900 49475 22 0.34
Lca 碌曲 19 退化矮嵩草草甸 3250 54710 20 0.31
Mcb 玛曲 45 退化矮嵩草草甸 3500 59835 14 0.20
注:草场质量指数(I ndex of g ra ssland quality)[ 11] IGQ
= ∑3
1
(i×S).
1.2.2 ISS R引物筛选 从 100条加拿大哥伦比
亚大学(UBC)公布的第 9套 ISSR引物中筛选出 23
条有扩增条带的引物 , 再从中选择条带清晰 、 多态
性高 、 重复性好的 9条引物(表 2), 用于块茎堇菜
4个居群所有个体的 PCR扩增(引物由上海生工生
物工程技术服务有限公司合成).
表 2 ISSR引物序列
Tab 2 The sequence o f primer s
引物
prime r
序列(5～ 3)
sequence(5～ 3) 引物primer 序列(5～ 3)sequence(5～ 3)
UBC855 (AC)6CT UBC807 (AG)8T
UBC855 (AC)6YT UBC810 (GA)8T
UBC835 (AG)8YC UBC840 (GA)8YT
UBC825 (AG)8T UBC857 (AC)8 YG
UBC857 (AC)8 TG
1.2.3 PCR扩增 扩增反应在 Biometra T-Gradient
Thermoblock PCR 仪上进行 , PCR 扩增反应体积
10μL , 其中 3 mmol·L-1 Mg2+ ,0.2 mmol·L-1 dNTP ,
10×PCR buf fer , 0.4 μmol·L-1 Primer , 0.5U Taq
DNA 聚合酶 , 50 ng DNA模板.扩增程序为:94 ℃
预变性 1.5 min , 94 ℃变性45 s , 45 ℃或 46 ℃退火
45 s , 72 ℃延伸 1.5 min , 45个循环 , 循环结束后
94 ℃变性 45 s , 45 ℃或 46 ℃退火 45 s , 76 ℃延伸
5 min , 4 ℃保存.扩增产物用 1.5%的琼脂糖凝胶
电泳检测 , EB染色 , 以 100 bp 的 DNA ladder 作
为分子量标记(分子量范围为 100 ～ 1 500 bp), 用
UVI凝胶图像分析系统拍照记录结果(图 1).
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西 北 师 范 大 学 学 报 (自然科学版) 第 46 卷
Journal of Nor thw est Normal Unive rsity (Natural Science) Vo l.46
图 1 引物 UBC855扩增的 Tb 居群的 DNA 片段
Fig 1 The PCR amplification pattern of Tb population
generated with primer UBC855
1.3 数据处理与分析
1.3.1 数据处理 电泳迁移率一致的条带被认
为具有同源性 , 属于同一位点的产物按扩增阳性
(1)和扩增阴性(0)记录电泳条带 , 形成 ISSR表型
数据矩阵用于克隆多样性分析.
1.3.2 克隆多样性分析 克隆多样性分析采用
以下指数:① 每个居群的实际基株数目(G);
②平均克隆大小 NC=N/G , N 为样品个体数;
③不同基因型比率以 PD =G/ N 估算;④Simpson
指数D =1 -∑{(ni(ni -1)/(N(N -1))}, 其中
ni 为具有第 i 个基因型的分株数 , N 是样品个数;
⑤局限基因型(仅分布于一个居群)和广布基因
型[ 13](分布于 75%以上的居群).
1.3.3 相关性分析 采用 SPSS 13.0软件 , 对取
样地点的生境特征与克隆多样性的相关性进行分析.
2 结果与分析
2.1 克隆多样性
4个块茎堇菜居群的克隆多样性如表 3.4 个
居群共 125株个体 , 检测出 115株基株.所有居群
均为多克隆居群 , Mcb 居群基株数最多(G=43),
基株数最少的为 Lca居群(G=17), 每个居群平均
28.75株基株.平均克隆大小为 1.0465 ～ 1.1667;
Simpson指数和不同基因型比率分别为 0.9921 和
0.9081.由表 3 看出 , 4 个居群中 Mcb 居群的克
隆多样性最高 , Tb居群的克隆多样性最低;Lb 居
群与 Mcb居群的克隆多样性比较相近 , 而 Lca 居
群更接近于 Tb 居群的克隆多样性.4个居群均表
现出较高的克隆多样性.
另外根据 Ellst rand 和 Roose的局限基因型和
广布基因型的标准[ 13] , 块茎堇菜 4个居群中 100%
的基因型为局限基因型 , 没有广布基因型 , 居群间
基因型的地域差异性强.
表 3 块茎堇菜克隆多样性
Tab 3 Clonal diver sity in all popula tions
居群
population
分株数
No.of
ramets
基株数
No.of
gemets
NC D PD
克隆分化
clonal
differentiation
Lb 40 37 1.0810 0.9962 0.9250 局限基因型
Tb 21 18 1.1667 0.9857 0.8571 局限基因型
Lca 19 17 1.1176 0.9883 0.8947 局限基因型
Mcb 45 43 1.0465 0.9980 0.9555 局限基因型
平均值
Mean
31.25 28.75 1.1029 0.9921 0.9081
物种水平
species level
125 115 1.0869 0.9987 0.9200
2.2 克隆多样性与生境特征的相关性
克隆多样性与生境特征的相关性分析结果如表
4.由相关性分析看出 , 各项指数与海拔 、光照强
度等生境特征都存在一定的相关性 , 但相关性均不
显著.
表 4 块茎堇菜克隆多样性与生境特征相关性
Tab 4 Co rr elation of clonal diver sity with cha racteristics
of habitats in populations of Viola tuberi fera
环境特征
char acte ristics of habita ts
NC PD D
海拔
altitude(m) -0.636 0.644 0.431
光照强度
lig ht intensity(lx) 0.127 -0.111 -0.322
盖度
cover age
-0.155 0.137 0.340
草场质量指数
index o f g rassland quality
0.014 -0.033 0.171
3 讨论
克隆植物的克隆多样性受繁殖方式 , 特别是有
性生殖格局的影响[ 4 ] , 有性繁殖更新使居群在初
始种苗补充 (Ini tial seedling recruitment , IS R)
之后有 能 力进 行 重复 种 苗 补充.对 Rubus
sa xat i li s
[ 14] 和Fri ti l laria camtschatcensis[ 15] 的研究
发现少量的重复种苗补充就可维持居群内较高的克
隆多样性.Li等对 Mikania micranth 和寄生其上
的Cuscuta campestris的克隆多样性的比较研究发
现 , 两者之间的差异与不同的繁殖方式所占的比例
有关[ 16] .各繁殖方式所占的比例不同 , 对居群克
隆多样性的影响也不同.块茎堇菜具有多种繁殖方
式 , 以往研究证明 , 通过地上地下闭锁花有性繁
殖 , 块茎堇菜能保证种子的产生[ 10] , 本研究表明 ,
块茎堇菜具有很高的克隆多样性 , 克隆繁殖对居群
76
2010 年第 4 期 孙 坤等:青藏高原东缘块茎堇菜克隆多样性及其与生境特征的相关性分析
2010 No.4 Clonal diversity of Viola tuberi fera and their correlation with characteristics of habitats in Qinghai-Tibetan Plateau
的贡献不明显 , 有性繁殖特别是闭锁花繁殖很可能
是其适应高海拔生境的主要生殖策略.前人对青藏
高原 分 布的 其 它兼 性 克隆 植 物 , 如 Carex
moorcro f t ii [ 17](PD =0.38 , D =0.654), Potenti l la
anserine
[ 7 ](PD=0.567 , D=0.875)和 Polygonum
viviparum[ 8 ](PD =0.307 , D =0.639)的研究发
现 , 它们都具有较高的克隆多样性.这说明复杂的
繁殖方式是青藏高原植物适应高海拔生境的重要生
殖策略.
环境的异质性虽然是影响植物克隆多样性的重
要因素 , 但环境因子对不同植物的克隆繁殖的影响
可能不同[ 4 ] , 如 Younga 对 Rutidosis leiolepis 的
克隆多样性与海拔的关系研究表明 , 该物种的克隆
多样性与海拔呈正相关关系[ 5 ] ;而 Stensto rm 对
Carex属的四种植物的研究结果却得到相反的结
论 , 即克隆多样性与海拔的相关性为负相关[ 6 ] ;
而陆建英等人对分布于青藏高原东缘的 Potenti l la
anserine 和 Polygonum v iv iparum 的研究结果显
示 , 克隆多样性与海拔变化没有明显的相关性[ 7-8] ,
可见 , 生境特征与植物克隆多样性的关系十分复
杂.本文对块茎堇菜的克隆多样性与海拔 、 植被盖
度 、 光照和草场质量等关系的研究发现其克隆多样
性与海拔等生境特征间没有明显的相关性 , 表明生
境特征变化对块茎堇菜克隆多样性的影响不明显.
这可能是因为发达的地下闭锁花大量结实 、 地下匍
匐茎扩散种子是块茎堇菜适应青藏高原严酷环境的
主要对策[ 10] .生境的差异并没有改变生境的可利
用性[ 4 ] , 也没有或不足以限制块茎堇菜闭锁花尤
其是地下闭锁花的有性繁殖[ 10] .因此 , 稳定的有
性繁殖方式很可能是生活于高海拔严酷环境下的块
茎堇菜维持较高的克隆多样性水平以及克隆多样性
与生境特征相关性不显著的原因.
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(责任编辑 俞诗源)
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