全 文 ：自制冰冻切片包埋剂在紫花地丁种子 RNA提取中的应用
庄元春，朱 烨，何 颖，张 春* (泸州医学院药学院生药教研室，四川泸州 646000)
摘要 ［目的］通过比较使用自制包埋剂和合成胶水包埋紫花地丁种子提取 RNA的效果，证明提取紫花地丁种子 RNA时，使用自制包
埋剂能获得高质量的 RNA。［方法］用自制包埋剂和合成胶水分别包埋紫花地丁种子，冰冻切片机切片破碎种子，提取 RNA，通过 RNA
浓度、纯度及完整性的检测，比较 2种方法提取 RNA的效果。［结果］自制包埋剂组和合成胶水组提取的 RNA浓度分别为 3． 42和 1． 04
μg /μl; 1． 0%琼脂糖凝胶电泳显示 2组 RNA都可见 2条明显的条带，28S rRNA与 18S rRNA条带亮度之比大于 1，但合成胶水组有较为
明显的拖带。［结论］该试验结果显示，自制包埋剂包埋紫花地丁种子进行切片破碎，完全能满足提取 RNA的需要，是一种成本低、效果
好、操作简便、具有实用价值的方法。
关键词 包埋剂;冷冻切片; RNA提取;紫花地丁种子
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2013) 06 －02383 －02
Applying the Homemade Frozen Section Embedding Medium for Total RNA Extraction from the Seeds of Viola yedoensis
ZHUANG Yuan-chun et al ( Department of Pathogenic Biology，Luzhou Medical College，Luzhou，Sichuan 646000)
Abstract ［Objective］To extract the high-quality total RNA from the seeds of Viola yedoensis，the homemade embedding medium and syn-
thetic glue liquid embedding medium were compared． ［Method］The seeds of Viola yedoensis were broken by frozen section method embedded
by the homemade medium and the glue liquid． The concentration，purity and integrity of the total RNA were detected． ［Result］The RNA
concentrations extracted by the homemade medium and the glue liquid medium were 3． 42 and 1． 04 μg /μl respectively． Agarose gel electro-
phoresis could see two distinct bands apparently． The brightness ratio of the 28S rRNA and the 18S rRNA bands was greater than 1． The total
RNA extracted by the glue liquid medium method were smeared． ［Conclusion］The results showed that using the homemade frozen section em-
bedding medium to break the seeds of Viola yedoensis method can meet the needs of most molecular biological experiments． It is a low cost，ef-
fective and simple method for high-quality RNA extraction．
Key words Embedding medium; Frozen section; RNA extracting; Seeds of Viola yedoensis
基金项目 国家自然科学基金( 81001700 ) ; 四川省教育厅科研课题
( 11ZB124) ;四川省卫生厅科研课题( 120385) 。
作者简介 庄元春( 1973 － ) ，女，四川泸州人，副教授，从事中药分子鉴
别研究。* 通讯作者，副教授，博士，从事分子生药学，药用
植物资源与利用等研究，E-mail: zc83good@ 126． com。
收稿日期 2013-01-28
紫花地丁(Viola yedoensis Makino)系堇菜科堇菜属多年
生宿根草本植物，为常用中草药。近年来对于紫花地丁提取
物的研究表明，其具有细胞毒活性和杀虫活性及抗 HIV的功
效，因而备受关注［1］。近年来，对于紫花地丁中一些功能基
因的研究，逐步成为热点。紫花地丁 RNA 的提取是进行其
分子克隆和基因表达分析等研究的基础，但 RNA 很容易被
内源和外源的 RNase降解，所以要得到未被降解、不含 DNA
和其他杂质的 RNA是进行分子生物学研究的前提［2 －4］。紫
花地丁的果期长，结实率高，在药材地上部分占有较大比例。
由于其种子非常细小，且含有坚硬的种皮，用传统的液氮碾
磨难以将组织破碎。笔者在前期试验工作中，用合成胶水将
组织样品粘附在冰冻切片机上，然后连续切片获得组织碎
片，用于提取 RNA，获得了很好的效果［5］。但紫花地丁的种
子为直径几百微米的颗粒，用合成胶水将其粘附在冰冻切片
机上时，大部分被包埋在了合成胶水里，当切片时，得到的组
织碎片中含大量胶水，导致最后提取到的 RNA质量不理想。
通过大量试验摸索，笔者以合成胶水为基础，配制出冰冻切
片时使用的紫花地丁种子包埋剂，用于紫花地丁种子 RNA
的提取，旨在为其分子生物学研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 仪器和试剂 Leica CM1900冰冻切片机(德国 Leica) ;
ND-1000微量紫外可见分光光度计(美国 NanoDrop) ;Power-
Pac Universal 电泳仪(美国 BIO-RAD) ;全自动凝胶成像系统
GelDocXR +(美国 BIO-RAD) ;Ep管及取液器枪头(美国 axy-
gen)。RNAprep pure Plant Kit 抽提试剂盒(北京天根) ;
DEPC(江苏碧云天) ;市售合成胶水。紫花地丁种子由泸州
医学院药用植物园提供。
1． 2 RNase的灭除 将研钵、烧杯、剪刀、镊子等所需器具，
置于 0． 1%DEPC H2O中浸泡 24 h，再经 121 ℃高压灭菌 30
min，70 ℃烘干备用。
1． 3 自制冰冻切片包埋剂 将合成胶水和 0． 4%DEPC H2O
按体积比 3∶ 1比例混合均匀，摇床过夜，再经 121 ℃高压灭菌
30 min备用。
1． 4 紫花地丁种子取材 操作人员戴上口罩和手套，选择
生长状态良好的紫花地丁植株，直接剥取种子置于经去
RNase处理的烧杯中。然后，用镊子仔细选取其中无病害、
颗粒饱满、圆润光泽的种子，置于做好标记的 1． 5 ml 冻存管
中，立即于液氮中速冻及保存。
1． 5 RNA提取 将液氮速冻保存的紫花地丁种子分成 2
组:自制包埋剂组和合成胶水组。2 组都各自提取 RNA，除
使用的包埋剂不一样外，其余处理完全相同。提取过程如
下:将冰冻切片机样品头平放在机箱内;从液氮中取出装有
紫花地丁种子的 1． 5 ml 冻存管，立即放入冰冻切片机箱体
中;将适量合成胶水 /自制包埋剂加入冻存管中，用枪头混合
均匀后，倒在冰冻切片机样品头上;稍等片刻，等自制包埋
剂 /合成胶水凝固后，以 4 μm的厚度连续切片，将切出来的
含自制包埋剂 /合成胶水的种子碎片快速转移进预先加了
HL裂解液的 1． 5 ml Ep管中，充分混匀;4 ℃、13 400 g离心 5
min，取上清，转入新的无 RNase Ep管中，按照 RNAprep pure
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(6):2383 － 2384 责任编辑 朱琼琼 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.06.130
Plant Kit试剂盒说明书方法提取 RNA。
1． 6 RNA浓度、纯度及完整性检测 取 1 μl提取的 RNA，
用微量紫外可见分光光度计测定其浓度、OD260 /OD280值;取 5
μl提取的 RNA用 1． 0%琼脂糖凝胶电泳检测后，置于全自
动凝胶成像系统下分析 RNA的完整性及纯度。
2 结果与分析
2． 1 RNA纯度及浓度的紫外扫描分析 利用紫外分光光
度法测得自制包埋剂组提取的 RNA 浓度为 3． 42 μg /μl，合
成胶水组提取的 RNA 浓度为 1． 04 μg /μl，紫外吸收
OD260 /OD280分别为 1． 95和 1． 68。
2． 2 RNA完整性检测 1． 0%琼脂糖凝胶电泳检测结果显
示，自制包埋剂组和合成胶水组提取的 RNA 均可见 2 条明
显的条带(图 1)。28S rRNA与 18S rRNA条带亮度之比大于
1。但合成胶水组电泳条带出现较为明显的拖带。
注:M． Marker;1．自制包埋剂组;2．合成胶水组。
图 1 RNA琼脂糖凝胶电泳结果
3 讨论
组织 RNA提取是研究基因的分子生物学试验经常要用
到的试验技术，所提取的 RNA质量好坏关系到试验的成败。
保证所提 RNA完整是试验成功的前提和关键。但当采集试
验样本时，细胞离开了活体或原来的生长环境后，内源
RNase即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度等
因素成正相关。要想获得高质量的 RNA，需在破碎组织时，
保持低温，快速将组织破碎，使组织细胞尽快与裂解液充分
接触，裂解液中的 RNase抑制剂发挥作用，从而保证 RNA的
完整性［6 －8］。冰冻切片机切片过程中，其机箱温度可设置成
－25 ～ －30 ℃的较低温度水平，短时间将样品组织置于其
中，RNase活性也能被充分抑制。冰冻切片机切片厚度可达
到几微米，大多数组织的细胞直径在 10 ～ 20 μm左右，因此，
如果用冰冻切片机对组织进行切片，基本上能将所有的细胞
充分切碎。而且，冰冻切片机切片迅速，如果操作人员动作
熟练，可在很短的时间内完成操作，将切出来的组织快速溶
解在裂解液中，再做后续提取 RNA的试验操作，能获得高质
量 RNA。
在利用冰冻切片机切片破碎紫花地丁种子时，合成胶水
组使用普通合成胶水包埋种子进行切片。在提取 RNA 前，
笔者将样品进行离心取上清去除了胶水，减少了其对 RNA
提取的影响。即便如此，试验结果显示，合成胶水组提取的
RNAOD260 /OD280为 1． 68，并且，1． 0%琼脂糖凝胶电泳结果显
示有较为明显的拖带，可知合成胶水包埋样品对提取 RNA
有较大的不良影响。而使用自制包埋剂提取的 RNA
OD260 /OD280为 1． 95，1． 0%琼脂糖凝胶电泳结果显示所提
RNA在 2 kb处的 28S和 0． 9 kb处的 18S条带清晰，且 28S∶
18S ＞1，无拖带现象，所提 RNA 质量很好，可满足绝大部分
后续试验要求。分析 2组差异原因，一是所用的自制包埋剂
由于是经过 DEPC处理过的，因此，外源性的 Rnase 被抑制;
二是自制包埋剂中由于加入了 DEPC 水，胶水的浓度较低，
对提取的 RNA影响较小。试验中，自制包埋剂组比合成胶
水组提取的 RNA浓度高一些，可能是由于切片过程中，无法
精确确定所切取的样品量，导致各组 RNA浓度不一致，与所
采用的方法关系不大。
因此，该试验结果显示，在紫花地丁种子 RNA 提取中，
采用自制包埋剂包埋种子进行切片破碎，完全能满足试验需
要，是一种成本低、效果好、操作简便、具有实用价值的方法。
参考文献
［1］WANG C K L，COLGRAVE M L，GUSTAFSON K R，et al． Anti-HIV Cy-
clotides from the Chinese Medicinal Herb Viola yedoensis［J］． J Nat Prod，
2008，71:47 －52．
［2］WANG G，WANG G，ZHANG X，et al． Isolation of high quality RNA from
cereal seeds containing high levels of starch［J］． Phytochem Anal，2012，23
(2):159 －163．
［3］王友华，卢孟柱，段留生．棉花幼苗根总 RNA提取的改进热酚法［J］．
西北植物学报，2005，25(4):723 －726．
［4］WANG Y，LI Z，LIU X X，et al． A comparative study on three methods for
the extraction of total RNA form Pinus bungeanu［J］． Agricultural Science
＆ Technology，2011，12(5):663 －665．
［5］罗波，郑小莉，冯燕，等．冰冻切片法破碎大鼠心肌组织提取 RNA的实
验研究［J］．泸州医学院学报，2012，35(3):258 －260．
［6］XU SH，QIAN L J，MOU H Z，et al． Difference of gene expression profiles
between esophageal carcinoma and its pericancerous epithelium by gene
chip［J］． World J Gastroenterol，2003，9(3):417 －422．
［7］WANG J，CHEN S． Screening and identification of gastric adenocarcinoma
metastasis-related genes using cDNA microarray coupled to FDD － PCR
［J］． J Cancer Res Clin Oncol，2002，128(10):547 －553．
［8］BARBARIC D，DALLA-POZZA L，BYME J A，et al． A reliable method for
total RNA extraction from frozen human hone marrow samples taken at di-
agnosis of acute leukaemia［J］． J Clin Pathol，2002，55:865 －867．
4832 安徽农业科学 2013 年