全 文 ：收稿日期:2009-12-17;　修订日期:2010-06-26
基金项目:江西省自然科学基金(No.2007GQY0114)
作者简介:李辉敏(1974-),女(汉族),江西九江人 ,现任九江学院基础医
学院副教授 ,硕士学位 ,主要从事药品质量控制工作.
复叶耳蕨提取物体外抗 HIV-1整合酶活性的研究
李辉敏 , 殷嫦嫦 , 吴家忠 , 张　磊
(九江学院 ·基础医学院 ,江西 九江　332000)
摘要:目的 对鳞毛蕨科复叶耳蕨属植物复叶耳蕨不同提取部位体外抗 HIV-1整合酶活性进行研究 。方法 在体外无
细胞系统内采用酶联免疫吸附测定 HIV-1整和酶的半数抑制浓度(IC50)。 结果 复叶耳蕨醋酸乙酯提取物 、正丁醇提
取物抑制 HIV-1整合酶的半数有效浓度 IC50分别为 44.30, 16.02μg/ml,水提取物抑制 HIV-1整合酶的半数有效浓度
IC50 >100μg/ml。结论 复叶耳蕨醋酸乙酯提取物与正丁醇提取物具有体外抑制 HIV-1整合酶活性。
关键词:复叶耳蕨提取物;　抗 HIV-I整合酶活性
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.048
中图分类号:R962　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2010)11-2827-01
InhibitoryEffectofDifferentExtractPartsfromArachniodesexilisonHIV-1INActivi-
ties
LIHui-min, YINChang-chang, WUJia-zhong, ZHANGLei
(BasicMedicalColege, JiujiangColege, JiangxiJiujiang332000, China)
Abstract:ObjectiveToevaluatetheanti-HIV-1INactivitiesofthediferentextractpartsfromArachniodesexilisChing.
MethodsHIV-1 INreversetranscriptase, proteaseandintegraseweredetectedbyenzyme– linkedinmunosorbentassay.Re-
sultsIntheexperimentofanti-HIVIN, theIC50 ofthen-butanolextractaceticetherextractwere44.30, 16.02μg/ml, respec-
tively.TheIC
50
oftheaqueousextractwashigherthan100 μg/ml.ConclusionThen-butanolextract, aceticetherextractfrom
ArachniodesexilisChinghavetheinhibitoryefectonHIV-1 INactivities.
Keywords:Arachniodesexilis;　Thediferentextractedparts;　Anti-HIV-1
　　复叶耳蕨 ArachniodesexilisChing为鳞毛蕨科复叶耳蕨属植
物 , 广泛分布于世界热带和亚热带湿润区域 , 以亚洲东部和东南
部种类最为丰富 , 我国主要分布于长江流域以南地区及山东 、河
南等省 , 具有清热利湿 、抗菌消炎 、镇静作用 , 民间用于治疗急性
黄疸性肝炎 、关节炎 、腰腿疼 、痢疾 、烫火伤等 [ 1] 。本课题组前期
的初步研究发现:复叶耳蕨乙醇提取物在体外具有一定的抗 HIV
-1活性。本研究进一步探索复叶耳蕨不同提取部位体外抗
HIV-1活性的作用。
1　材料与方法
1.1　样品制备 复叶耳蕨材料采自九江市星子县 , 由九江学院药
学系吴家忠副教授鉴定 , 采集后取样品根部洗净 , 切碎 , 80℃烘
干 , 粉碎 ,过 70目筛 ,以 80%乙醇提取 3次 , 合并滤液 ,经旋转蒸
发仪减压浓缩至稠膏状。采用液 -液分配法 ,将复叶耳蕨根部粗
提物用适量蒸馏水溶解 ,然后加石油醚萃取 3次 , 对水层依次用
氯仿 、醋酸乙酯 、正丁醇分别萃取 3次 , 将各步萃取组分浓缩 ,分
别得稠浸膏 , 经国家新药筛选中心送至中国医学科学院医药生物
技术研究所病毒药物实验室进行体外抗 HIV-1整合酶活性筛
选测试。
1.2　体外抗 HIV-1整合酶活性筛选测试 采用酶联免疫吸附
法测定:用合成的 30个寡核苷酸作供体底物 , 用合成的 20个寡
核苷酸作为靶底物 , 96孔板包被供体底物加入纯化的 HIV-1整
合酶 , 进行酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorb-
nentAssay), 检测靶 DNA链转移的产物 , 以生物素标记的碱性
磷酸酶系统显色 , 酶标仪测定 OD值。在该体系中加入样品可
用于筛选该酶的抑制剂。HIV-1 IN:由中国医学科学院医药生
物技术研究所病毒药物实验室提取并保存。阳性对照药:S-y,
上海有机所提供。供体底物和靶底物:上海生工合成。样品处
理:复叶耳蕨根部水提取部位样品临用前溶于水配成适当浓度 ,
再作 5倍稀释 , 4个稀释度;醋酸乙酯 、正丁醇提取部位分别溶于
DMSO配成适当浓度 ,再作 5倍稀释 , 4个稀释度。
2　结果
样品稀释后加入供体底物包被 96孔板中 , 并加入含有基因
工程靶酶 biotin-靶底物的反应 Bufer中 , 在最佳反应条件下孵
育 , 以生物素标记的碱性磷酸系统显色 , 测定 405nm吸收值 OD
值 , 计算出各样品对 HIV-1整合酶活性的抑制程度 , 得出各样
品的半数抑制浓度(IC50)。结果见表 1。
表 1　复叶耳蕨各部分提取物抗 HIV-1整合酶活性
μg· ml-1
样品 初始浓度 IC50
S-y 12 0.4
复叶耳蕨醋酸乙酯部位 100 44.30
复叶耳蕨正丁醇部位 100 16.02
复叶耳蕨水提取部位 100 -
　　“ -”表示样品在初始浓度抑制 HIV-1IN活性的百分率小于 50%
3　讨论
HIV-1是人类最为严重的致死性疾病 , 因此寻找有效的抗
HIV-1药物 , 彻底攻克恶疾 , 是世界医学界重要的研究课题。
近年来 ,合成类化学药在临床治疗方面取得了显著的进展。但由
于 HIV-1的高变异特性 , 接受药物治疗的大多数艾滋病患者对
至少一种药物产生耐药 ,因而研究开发更多结构新颖的抗艾滋病
药物仍具有重要的意义 [ 2]。由于化学合成药具有较强的毒副作
用使得其应用受到局限 ,从多种天然药物中提取高效 、无毒的抗
HIV-1药物为势之所趋。我国传统中药在治疗 HIV-1方面具
有作用机制独特 、毒副作用小等特点 ,备受患者青睐 [ 3] 。复叶耳
蕨是一种传统中药材 ,本课题组通过对其不同提取部位体外抑制
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.11 时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期
HIV-1 IN活性初筛试验 , 证明其正丁醇部位 、醋酸乙酯提取部
位具有体外抑制 HIV-1IN活性 ,其中正丁醇部位强于醋酸乙酯
提取部位。
蛋白酶(PR)、逆转录酶(RT)和整合酶(IN)是 HIV-1生
命周期中的 3个重要的酶 , 抑制这 3种酶的活性可抑制 HIV-1
的复制 , 目前抗 HIV-1四类药物 [ 4 , 5]中的三类是这些酶的抑制
剂 , 即逆转录酶抑制剂 、蛋白酶抑制剂及整合酶抑制剂 [ 6 , 7] , 我们
的研究证明复叶耳蕨提取物对整合酶有抑制作用 ,一定程度上表
明它是一种具有抑制 HIV-1病毒复制的中药 , 为证实该作用还
需进一步在细胞水平及整体水平进行抗 HIV-1作用的研究。
PR、RT和 IN都是由 HIV-1基因组中的 pol基因编码然后翻译
成 pol多聚蛋白 ,在病毒成熟过程中 , 蛋白酶将该多聚蛋白由 5′
端到 3′端依次特定水解形成这 3种酶 ,研究发现人类细胞中没有
HIV整合酶的类似物 [ 8];无疑 HIV-1整合酶是抗 HIV-1重
要 、独特的靶点 ,近年来随着 HIV-1整合酶立体结构被测定出
来 , 针对整合酶的抗病毒研究成为了治疗 AIDS的热点 , 复叶耳
蕨提取物体外具有抑制整合酶的活性 , 表明研究其抗 HIV-1的
作用对于开发抗 HIV-1的新药具有重要的意义。
参考文献:
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收稿日期:2010-01-26;　修订日期:2010-06-25
基金项目:吉林省中医药管理局科技项目(No.08sya-38)
作者简介:翁丽丽(1969-),女(汉族),吉林农安人 ,现任长春中医药大学
药学院副教授 ,硕士学位 ,主要从事药学研究工作.
大口静灰球体外抑菌实验研究
翁丽丽 ,王淑敏 ,朱　娜 ,宋启印
(长春中医药大学 ,吉林 长春　130117)
摘要:目的 观察大口静灰球不同溶剂浸提液体外抑菌效果。方法 以金黄色葡萄球菌 、大肠埃希氏菌 、绿脓假单胞菌 、枯
草芽孢杆菌为受试菌 , 采用对倍稀释法测定大口静灰球不同溶剂浸提液体外最低抑菌浓度(MIC), 并通过测定平板内抑
菌圈直径观察其体外抑菌效果。结果 实验表明 , 95%乙醇 、醋酸乙酯 、三氯甲烷浸提液对以上 4种细菌均有不同程度的
抑制作用。结论 大口静灰球具有一定的抑菌作用 , 可用于抗菌药物的研究开发。
关键词:大口静灰球;　体外抑菌
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.11.049
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)11-2828-02
　　马勃是一种常见的用于消肿 、解毒和止血功用的药用真菌 ,
近年来 , 马勃在抗菌和抗癌方面的作用 , 也受到广泛关注 [ 1] 。
《中国药典 》规定大马勃 Calvatiagigantea(BatschexPers.)
Lloyd.、紫色马勃 Calvatialilacina(Mont.etBerk.)Lloyd和脱皮
马勃 LasiosphaerafenzliiReich.[ 2]为中药马勃的来源。全国很多
地区也用大口静灰球 BovistelasinensisLloyd.子实体作马勃入
药。大口静灰球来源于马勃科 、静灰球菌属 , 分布地区主要是河
北 、河南 、山东 、吉林 、江苏等地 , 含有多种氨基酸 、无机盐 、麦角甾
醇 、类脂质及马勃素等成分。
1　材料与仪器
1.1　药材 实验用大口静灰球干燥子实体 BovistelasinensisLloyd
购于吉林省仙草药材公司。
1.2　供试细菌菌种 金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus,
ATCC25923;大肠埃希氏菌 Escherichiacoli, ATCC44186;绿脓假
单胞菌 Pseudomonasaeruginosa, ATCC10105;枯草芽孢杆菌 Bacil-
lussubtilis, History→ ISF→ AS1.21, 由长春中医药大学微生物
实验室提供。
1.3　药品和试剂 95%乙醇 、醋酸乙酯 、三氯甲烷 、牛肉膏 、蛋白
胨 、氯化钠 、氢氧化钠 、盐酸 、琼脂粉 、医用酒精等(皆为分析纯)。
1.4　仪器 YXQ-I, S.50SII立式高压蒸气灭菌器;METTLE
TOLEDO型电子天平;HG303.4K电热恒温培养箱;DHG.9070A
型电热恒温鼓风干燥箱 ;BCN.1360型生物洁净工作台 ;KQ-
250DB型数控超声波清洗器;PHB-4便携式酸度计。
2　方法
2.1　供试细菌培养
2.1.1　牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制备 液体培养基:牛肉膏 3.0
g,蛋白胨 10.0 g, NaCl5.0g, 蒸馏水 1 000 ml加热溶解 ,调节 pH
7.0 ～ 7.2。
固体培养基:牛肉膏 3.0 g,蛋白胨 10.0 g, NaCl5.0 g, 蒸馏
水 1 000 ml, 琼脂 20g,加热溶解 , 调节 pH7.0 ～ 7.2,于 121℃高
压蒸气灭菌 30 min后制备细菌平板培养基 [ 3, 4] 。
2.1.2　供试菌液的制备 将各菌种分别接种到已标好菌种名称 、
株号 、日期的斜面试管上 , 然后于 37℃恒温培养箱中培养 24 ～ 48
h。
挑选生长在琼脂上的纯菌落 ,直接用 0.9%生理盐水稀释比
浊到 3号麦氏比浊管 , 浓度(9×108 cfu/ml),再 1∶10稀释 ,制备
好的供试菌液备用。
2.2　4种溶剂浸提液抑菌原液的制备 将干燥的大口静灰球子
实体剪去根部 , 保留不孕基部 , 粉碎后分别称取 5 g分装于 250
ml的三角烧瓶中 ,分别用 100 ml的水 、95%乙醇 、醋酸乙酯 、三氯
甲烷浸渍 24 h, 超声(温度 40℃、频率 60Hz)30min后抽滤 , 重复
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.11