全 文 ：·88· Chinese Journal of Information on TCM Dec.2014 Vol.21 No.12
竹节参多糖的免疫佐剂活性研究
崔倩倩 1,孙志伟 2,张长城 1,王婷 1,周志勇 1,何毓敏 1,刘朝奇 3,袁丁 1
1.三峡大学医学院,湖北 宜昌 443002；2.湖北三峡职业技术学院,湖北 宜昌 443002；
3.三峡大学分子生物学研究所,湖北 宜昌 443002
摘要：目的 研究不同醇沉竹节参多糖的免疫佐剂活性,探讨其中佐剂活性最强的部分。方法 通过对竹
节参总多糖进行不同浓度醇沉,得到 30%醇沉物、60%醇沉多糖和 90%醇沉多糖,将各段多糖分别与卵白蛋白混合
注入小鼠体内进行免疫,每周免疫 1次,共 3次。最后 1次免疫后 5 d处死小鼠取血,测定抗体效价。对 3种醇
沉物质进行红外光谱扫描,初步确定多糖的类型。结果 各段多糖的抗体效价与对照组比较均显著增加,尤以
60%醇沉多糖最为明显。红外图谱分析表明,竹节参多糖的骨架中含有吡喃糖环结构。结论 竹节参多糖的免疫
佐剂效果显著,其中 60%醇沉多糖的佐剂效果最强。
关键词：竹节参总多糖；分段醇沉；免疫佐剂；红外图谱
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.12.026
中图分类号：R284.1；R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2014)12-0088-04
Study on Adjuvant Immunoactivity of Polysaccharides from Panax Japonicus CUI Qian-qian1,
SUN Zhi-wei2, ZHANG Chang-cheng1, WANG Ting1, ZHOU Zhi-yong1, HE Yu-min1, LIU Chao-qi3, YUAN Ding1
(1.Medical College of China Three Gorges University, Yichang 443002, China；2.Hubei Three Gorges Polytechnic,
Yichang 443002, China；3.Molecular Biology Research Institute of China Three Gorges University, Yichang 443002, China)
Abstract：Objective To study the adjuvant immunoactivity of polysaccharides from Panax
japonicus by alcohol of different concentrations；To discuss its part with the strongest adjuvant
immunoactivity. Methods Polysaccharides from Panax japonicus was sunk with alcohol of different
concentrations, and 30% alcohol compound, 60% and 90% alcohol polysaccharide were obtained.
Different segments of polysaccharide and OVA protein were injected to mice once a week for three
times for immunity. Five days after the last immunity, the mice were executed to collect blood, and
the antibody titer was determined. The three parts of alcohol compound were scanned by infrared
spectrum to determine the type of polysaccharide preliminarily. Results Compared with the control
group, the antibody titer of different segments of polysaccharide obviously increased, especially
the polysaccharide sunk by 60% alcohol. Infrared spectrum analysis showed that polysaccharides
from Panax japonicus contained pyranose ring structure. Conclusion Polysaccharides from Panax
japonicus has significant adjuvant immunoactivity, and polysaccharide sunk by 60% alcohol has
the strongest adjuvant effects.
Key words：polysaccharides from Panax japonicus；segmented alcohol sink；immune adjuvant；
infrared spectroscopy
竹节参系五加科植物竹节参 Panax japonicus C.
A. Meyer 的干燥根茎。竹节参多生长在海拔 1000 m
以上的阔叶疏林阴湿地或岩石、沟涧旁边,对土壤条
件要求较高,在云南、贵州、四川、湖北、陕西、甘
肃、河南、浙江、安徽、江西等省民间有较长的应

基金项目：国家自然科学基金(81100957、81273895、81373881)；
湖北省自然科学基金创新群体项目(2013CFA014)
通讯作者：袁丁,E-mail：yxyyd@ctgu.edu.cn
用历史。竹节参有散瘀止血、消肿止痛、祛痰止咳、
补虚强壮功效[1],是土家族著名民族药。随着现代药理
学研究的深入,竹节参的主要功效已逐步体现在某一
类成分甚至某种成分上。竹节参多糖是竹节参的主要
有效成分之一,能够明显增强机体的免疫调节功能[2]。
传统的疫苗一般多为全菌或全病毒制成,含有大
量非特异免疫原性物质,既有疫苗成分,也有佐剂作
用,一般不需加佐剂。而新型疫苗如基因工程疫苗、
核酸疫苗等具有良好的抗原特异性和低毒性,但免疫
2014 年 12 月第 21 卷第 12 期 中国中医药信息杂志 ·89·
原性较差,尤其需要佐剂来增强其免疫原性及宿主对
抗原的保护性应答[3]。中药活性成分多糖为天然物质,
不良反应小,来源广泛,开发新型中药佐剂是佐剂研
究发展的重要途径和新的趋势。本研究将竹节参总多
糖分成几个有效部位,利用黏度法确定各部分的黏均
分子量,通过对各部分进行红外光谱扫描确定官能团,
进而确定药物结构与性质,再研究各部分竹节参多糖
的免疫佐剂作用,为开发新型疫苗佐剂奠定基础。
1 仪器、试药与动物
Tecan200型全波长酶标仪,美国Thermo electron
公司；Suprafuge22 高速冷冻离心机,日本 Heraeus
公司；低速大容量离心机,北京京立离心机有限公司；
Nicolet Nexus670 红外光谱仪；电子分析天平,上海
天平仪器厂；旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂；真
空干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司；三用恒温水
箱,上海精宏试验设备有限公司；电热套,巩义市予华
仪器有限责任公司。
竹节参采自湖北省恩施州宣恩椿木营竹节参种
植基地,经三峡大学医学院中医系谭复成教授鉴定为
五加科植物竹节参 Panax japonicus C. A. Meyer 的
根茎。乙醇(分析纯),H2O2(分析纯),氨水(分析纯),浓
硫酸(分析纯),溴化钾(分析纯)；卵白蛋白(OVA),上
海江莱生物科技有限公司；牛血清白蛋白组分Ⅴ,武
汉科瑞生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)、磷
酸盐吐温缓冲液(PBST)、辣根过氧化物酶标记 IgG
(HRP-IgG),武汉科瑞生物技术有限公司；四甲基联苯
胺(TMB)显色液,上海紫一试剂厂。葡萄糖对照品,
SUPELCO 公司,批号 LB95752V。
BALB/c 小鼠,雌性,4～6 周,体质量 18～20 g,湖
北省疾病预防控制中心提供,动物许可证号 SCXK(鄂)
2011-0012。
2 方法
2.1 多糖的制备
将竹节参药材粉碎,用 10 倍量 80%乙醇浸泡 2 h,
回流提取4 h进行脱脂,弃掉提取液,将药渣继续用10
倍的蒸馏水回流提取 2 h,共 3 次,合并水提取液,减
压、浓缩提取液；将提取液转移到分液漏斗中,加入
0.5 倍 Sevage 试剂,震摇 20 min,静置 1 h,将下层分
出,上层倒出,上层液 5000 r/min 离心 10 min,取上清
液,重复操作 5 次。向所得上清液中加入氨水调至 pH
8.0 左右(7.0～9.0 均可),再向其中缓慢滴加 H2O2,并
不断搅拌,使H2O2终体积为总体积的2%,45 ℃保温4 h,
至多糖基本无色为止。向其中加入 95%乙醇使其终浓
度达到 30%,静置 6 h 后,3000 r/min 离心 10 min,得
乙醇终浓度为 30%的沉淀物。合并上清液,重复上述操
作,使乙醇终浓度分别为 60%、90%。真空干燥,即得
30%醇沉物及 60%、90%醇沉多糖,装入封口袋备用。
2.2 苯酚-浓硫酸法测定总糖含量
2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取 30%醇沉物及
60%、90%醇沉多糖各 0.1 g,用蒸馏水溶解并定容至
100 mL,再精密量取7 mL,用蒸馏水稀释定容至100 mL,
作为供试品溶液。
2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取葡萄糖对照品
60 mg,加水溶解并定容至 100 mL,制成 0.6 mg/mL 葡
萄糖对照品溶液。
2.2.3 测定法 精密量取葡萄糖对照品溶液 1、2、4、
6、10 mL 于 50 mL 容量瓶中,加水定容至刻度,摇匀。
精密量取上述葡萄糖对照品溶液各 2.0 mL,加入 6%苯
酚溶液 1 mL,95%硫酸溶液 5 mL,摇匀,于 40 ℃水浴
30 min,取出于冷水浴冷却至室温,测定吸光度。以浓
度为横坐标、吸光度为纵坐标做线性回归曲线。
2.3 红外光谱测定
分别取 30%醇沉物、60%醇沉多糖和 90%醇沉多糖
粉末各 2 mg,分别与溴化钾 150 mg 充分研磨后压片,
用红外光谱仪在 500～4000 cm-1 范围内进行扫描,分
别得到各段多糖的红外吸收光谱图。
2.4 免疫活性测定
2.4.1 分组与免疫 将 30 只小鼠随机分为对照
组(PBS)、抗原组(OVA)、30%醇沉物＋抗原组(30%PSPJ)、
60%醇沉多糖＋抗原组(60%PSPJ)、90%醇沉多糖＋抗
原组(90%PSPJ)。各段多糖物用蒸馏水配成相应浓度
后,用 0.22 μm 微孔滤膜过滤。各组小鼠分别给予相
应药物及抗原,第 1 日皮下注射,第 8、15 日分别腹腔
注射,体积均为200 μL,相当于抗原量每只0.15 mg/mL,
用药量每只 1.5 mg/mL。最后 1 次免疫后 5 d,处死小
鼠取血,测定抗体效价。
2.4.2 抗体滴度检测 用包被液稀释抗原至浓度为
2 μg/mL,每孔加 100 μL,4 ℃孵育 16 h；移去包被液,
用 PBST 洗 1 次,时间为 3 min；每孔加 1%BSA 200 μL,
37 ℃孵育 1 h；移去封闭液,用 PBST 洗 3 次,每次
3 min；用 1%BSA 稀释血清标本至所需浓度(1∶2000、
1∶20 000),每孔加 100 μL,37 ℃孵育 1 h；移去上
清液,用PBST洗 3次,每次3 min；用1%BSA按 1∶3000
稀释二抗,每孔加 100 μL,37 ℃孵育 1 h；移去上清
液,用 PBST 洗 5 次,每次 3 min；加入 A、B 显色液各
50 μL,室温避光反应 10～15 min；最后每孔加入 50 μL
终止液(2 mol/L H2SO4)终止反应；3 min 内于酶标仪
上检测 OD450值。
·
3
3.
3.
同浓
度
0.9
3.
后
0.6
本方
3.
“2
处测
色
0.5
3.
6 份
为
测定
0.6
为
3.2

显示
320
或分
次
处
动构
角振
左右
左
600
竹节
3.3

降低
敏感
3.4

酶联
不
的
醇沉
90·
结果
1 竹节参多
1.1 线性关
度溶液的吸
具有良好的线
99 7。
1.2 精密度
,测定 478 n
34、0.632、
法精密度
1.3 稳定性
.2.3”项下
定一次吸光
2 h 内吸光度
1%、0.39%,
1.4 重复性
,按“2.2.3
2.9%、3.4%
样品 30%、
99和0.620
26.9%、61.
红外光谱
不同醇浓度
,30%醇沉物
0～3600 cm
子间氢键
甲基(-CH2-)中
吸收峰是 C-
成了糖环的
动；1030 c
的峰为吡喃
右的峰为吡喃
cm-1左右的
参多糖都是
酶联免疫
将 OVA阳性
,抗体浓度
特异,可在
抗体滴度
将收集的血
免疫吸试试
同醇沉多糖均
佐剂效果最
物最弱,见

糖含量
系考察 将
光度,结果
性关系,Y
试验 对平
m 处吸光度
0.640、0.6
良好。
试验 精密
方法显色后
度,测定 2
都很稳定,
表明稳定性
试验 取3
”项下方法
、3.2%,表示
60%和 90%醇
,应用标准曲
2%和 52.0%。
分析
沉淀多糖的
的多糖很少
-1之间出现
O-H 伸缩振动
C-H伸缩振
H 弯曲振动引
特征吸收；
m-1的峰为醇
糖环的醚键
糖环醚键
较强吸收峰
含有吡喃糖
吸附试验标
抗体进行等
与 OD 值有
此条件下测
检测结果
清进行200
验测定抗体
发挥了佐剂
强,90%醇沉
图 2。
Chinese Jo
对照品准确
显示葡萄糖
＝49.379X＋
行 6 份的对
,分别为 0.
54,计算 RSD
量取 4 份
,均每隔 10
h,结果显示
RSD 分别为 0
良好。
份样品溶液,
测定吸光度,
本方法重复
沉物吸光度
线公式计算

红外光谱图
,60%、90%
1 个宽峰,这
的结果；2
动吸收峰；1
起的,它和
1500 cm-1的
羟基的伸缩
(C-O-C)伸缩
(C-O-C)非对
为脂肪酮引
环的多糖。
准曲线
倍稀释后,
良好线性关系
定样品特异
0及20 000倍
滴度。结果
效应,其中
多糖的佐剂
urnal of
稀释,测定
浓度与其吸
0.174 1,r
照品溶液显
643、0.653
＝1.44%,表
样品溶液,
min 在 478
样品溶液在
.27%、0.32
分别平行制
结果 RSD 分
性良好。同
分别为 0.40
其糖含量分
见图 1。结
醇沉物多糖
是多糖分子
950 cm-1左右
200～1400 c
C-H 的伸缩
峰是 C-H 的
振动；1150 c
振动；900 c
称伸缩振动
起的[4-5]。因此

其OD值也逐
,提示本方
性抗体浓度
稀释后,应
显示,竹节
60%醇沉多
效应稍强,3
Informatio
不
光
2＝
色
、
明
按
nm
显
%、
备
别
时
3、
别
果
在
内
是
m-1
振
变
m-1
m-1
；
,
渐
法
。
用
参
糖
0%

n on TCM
注：A.30%醇沉
图 1 不同
图 2
De
物；B.60%醇沉
醇浓度沉淀竹节

各组小鼠血清 Ig
c.2014 Vo
多糖；C.90%醇沉
参多糖红外光谱
G抗体滴度比较
l.21 No.12
多糖
图

2014 年 12 月第 21 卷第 12 期 中国中医药信息杂志 ·91·
·经验交流·
从化血、灌溉和生髓探讨糖尿病发病机制
金津 1,张泽 2
1.辽宁中医药大学,辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院,辽宁 沈阳 110032
关键词：糖尿病；消渴；中医病机
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.12.027
中图分类号：R259.871 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2014)12-0091-03
临床上,糖尿病有一部分属中医“消渴”范畴,即
典型症状表现为“三多一少”的糖尿病患者可与中医
的三消(鬲消、消中、肾消)相对应。历代医家对消渴
的分类多以上、中、下三部而定,但临床很多患者尤
其是 2 型糖尿患者早期的“三多一少”症状并不明显,
而只表现为血糖升高,这是否也属于“消渴”范畴呢？
要明晰糖尿病的发病机制,首先要了解饮食入胃化生
水谷精微的代谢过程。《素问·经脉别论篇》关于“食
气入胃”、“饮入于胃”的描述,奠定了中医学消化生
理的基础,即食物入胃经腐熟磨化后提取成水谷精
微,后者通过脾的转输升清,上输于心肺,贯注于心脉
而化赤为血。血除了为脏腑提供营养外,剩余的部分
转化为肾精,所谓“肾者主水,受五藏六府之精而藏
之”,精进一步转化为髓。这期间的任何一个环节出

基金项目：国家中医药管理局国医大师传承工作建设基金
(〔2010〕91)
通讯作者：张泽,E-mail：18004010099@163.com
现障碍都可能引起糖尿病。笔者现从化血、灌溉及生
髓等环节就其产生的机制作一阐述。
1 人身三宝,要在化血
1.1 化血有神,心肺中藏
中医概念的血并非仅指现代医学中的血浆、红细
胞等血液组织,而是能有效为人体利用、提供营养的
血,相当于“动脉血”。《灵枢·营卫生会》曰：“中焦
亦并胃口,出上焦之后,此所受气者,秘糟粕,蒸津液,
化其精微,上注于肺脉,乃化而为血,以奉生身,莫贵
于此。”水谷精微“奉心神而化赤”,由此可见,血由
两部分组成：一是“化”(非脾胃之化,乃心神之化)
之后的水谷精微,一是由肺呼吸而来的呼吸精气。糖
尿病患者无法正常利用水谷精微中的葡萄糖而使血
糖升高,现代医学责之于胰岛素分泌不足(1 型糖尿
病),或胰岛素抵抗(2 型糖尿病)。而中医认为不能化
血当责之心肺。多数糖尿病患者肺受纳呼吸精气以化
血的功能几乎没有障碍,故“心之不能化赤为血”乃
首要病因。

4 小结
多糖类物质是一类十分重要的生物活性物质,具
有调节淋巴细胞、吞噬细胞、白细胞介素、抗体水平
功能,多糖经化学修饰形成多孔微颗粒,具有浓缩和
储存抗原作用,多糖微粒可耐受肠道的降解,可发展
成口服免疫载体,故以多糖类物质为佐剂,既可发挥
其增强免疫作用的功效,又可使其具有运载抗原、促
进抗原提高的佐剂活性,可成为研究佐剂的新趋势。
竹节参多糖具有明显的佐剂活性,其中 60%醇沉所得
多糖部分的佐剂活性最强,其总糖含量为 61.2%。本研
究为将竹节参多糖开发为中药疫苗佐剂奠定了基础。
参考文献：
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2007,105(4)：1480-1486.
(收稿日期：2014-03-15；编辑：陈静)