全 文 ：第 38 卷 第 9 期
2016 年 9 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOUＲNAL OF BEIJING FOＲESTＲY UNIVEＲSITY
Vol． 38，No． 9
Sep．，2016
DOI:10． 13332 / j． 1000--1522． 20150423
基于 SＲAP分子标记的刨花润楠遗传多样性分析
周 鹏1，2 林 玮1 朱 芹1，3 周祥斌1 吴林瑛1 陈晓阳1
(1 华南农业大学林学与风景园林学院，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室 2 广东生态工程职业学院 3 嘉应学院生命科学学院)
收稿日期:2015--11--21 修回日期:2016--03--21
基金项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(2012BAD01B04)、广东省林业科技创新项目(2011KJCX002)。
第一作者:周鹏。主要研究方向:林木遗传育种。Email:zhoupeng_0119@ 163． com 地址:510520 广东省广州市天河区广东生态工程职业
学院。
责任作者:陈晓阳，教授，博士生导师。主要研究方向:林木良种选育与生物技术。Email:xychen@ scau． edu． cn 地址:510642 广东省广州
市天河区华南农业大学林学与风景园林学院。
本刊网址:http:j． bjfu． edu． cn;http:journal． bjfu． edu． cn
摘要:采用相关序列扩增多态性分子标记方法，对 7 个省份 23 个种源的刨花润楠进行遗传多样性分析。结果表
明:1)12 对引物组合共扩增出 157 条带，其中 115 条为多态性条带，占总条带数的 73. 24%;2)12 对引物的多态性
指数介于 0. 406 ～ 0. 502，平均值为 0. 476;3)通过分子方差分析发现，刨花润楠种源内差异占总差异的 72. 19%，种
源间差异占总差异的 27. 81%，种源内差异为刨花润楠差异的主要来源;4)基于遗传距离的聚类分析显示，23 个种
源的刨花润楠可分为 4 类:第 1 类为湖南、广东、广西的所有参试种源和江西多数种源，第 2 类为浙江参试的 3 个种
源，第 3 类为江西婺源和安徽黄山 2 个种源，第 4 类为福建参试的 4 个种源，分类结果表现出明显的地理趋势。本
研究结果为刨花润楠种质资源的保存及良种选育提供了一定理论基础。
关键词:刨花润楠;相关序列扩增多态性(SＲAP);遗传多样性
中图分类号:S718. 43;S792. 23 文献标志码:A 文章编号:1000--1522(2016)09--0016--09
ZHOU Peng1，2;LIN Wei1;ZHU Qin1，3;ZHOU Xiang-bin1;WU Lin-ying1;CHEN Xiao-yang1 ． Genetic
diversity of Machilus pauhoi assessed by SＲAP markers． Journal of Beijing Forestry University
(2016)38(9)16--24［Ch，29 ref．］
1 College of Forestry and Landscape Architecture，South China Agricultural University，Guangdong Key
Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm， Guangzhou，
Guangdong，510642，P． Ｒ． China;
2 Guangdong Vocational College of Ecological Engineering，Guangzhou，Guangdong，510520，P． Ｒ． China;
3 School of Life Science，Jiaying University，Meizhou，Guangdong，514015，P． Ｒ． China．
The sequence-related amplified polymorphism(SＲAP)markers were used to assess the genetic
diversity and relationship of 23 Machilus pauhoi Kanehira provenances from seven provinces． Twelve
primers were screened out which were used for SＲAP-PCＲ． The results showed that:1)a total of 157
clear bands were amplified，and 115 bands were polymorphic (the percentage of polymorphic band，PPB =
73. 24%);2)the polymorphism information content (PIC)values ranged from 0. 406 to 0. 502，with an
average of 0. 476;3)the molecular variance analysis (AMOVA)revealed that genetic variation mainly
existed within provenance (72. 19%) and few among provenances (27. 81%) ，showing that the
variation of M． pauhoi within provenances was the major source of genetic diversity;4) the cluster
analysis results suggest that 23 provenances should be divided into four categories:provenances from
Hunan，Guangdong，Guangxi and Jiangxi are clustered in the same group;all provenances from Zhejiang
Province are together;Wuyuan and Huangshan provenances are classed together;and all provenances
from Fujian Province are clustered into one group，The classification results reflect geographic trends
significantly． The result of this study provides theoretical basis for germplasm resources preservation and
breeding programs of M． pauhoi．
Key words Machilus pauhoi Kanehira;sequence-related amplified polymorphism;genetic diversity
第 9 期 周 鹏等:基于 SＲAP分子标记的刨花润楠遗传多样性分析
刨花润楠 (Machilus pauhoi Kanehira)，又名刨
花楠、刨 花 (广 东)、粘 柴 (福 州)，属 樟 科
(Lauraceae)润楠属常绿大乔木。刨花润楠是一个
亚热带树种，喜阴耐湿，分布于长江以南东南各省海
拔 300 ～ 1 200 m，生于山坡及沟谷，与甜槠
(Castanopsis eyrei)、木 荷 (Schima superba)、桃
(Amygdalus persica)等混生成小片纯林。刨花润楠
生长迅速，树干通直，出材量大;叶中可提取精油，不
仅是优良的天然香料，且精油中所含薁化物
(Azulenes)，具有独特的药用价值;其茎是制作药物
“白楠木”的原料;树皮含树脂、橡胶;种子含油率
高，是优良的工业润滑油，可供制皂及制蜡用;刨花
润楠树形高大，树形美观，枝繁叶茂，四季常青，嫩叶
呈粉红色或红棕色，是优良的庭院观赏、园林绿化树
种。由于刨花润楠全身是宝，是一种极具经济价值
和开发前景的阔叶树种［1
--3］。目前对刨花润楠研究
主要集中于育苗和繁殖技术等方面，而在遗传多样
性、育种等方面的研究几乎空白。刨花润楠种子不
宜贮藏，一般采用随播随采的方式。同时由于开发
过度开发利用，野生刨花润楠数量正日益减少，对刨
花润楠遗传资源的收集、研究、保护和利用迫在
眉睫。
相 关 序 列 扩 增 多 态 性 (Sequence-related
amplified polymorphism，SＲAP)分子标记是由美国
加州大学 Li与 Quiros 博士开发出的一种用于研究
DNA多态性的新型分子标记技术［4］。与其他分子
标记相比，该标记有很多优点:稳定可靠，多态性高，
信息量大，共显性高;在基因组中分布均匀，易测序，
引物具有通用性;操作简单，成本低廉等［5］。SＲAP
技术目前已广泛用于农作物和蔬菜的遗传图谱构
建、比较基因组学、遗传多样性分析和基因定位
等［6
--12］诸多研究领域，但对于我国林木研究应用的
相关报道还相对较少;国内外已采用分子标记手段
对樟科植物进行了遗传多样性研究［13
--17］，但还未发
现关于分子标记手段运用于刨花润楠分布区遗传资
源研究的相关报道。因此借鉴樟科其他植物遗传多
样性分析，对刨花润楠天然分布群体进行遗传多样
性研究，有利于充分了解刨花润楠天然分布群体的
遗传结构、亲缘关系及变异情况，从而更好的对刨花
润楠种质资源进行保护。本研究利用 SＲAP分子标
记技术对我国 7 个省份 23 个种源的刨花润楠进行
遗传多样性及聚类分析，为刨花润楠的种源采集及
良种选育提供一定的理论依据，同时为 SＲAP 分子
标记技术应用于刨花润楠等润楠属植物的鉴别及遗
传多样性的研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
从刨花润楠天然分布区的广东、广西、福建、江
西、湖南和安徽等地选取天然林种群中通直优良大
树采种，在广州市华南农业大学启林区教学科研基
地育苗，取 0. 5 年生实生苗次嫩叶片为试验材料。
苗圃的地理位置为 113°37 E、23°16 N，海拔 42. 3
m，属南亚热带季风气候区，全年平均气温为 21. 9
℃，平均年降水量 1 696. 5 mm，降雨多集中于 4—9
月份，雨量充沛。各种源的基本情况及地理位置见
表 1。
表 1 刨花润楠各种源采集地及其地理信息
Tab． 1 Geographical factors of Machilus pauhoi provenances
编号
Number
原产地
Origin
纬度
Latitude
经度
Longitude
样本数
Number of samples
pop1 广西贺州 Hezhou，Guangxi 24°2450″ N 111°3255″ E 10
pop2 广西兴安 Xingan，Guangxi 25°3054″ N 110°3655″ E 10
pop3 广西昭平 Zhaoping，Guangxi 24°1232″ N 110°4546″ E 10
pop4 广东仁化 Ｒenhua，Guangdong 25°0508″ N 113°4501″ E 10
pop5 广东阳山 Yangshan，Guangdong 24°2758″ N 112°3904″ E 10
pop6 广东乐昌 Lechang，Guangdong 25°0746″ N 113°2130″ E 10
pop7 广东乳源 Ｒuyuan，Guangdong 24°4932″ N 113°1032″ E 9
pop8 江西安福 Anfu，Jiangxi 27°1437″ N 114°1318″ E 10
pop9 江西遂川 Suichuan，Jiangxi 26°2411″ N 114°2406″ E 10
pop10 江西婺源 Wuyuan，Jiangxi 29°1112″ N 117°2810″ E 10
pop11 江西全南 Quannan，Jiangxi 24°5916″ N 114°3523″ E 10
pop12 江西崇义 Chongyi，Jiangxi 25°4931″ N 113°5847″ E 6
pop13 湖南祁阳 Qiyang，Hunan 26°3455″N 111°5131″ E 10
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北 京 林 业 大 学 学 报 第 38 卷
表 1(续)
编号
Number
原产地
Origin
纬度
Latitude
经度
Longitude
样本数
Number of samples
pop14 湖南茶陵 Chaling，Hunan 26°4659″N 113°4500″ E 6
pop15 湖南会同 Huitong，Hunan 26°5222″N 109°4304″ E 5
pop16 浙江建德 Jiande，Zhejiang 29°2914″N 119°2246″ E 10
pop17 浙江温州 Wenzhou，Zhejiang 27°5946″ N 120°3357″ E 10
pop18 浙江乐清 Leqing，Zhejiang 28°0603″N 120°5157″ E 10
pop19 福建建瓯 Jianou，Fujian 27°0130″N 118°1825″ E 10
pop20 福建泉州 Quanzhou，Fujian 25°1919″N 118°1756″ E 10
pop21 福建顺昌 Shunchang，Fujian 26°4138″ N 118°0444″ E 10
pop22 福建龙岩 Longyan，Fujian 25°0613″N 117°0206″ E 8
pop23 安徽黄山 Huangshan，Anhui 29°4404″ N 117°5836″ E 3
总计 Total 207
1. 2 SＲAP扩增体系及程序
选取 4 个不同种源的刨花润楠 DNA，通过单因
子及正交实验设计建立并优化刨花润楠 SＲAP-PCＲ
最佳反应体系(25 μL)为:10 × PCＲ buffer 2. 5 μL、
模板 DNA 量 60 ng、Mg2 + 2. 0 mmol /L、dNTP 0. 225
mol / L、引物 0. 3 μmol /L和 Taq DNA聚合酶 1. 25 U。
SＲAP-PCＲ反应程序为:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变
性 1 min，35 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 1 min，5 个循
环;94 ℃变性 1 min，55 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 1
min，35 个循环;72 ℃延伸 10 min;10 ℃保存［4］。
1. 3 引物筛选
每个种群选取 1 株样品的 DNA进行引物筛选，
对 29 个正向引物和 27 个反向引物配对组合共 783
个引物组合扩增，最终选用电泳条带较为清晰、稳定
性高、具有多态性的引物组合 12 对(表 2)，部分引
物对模板 DNA 的扩增结果进行电泳结果如图 1
所示。
泳道 1 ～ 8 为 Me18 /Em7 扩增产物条带，泳道 9 ～ 16 为 Me18 /Em6 扩增产物条带，
泳道 17 ～ 24 为 Me24 /Em9 扩增产物条带。M为 DL2000 DNA分子标记。
1 ～ 8，amplified bands of primers Me18 /Em7;9 ～ 16，amplified bands of primers Me18 /Em6;
17 ～ 24，amplified bands of primers Me24 /Em9． M，DL2000 DNA marker．
图 1 刨花润楠 SＲAP分子标记部分引物复筛结果
Fig． 1 Part results of primer screening for Machilus pauhoi by SＲAP markers
1. 4 数据统计
将扩增产物用 6%聚丙烯凝胶电泳分离，采用
银染法染色，筛选可重复、分布均匀且多态性良好的
条带进行读取。对扩增片段大小在 100 ～ 800 bp 之
间的进行统计，有带记录为“1”，无带记录为“0”，建
立相关数据库。并采用 POPgene1. 32、NTsys2. 1、
GenALE6. 501 和 Excel 等软件对数据进行处理，计
算各种源的遗传多样性指数、多态性信息、Neis 遗
传 距 离 和 遗 传 一 致 度 等［18］。运 用 UPGMA
(unweighted pair group method with arithmetic)进行
聚类分析，并构建聚类图［19］。同时检测刨花润楠种
源之间的遗传距离与地理距离的相关性，并进行分
子方差分析(AMOVA)［20］。
2 结果与分析
2. 1 SＲAP扩增片段多态性分析
对 23 个种源 205 个样本进行 SＲAP-PCＲ分析，
用筛选出的 12 对引物组合对全部样本进行扩增，扩
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第 9 期 周 鹏等:基于 SＲAP分子标记的刨花润楠遗传多样性分析
表 2 SＲAP引物序列
Tab． 2 Sequence of SＲAP primers
正向引物 Forward primer 反向引物 Ｒeverse primer
名称
Name
序列 (5-3)
Sequence (5-3)
名称
Name
序列 (5-3)
Sequence (5-3)
Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me2 TGAGTCCAAACCGGAGC Em2 GACTGCGTACGAATTTGC
Me3 TGAGTCCAAACCGGAAT Em3 GACTGCGTACGAATTGAC
Me4 TGAGTCCAAACCGGACC Em4 GACTGCGTACGAATTTGA
Me5 TGAGTCCAAACCGGAAG Em5 GACTGCGTACGAATTAAC
Me6 TGAGTCCAAACCGGTAA Em6 GACTGCGTACGAATTGCA
Me7 TGAGTCCAAACCGGTCC Em7 GACTGCGTACGAATTGAG
Me8 TGAGTCCAAACCGGTGC Em8 GACTGCGTACGAATTGCC
Me9 TGAGTCCAAACCGGACA Em9 GACTGCGTACGAATTTCA
Me10 TGAGTCCAAACCGGACG Em10 GACTGCGTACGAATTCAA
Me11 TGAGTCCAAACCGGACT Em11 GACTGCGTACGAATTGCA
Me12 TGAGTCCAAACCGGAGG Em12 GACTGCGTACGAATTCAT
Me13 TGAGTCCAAACCGGAAA Em13 GACTGCGTACGAATTCTA
Me14 TGAGTCCAAACCGGAAC Em14 GACTGCGTACGAATTCTC
Me15 TGAGTCCAAACCGGAGA Em15 GACTGCGTACGAATTCTT
Me16 TGAGTCCAAACCGGTAG Em16 GACTGCGTACGAATTGAT
Me17 TGAGTCCAAACCGGCAT Em17 GACTGCGTACGAATTATG
Me18 TGAGTCCAAACCGGTTG Em18 GACTGCGTACGAATTAGC
Me19 TGAGTCCAAACCGGTGT Em19 GACTGCGTACGAATTACG
Me20 TGAGTCCAAACCGGTCA Em20 GACTGCGTACGAATTTAG
Me21 TGAGTCCAAACCGGGCA Em21 GACTGCGTACGAATTTCG
Me22 TGAGTCCAAACCGGATG Em22 GACTGCGTACGAATTGTC
Me23 TGAGTCCAAACCGGGAT Em23 GACTGCGTACGAATTGGT
Me24 TGAGTCCAAACCGGGCT Em24 GACTGCGTACGAATTCAG
Me25 TTCAGGGTGGCCGGATG Em25 GACTGCGTACGAATTCTG
Me26 TGGGGACAACCCGGCTT Em26 GACTGCGTACGAATTCGG
Me27 TGAGTCCAAACCGGATC Em27 GACTGCGTACGAATTCCA
Em28 GACTGCGTACGAATTCGA
Em29 GACTGCGTACGAATTATT
增条带统计带长范围均在 100 ～ 800 bp 之间。共扩
增出 157 条条带，其中 115 条为多态性条带。每对
引物所扩增的多态性条带数目和多态性信息指数
(PIC)等相关数据详见表 3。部分引物扩增所得的
电泳图谱见图 2。
由表 3 可以看出，12 对引物中每对引物扩增的
条带数(No． of polymorphic bands，NPB)范围为 9 ～
15 条，平均高达 13 条左右，Me18 /Em7 引物组合扩
增的条带数相对较少，引物组合 Me17 /Em24、Me17 /
Em24 扩增的条带数相对较多。其中，多态性片段
范围为 6 ～ 11 条，平均为 9 条，Me18 /Em7 引物组合
扩增的多态性条带数也为最少，Me17 /Em24、Me21 /
Em16 和 Me24 /Em9 扩增的多态性条带多达 11 条。
多态性条带的比例 (Percentage of polymorphic
bands，PPB)从 66. 67% ～ 84. 61%(Me24 /Em9)，平
均值为 73. 24%。
PIC是用来衡量不同引物对反应多态性高低的
程度，本研究中 PIC 范围为 0. 406(Me18 /Em6)～
0. 502(Me17 /Em24)，平均值为 0. 476。每对引物组
合 PIC指数均较高，说明所选用引物组合对刨花润
楠各种群的分离效果较为良好。
2. 2 刨花润楠遗传多样性分析
应用 POPgene 1. 32 和 GenAlEx 6. 501 软件对刨
花润楠 SＲAP标记条带数据进行统计分析。由表 4
可以看出，刨花润楠 23 个种源之间的遗传多样性水
平存在差异，各种群多态位点的数目(Number of
polymorphic loci，Np)为 36 ～ 89，平均值为 69. 43;多
态性位点所占百分比(Percentage of polymorphic
loci，Pp)为 24. 83% ～61. 38%，平均值为 47. 89%。
统计刨花润楠各个种源每个位点的等位标记观
测数(Observed number of alleles，Na)、有效等位标
记数(Effective number of alleles，Ne)、Nei’s遗传多
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北 京 林 业 大 学 学 报 第 38 卷
表 3 引物对多态性条带数目和多态性信息指数
Tab． 3 Polymorphism number and PIC of 12 SＲAP primer combinations
引物对
Primer
combination
扩增条带数
Total number
of bands
多态性条带数
No． of
polymorphic bands
多态性条带比例
Percentage of
polymorphic bands /%
多态性信息指数
Polymorphism
information content(PIC)
Me1 /Em2 12 10 83. 33 0. 495
Me4 /Em4 14 10 71. 42 0. 500
Me3 /Em8 12 8 66. 67 0. 482
Me17 /Em24 15 11 73. 33 0. 499
Me18 /Em6 14 10 71. 42 0. 406
Me18 /Em7 9 6 66. 67 0. 499
Me19 /Em24 13 9 69. 23 0. 478
Me21 /Em06 15 10 66. 67 0. 502
Me21 /Em16 14 11 78. 57 0. 455
Me24 /Em9 13 11 84. 61 0. 491
Me24 /Em17 14 10 71. 42 0. 433
Me24 /Em19 12 9 75. 00 0. 474
总计 Total 157 115
平均 Mean 13. 08 9. 58 73. 24 0. 476
M:100 bp DNA梯状条带。1 ～ 10 为 pop1 的 10 个家系，11 ～ 20 为 pop2 的 10 个家系，21 ～ 30 为 pop3 的 10 个家系，31 ～ 40 为
pop4 的 10 个家系，41 ～ 50 为 pop5 的 10 个家系。M，DNA marker (100 bp DNA ladder)． 1 ～ 10，10 plants of pop1;11 ～ 20，
10 plants of pop2;21 ～ 30，10 plants of pop3;31 ～ 40，10 plants of pop4;41 ～ 50，10 plants of pop5．
图 2 Me17 /Em24 引物组合的扩增结果
Fig． 2 Amplified results by the primer pair of Me17 /Em24
样性指数(Neis gene diversity，H)，Shannon 信息指
数(Shannons information index，I)等指标。结果表
明:在 23 个种源间，各指标有明显差异，等位标记观
测数(Na)变幅为 1. 248 3 ～ 1. 613 8，平均等位标记
观测数为 1. 52，有效等位标记数(Ne)的变幅为
1. 163 7 ～ 1. 409 5，平均有效等位标记数为 1. 35，
Nei’s 遗传多样性指数(H)的变幅为 0. 095 6 ～
0. 233 0，平均值为 0. 171 7，Shannon 信息指数(I)变
幅为 0. 140 1 ～ 0. 343 1，平均值为 0. 253 9。23 个不
同种源刨花润楠的 Nei’s 遗传多样性指数及
Shannon’s信息指数的相对较小，可知刨花润楠种
群内的多样性较低，福建建瓯种源最低，应尽量收集
更多的种质资源。根据 4 项指标的综合分析，广西
兴安种源内遗传多样性最为丰富，在选用该种源时，
还要注重群体内的选择。
在种群水平上，刨花润楠总遗传多样性 Ht 为
0. 258 9，种源内平均遗传多样性 Hs 为 0. 171 7，群
体间的遗传分化系数 Gst 为 0. 336 6，基因流 Nm 为
0. 985 6，说明刨花润楠不同种群间基因交流相对较多。
2. 3 刨花润楠的分子方差分析(AMOVA)
刨花润楠分子方差分析(表 5)表明，刨花润楠
总的遗传变异中，72. 19%的遗传变异发生在种源
内，而只有 27. 81% 的变异发生在种源间，种源间和
种源内的变异均为极显著(P ＜ 0. 001)。由此说明，
刨花润楠种源内变异大于种源间，即刨花润楠种源
内的遗传变异为主要变异。
02
第 9 期 周 鹏等:基于 SＲAP分子标记的刨花润楠遗传多样性分析
表 4 23 个刨花润楠种源的遗传多样性指数
Tab． 4 Genetic diversity parameters of 23 Machilus pauhoi provenances
编号
Number
多态性位点数目
Number of
polymorphic
loci
多态性位点百分比
Percentage of
polymorphic
loci /%
等位标记观测数
Observed
number of
alleles
有效等位标记数
Effective
number of
alleles
Neis
遗传多样性
Neis
gene diversity
Shannons
多样性指数
Shannons
information index
pop1 77 53. 10 1. 53 ± 0. 50 1. 34 ± 0. 39 0. 20 ± 0. 21 0. 29 ± 0. 30
pop2 89 61. 38 1. 61 ± 0. 49 1. 41 ± 0. 40 0. 23 ± 0. 21 0. 34 ± 0. 30
pop3 78 53. 79 1. 54 ± 0. 50 1. 35 ± 0. 39 0. 20 ± 0. 21 0. 30 ± 0. 30
pop4 74 51. 03 1. 51 ± 0. 50 1. 33 ± 0. 39 0. 19 ± 0. 21 0. 28 ± 0. 30
pop5 76 52. 41 1. 52 ± 0. 50 1. 34 ± 0. 39 0. 20 ± 0. 21 0. 29 ± 0. 30
pop6 82 56. 55 1. 57 ± 0. 50 1. 38 ± 0. 39 0. 22 ± 0. 21 0. 32 ± 0. 30
pop7 84 57. 93 1. 58 ± 0. 50 1. 36 ± 0. 39 0. 21 ± 0. 21 0. 31 ± 0. 29
pop8 73 50. 34 1. 50 ± 0. 50 1. 33 ± 0. 40 0. 19 ± 0. 21 0. 28 ± 0. 30
pop9 71 48. 97 1. 49 ± 0. 50 1. 32 ± 0. 40 0. 18 ± 0. 21 0. 26 ± 0. 30
pop10 62 42. 76 1. 43 ± 0. 50 1. 26 ± 0. 36 0. 15 ± 0. 19 0. 22 ± 0. 28
pop11 84 57. 93 1. 60 ± 0. 50 1. 40 ± 0. 40 0. 23 ± 0. 21 0. 33 ± 0. 30
pop12 65 44. 83 1. 45 ± 0. 50 1. 35 ± 0. 43 0. 19 ± 0. 22 0. 28 ± 0. 32
pop13 81 55. 86 1. 56 ± 0. 50 1. 34 ± 0. 38 0. 20 ± 0. 20 0. 29 ± 0. 30
pop14 54 37. 24 1. 37 ± 0. 49 1. 26 ± 0. 38 0. 15 ± 0. 20 0. 22 ± 0. 29
pop15 67 46. 21 1. 46 ± 0. 50 1. 29 ± 0. 38 0. 17 ± 0. 20 0. 25 ± 0. 29
pop16 55 37. 93 1. 38 ± 0. 49 1. 25 ± 0. 36 0. 14 ± 0. 20 0. 21 ± 0. 28
pop17 41 28. 28 1. 29 ± 0. 45 1. 16 ± 0. 30 0. 10 ± 0. 17 0. 15 ± 0. 25
pop18 69 47. 59 1. 48 ± 0. 50 1. 29 ± 0. 36 0. 17 ± 0. 20 0. 25 ± 0. 29
pop19 36 24. 83 1. 25 ± 0. 43 1. 17 ± 0. 33 0. 09 ± 0. 18 0. 14 ± 0. 26
pop20 67 46. 21 1. 46 ± 0. 50 1. 30 ± 0. 36 0. 17 ± 0. 20 0. 25 ± 0. 29
pop21 43 29. 66 1. 30 ± 0. 46 1. 19 ± 0. 34 0. 11 ± 0. 18 0. 16 ± 0. 26
pop22 76 52. 41 1. 52 ± 0. 50 1. 30 ± 0. 36 0. 18 ± 0. 19 0. 27 ± 0. 28
pop23 39 26. 9 1. 27 ± 0. 45 1. 19 ± 0. 34 0. 11 ± 0. 18 0. 16 ± 0. 26
平均 Mean 69. 43 47. 89
表 5 刨花润楠不同种源的分子方差分析
Tab． 5 Analysis of molecular variance (AMOVA)of 23 provenances of Machilus pauhoi
变异来源
Source
自由度
Degree of
freedom
总方差
Sum of
squares
均方差
Mean
squares
方差分量
Variation
component
百分比
Percentage /
%
P
种群间 Among provenances 22 1 411. 226 64. 147 5. 585 27. 81 ＜ 0. 001
种群内 Within provenances 182 2 637. 886 14. 494 14. 494 72. 19 ＜ 0. 001
总计 Total 204 4 049. 112 20. 079 100
注:P值是通过把种源的样本经过 1 000 次随机排列改变计算得到的。Note:P values were calculated by 1 000 random permutations of individuals
across populations．
2. 4 刨花润楠种源间的聚类分析
通过对刨花润楠 23 个种源的遗传距离及遗传
相似度进行统计分析，23 个刨花润楠种群遗传相似
系数为 0. 786 1 ～ 0. 996 7，平均值为 0. 903 9，而遗传
距离为 0. 003 4 ～ 0. 240 7，平均值为 0. 102 3。其中，
江西婺源和安徽黄山遗传相似系数最大、遗传距离
最小，其遗传相似系数和遗传距离分别为 0. 996 7、
0. 003 4，即遗传差异最小，福建建瓯和广西贺州遗
传相似系数最小、遗传距离最大，分别为 0. 786 1、
0. 240 7，说明两者间遗传差异最大。总体而言，刨
12
北 京 林 业 大 学 学 报 第 38 卷
花润楠种源间遗传距离较小，表明遗传变异较小，亲
缘关系较近。
根据遗传相似系数对 23 个刨花润楠种源进行
UPGMA聚类分析(图 3)。以 0. 910 为阀值，23 个
种源可以分为 4 类。第 1 类为湖南、广东、广西的所
有参试种源和江西多数种源;第 2 类为浙江参试的
3 个种源;第 3 类为江西婺源和安徽黄山 2 个种源;
第 4 类为福建参试的 4 个种源，分类结果表现出明
显的地理趋势。
通过 计 算 各 种 源 间 的 地 理 距 离，结 合
POPgene1. 32 计 算 出 的 遗 传 距 离，运 用
GenALE6. 501 软件进行 Mantel 检验，结果表明，刨
花润楠群体的遗传距离和地理距离之间存在显著相
关(Ｒxy = 0. 445，P = 0. 001)。这进一步说明种源的
遗传变异具有明显的地理趋势。
图 3 23 个不同种源刨花润楠的聚类图
Fig． 3 UPGMA clustering dendrogram of 23 Machilus pauhoi provenances
3 讨论与结论
PIC常用来衡量基因位点多态性高低的程度，
本研究中 PIC指数范围为 0. 406 ～ 0. 502，平均值为
0. 476，位点多态性良好，说明本研究中 SＲAP 分子
标记能较好的衡量刨花润楠不同种源的遗传多样
性，可用于该物种的遗传多样性相关研究［21
--22］。
在种群水平上，刨花润楠总遗传多样性 Ht 为
0. 258 9，种源内平均遗传多样性 Hs 为 0. 171 7，群
体间的遗传分化系数 Gst 为 0. 336 6，基因流 Nm 为
0. 985 6，说明刨花润楠不同种群间基因交流相对较
多，这与其繁育系统、地理分布和生活习性密切相
关。Ｒohwer认为几乎所有的樟科植物都为异交模
式，它们的雌雄蕊同步异熟，从而可有效地防止自花
授粉发生［23］。因此，我们可初步推断刨花润楠与其
他樟科植物一样，进行类似的异交繁殖。植物异交
有利于种源内个体之间的基因交换，同时可使种源
间进行相关的基因交流，使之保持较高的基因流。
本研究中通过 Gst 估算出来的基因流 Nm 值为
0. 985 6，与其他异交物种的基因流进行对比，发现
刨花润楠种源间的基因流偏低［24］。在野外采种考
察中发现刨花润楠主要分布于长江以南东南各省海
22
第 9 期 周 鹏等:基于 SＲAP分子标记的刨花润楠遗传多样性分析
拔 300 ～ 1 200 m，生于山坡及沟谷，呈现稀疏小群落
的分布状况。稀疏的小群落之间存在一定的隔离，
可能是因地理距离原因，也可能是花粉传播过程受
媒介活动能力限制，从而导致了该异交物种基因流
偏低。同时，在刨花润楠总的遗传变异中，72. 19%
的遗传变异发生在种源内，种源内变异远大于种源
间，即刨花润楠种源内的遗传变异为主要变异。从
物种水平来看，刨花润楠遗传多样性(Ht为 0. 258 9)高
于樟科其他大部分树种［25
--26］;从种源水平来看，遗
传多样性较低，尤其是福建建瓯、浙江温州、安徽黄
山等小群落。从我们野外采种时所入选样品来看，
多数为已成熟的的大树，所以对于单株较少的种源
(如安徽黄山)，我们要减少对该类种源的砍伐破
坏，尽可能的保留遗传信息较为丰富的大树，实施有
效的就地保护措施。同时由于刨花润楠的遗传变异
主要来自种源内，在对于该树种种质资源的保护和
选择育种时，尽可能保护和选育多个不同优良种源，
且注重在优良种源内优树的收集和选择，所以应在
各个种源内进行大量的采样用于迁地保护［27
--28］。
种源间存在一定的遗传分化，可采用不同种源间进
行混合繁殖和相互移植的方法，以提高其遗传多样
性水平。
遗传距离及遗传一致度共同体现了不同地理来
源的刨花润楠间的亲缘关系。本研究中结果显示
23 个种源遗传距离为 0. 003 4 ～ 0. 240 7，平均值为
0. 102 3，而遗传一致度为 0. 786 1 ～ 0. 996 7，平均值
为 0. 903 9;表明刨花润楠种源间的遗传差异相对较
小，由此可推断中国境内各省份的刨花润楠种源间
亲缘关系较近。
UPGMA聚类结果显示，23 个种源可以分为 4
类。第 1 类为包含湘、粤、桂、赣 4 个省，覆盖的地理
区域很大，这也说明在这样大的区域里，刨花润楠种
源间的差异不大;第 2 类为浙江参试的 3 个种源;第
3 类为江西婺源和安徽黄山 2 个种源;第 4 类为福
建参试的 4 个种源，分类结果呈现出比较明显的地
理趋势。采用 GenALE6. 501 软件进行 Mantel检验，
结果表明刨花润楠群体的遗传距离和地理距离之间
存在显著相关(Ｒxy = 0. 445，P = 0. 001)。从而表明
地理空间的隔离大于遗传漂变在刨花润楠的种源的
自然分化中所产生的作用，符合 Wright 所提出的种
源“距离决定隔离”的自然分化理论［29］。
本研究采用 SＲAP 分子标记，对刨花润楠不同
种源进行遗传多样性分析，为刨花润楠种质资源的
保存、评价及良种选育提供了一定的理论依据。
参 考 文 献
［1］ 吴振伙，吴兆平，全尚龙．刨花润楠综合利用价值及其育苗技
术［J］．现代农业科技，2008(20):55．
WU Z H，WU Z P，QUAN S L． Utilization value and breeding
techniques of Machilus pauhoi Kanehira［J］． Modern Agricultural
Sciences and Technology，2008(20) :55．
［2］ 胡希华．刨花润楠的优良特性及育苗栽培技术［J］．湖南林业
科技，2006，33(1):65--66．
HU X H． Excellent characteristics and seedling cultivation
techniques of Machilus pauhoi Kanehira［J］． Hunan Forestry
Science ＆ Technology，2006，33(1) :65--66．
［3］ 钟智群，谭梓峰，杨志玲，等．刨花楠生长发育特点及开发前景
分析［J］．湖南林业科技，1997，24(2):50--51．
ZHONG Z Q， TAN Z F， YANG Z L， et al． The growth
characteristics and development prospects of Machilus pauhoi
Kanehira［J］． Hunan Forestry Science ＆ Technology，1997，24
(2) :50--51．
［4］ LI G，QUIＲOS C F． Sequence-related amplified polymorpgism
(SＲAP) ，a new marker system based on a simple PCＲ reaction:
its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］．
Theoretical and Applied Genetics，2001，103:455--461．
［5］ 王国泽，左福元，曾兵． SＲAP分子标记的研究进展及在植物上
的应用［J］．畜牧与兽医，2013，45(9):92--95．
WANG G Z，ZUO F Y，ZENG B． The development of SＲAP
molecular markers and the application in plant［J］． Animal
Husbandry ＆Veterinary Medicine，2013，45(9) :92--95．
［6］ LI G，GAO M，YANG B，et al． Gene for gene alignment between
the Brassica and Arabidopdsis genomes by direct transcriptome
mapping［J］． Theoretical Applied Genetics，2003，107(1) :168--
180．
［7］ 董爱香，王涛，徐进，等．用 SＲAP分子标记分析一串红品种资
源的亲缘关系［J］．北京林业大学学报，2012，34(5):134--138．
DONG A X，WANG T，XU J，et al． Genetic relationship of
germplasm resources of Salvia splendens using SＲAP marker［J］．
Journal of Beijing Forestry University，2012，34(5) :134--138．
［8］ 李达，熊兴耀，于晓英，等．红花檵木 SＲAP反应体系的建立及
优化［J］．中南林业科技大学学报，2008，28 (5):22--27．
LI D， XIONG X Y， YU X Y， et al． Establishment and
optimization of SＲAP reaction system in Loropetalum chinense var．
rubrum［J］． Journal of Central South University of Forestry ＆
Technology，2008，28(5) :22--27．
［9］ 姜树坤，马慧，刘君，等．利用 SＲAP标记分析玉米遗传多样性
［J］．分子植物育种，2007，5(3):412--416．
JIANG S K，MA H，LIU J，et al． Genetic diversity in maize inbred
lines revealed by SＲAPs marker［J］． Molecular Plant Breeding，
2007，5(3) :412--416．
［10］ 王燕，龚义勤，赵统敏，等．番茄 SＲAP-PCＲ体系优化与品种分
子鉴定［J］．南京农业大学学报，2007，30(1):23--29．
WANG Y，GONG Y Q，ZHAO T M，et al． Optimization of SＲAP-
PCＲ system and cultivar molecular identification in tomato
(Lycopersicon esculentum L．) ［J］． Journal of Nanjing Agricultural
University，2007，30(1) :23--29．
［11］ 李明芳，卢诚，刘兴地，等． 小桐子 25 个无性系遗传多样性的
SＲAP分析［J］．中国农学通报，2014(1):26--31．
LI M F，LU C，LIU X D，et al． Genetic diversity analysis among
32
北 京 林 业 大 学 学 报 第 38 卷
25 Clones of Jatropha curcas by SＲAP markers［J］． Chinese
Agricultural Science Bulletin，2014(1):26--31．
［12］ 姜艳，刘进平．胡椒 SＲAP反应体系的建立和优化［J］．中国农
学通报，2012，28(31):141--145．
JIANG Y，LIU J P． Establishment and optimization of black pepper
SＲAP reaction system［J］． Chinese Agricultural Science Bulletin，
2012，28(31) :141--145．
［13］ YUKO K，CHUNLAN L，SHUNTAＲO W，et al． Development of
microsatellites in Machilus thunbergii (Lauraceae) ，a warm-
temperate coastal tree species in Japan［J］． American Journal of
Botany，2012，99(7) :265--267．
［14］ TSUNEKI S，MOＲI K，KANEKO S，et al． Identification and
characterization of eight microsatellite loci in Machilus pseudokobu
(Lauraceae) ，an endemic species of the Bonin Islands［J］．
Conservation Genetics，2009，10(6) :2009--2011．
［15］ ZHANG Ｒ，ZHOU Z C，JIN G Q，et al． Genetic diversity and
differentiation within three species of the family Lauraceae in
southeast China［J］． Biochemical Systematics and Ecology，2012，
44:317--324．
［16］ 刘玉香，宋晓琛，江香梅．润楠 ISSＲ-PCＲ优化反应体系建立及
引物筛选［J］．林业科技开发，2013，27(5):24--28．
LIU Y X，SONG X C，JIANG X M． Optimization of ISSＲ-PCＲ
reaction system and primers screening in Machilus pingii［J］．
China Forestry Science and Technology，2013，27(5) :24--28．
［17］姜荣波．红楠群体遗传多样性及优良种源选择［D］．北京:中国
林业科学研究院，2011．
JIANG Ｒ B． Population genetic diversity and selection of superior
provenances of Machilus thunbergii ［D］． Beijing: Chinese
Academy of Forestry，2011．
［18］ YEH F C，YANG Ｒ C，BOYLE T． Microsoft window-based
freeware for population genetic analysis， quick user guide:
popgene version 1． 31［EB /OL］． Edmonton: University of
Alberta，1999．
［19］ ＲOHLF F J． NTSYS-pc numerical taxonomy and multivariate
analysis system: verson 2． 1［EB /OL］． New York: Exeter
Software，2000．
［20］ PEAKALL Ｒ，SMOUSE P E． GenAlEx 6． 5:genetic analysis in
excel． population genetic software for teaching and research:an
update［J］． Bioinformatics，2012，28(19):2537--2539．
［21］ VAIMAN D，MEＲCIEＲ D，MOAZAMI-GOUDAＲZI K，et al． A
set of 99 cattle microsatellites，characterization，synteny mapping
and polymorphism［J］． Mammalian Genome，1994，5(5) :288--
297．
［22］ XIE W G，ZHANG X Q，CAI H W，et al． Genetic diversity
analysis and transferability of cereal EST-SSＲ markers to
orchardgrass (Dactylis glomerata L．) ［J］． Biochemical
Systematics and Ecology，2010，38(4) :740--749．
［23］ KUBITZKI K，ＲOHWEＲ J G，BITTＲICH V． The families and
genera of vascular plants． Vol． 2:flowering plants［M］． Berlin:
Springer-Verlag，1993．
［24］ WＲIGHT S． The genetical structure of populations［J］． Nature，
1950，166:247--249．
［25］ 王峥峰，高山红，田胜尼，等．南亚热带森林片断化对厚壳桂种
群遗传结构的影响［J］．生物多样性，2005，13(4):324--331．
WANG Z F，GAO S H，TIAN S N，et al． Genetic structure of
Cryptocarya chinensis in fragmented lower subtropical forests in
China based on ISSＲ markers［J］． Biodiversity Science，2005，13
(4) :324--331．
［26］ 王中生，安树青，冷欣，等．岛屿植物舟山新木姜子居群遗传多
样性的 ＲAPD分析［J］．生态学报，2004，24(3):414--422．
WANG Z S，AN S Q，LENG X，et al． Population genetic diversity
of the insular plant Neolitsea sericea based on random amplified
polymorphic DNA (ＲAPD) ［J］． Acta Ecologica Sinica，2004，
24(3) :414--422．
［27］ 陈俊秋，慈秀芹，李巧明，等．樟科濒危植物思茅木姜子遗传多
样性的 ISSＲ分析［J］．生物多样性，2006，14(5):410--420．
CHEN J Q，CI X Q，LI Q M，et al． Genetic diversity of Litsea
szemaois，an endangered species endemic to China，detected by
inter-simple sequence repeat (ISSＲ) ［J］． Biodiversity Science，
2006，14(5) :410--420．
［28］ 慈秀芹．樟科濒危植物思茅木姜子(Litsea szemaois)的保护遗
传学研究［D］．西双版纳:中国科学院研究生院(西双版纳热
带植物园)，2007．
CI X Q． Studies on conservation genetics of endangered species
Litsea szemaois (Lauraceae ) ［D ］． Xishuangbanna:
Xishuangbanna Tropical Botanical Garden，Chinese Academy of
Sciences，2007．
［29］ WＲIGHT S． Isolation by distance［J］． Genetics，1943，28(2) :
114--138．
(责任编辑 范 娟
责任编委 康向阳)
42