全 文 ：文章编号:1000-0240(2006)02-0249-07
NO在两种圆柏属植物叶片抗冻过程
中的信号功能研究
　　收稿日期:2005-11-11;修订日期:2006-01-16
　　基金项目:国家自然科学基金项目(40301016;90302010);中国科学院“西部之光”项目;甘肃省自然科学基金项目(3ZS051-A25-067)资助
　　作者简介:陈银萍(1974—), 女 , 甘肃榆中人 , 讲师 , 2000年在甘肃农业大学获硕士学位 , 现为在读博士生 , 主要从事环境生物学研究.
E-mai l:yin pch@yahoo. com. cn
　　　　　　　*通讯联系人 , E-mai l:chentu o@ns. lzb. ac. cn , li zhean@l zu. edu . cn
陈银萍1 , 2 , 　张满效3 , 　陈　拓4* , 　张有福4 , 　安黎哲1 , 4*
(1. 兰州大学生命科学学院 , 甘肃兰州　730000;2. 兰州交通大学环境与市政工程学院 , 甘肃兰州　730070;3. 兰州石化
职业技术学院 , 甘肃兰州　730060;4. 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 , 甘肃 兰州　730000)
摘　要:通过测定自然降温过程中抗氧化系统 、 膜脂过氧化 、 NO 释放量 、 NO 合成酶(NOS)和硝酸还
原酶(NR)活性的季节变化 , 研究植物内源 NO 在圆柏属植物祁连圆柏(Sabina p rzewalskii)和圆柏
(Sabina chinensis)叶抗冻过程中的信号功能. 结果表明:随温度降低 , 过氧化氢酶(CAT)、 过氧化物酶
(POD)、 抗坏血酸氧化酶(APX)活性和谷胱甘肽(GSH)、 脯氨酸(P ro)、 类胡罗卜素(Car)含量增加并
在冬季达最大值 , NO 释放率 、 NOS 和 NR活性以及丙二醛(MDA)含量也显著增加并在 9 月和 2 月出
现两峰值;两树种叶中的抗氧化酶活性和抗氧化剂含量都与平均温度和 MDA 含量负相关 , 而且 NO 的
产生总是发生在抗氧化酶活性和抗氧化剂含量增加之前 , 表明抗氧化系统在清除氧自由基抑制膜脂过
氧化提高抗冻性方面具有重要作用 , NO 作为信号分子可能激活了抗氧化系统诱导植物抗冻性. 在抗
冻过程中 , 祁连圆柏叶的 NO 释放率 、 NOS 和 NR活性 、 抗氧化酶活性以及抗氧化剂含量都高于圆柏 ,
表明祁连圆柏具有较强的适应性策略.
关键词:圆柏属;常绿木本植物;NO;抗氧化系统;抗冷冻能力
中图分类号:Q946 文献标识码:A
　　NO是具有生物活性和信号转导作用的气体活
性分子 , 它不仅对植物的许多生命活动如种子萌
发[ 1] 、生长发育[ 2] 和衰老[ 3] 等具有直接的生理调节
功能 , 而且作为防御反应中的关键信使 , 参与了植
物对生物和非生物胁迫的响应如干旱胁迫[ 4] 、热胁
迫[ 5] 、盐胁迫[ 6] 、 UV - B 辐射[ 7] 、臭氧[ 8] 、重金
属[ 9] 、机械损伤[ 3] 以及植物抗病反应[ 2] . 然而关于
NO在植物抗冻过程中的信号功能尚不清楚 , 而且
有关 NO 与植物抗逆性的研究主要是通过外源 NO
供体 、NOS 抑制剂 、NO清除剂等在环境胁迫下对
植物生理指标的影响 , 分析 NO 在胁迫响应中的作
用机制 , 不一定符合植物体内的实际情况. 实际
上 , 许多植物自身能在其生存的自然环境下产生一
定的 NO[ 10] , 因此有必要将研究重心转到植物内源
NO与植物胁迫响应的关系上.
　　植物抗冻力的形成与环境低温诱导有
关[ 1 1 - 13] . 常绿木本植物叶片秋末经历冻融循环 , 度
过冬季 , 在翌年春季仍保持潜在的再生能力. 在青
藏高原(包括祁连山), 祁连圆柏(S abina przewal-
sk ii)分布于年均温 0. 5 ℃、海拔 2 600 ～ 4 000 m 的
高山地区 , 是研究植物抗冻性的理想材料;而圆柏
(S abina chinensis)主要分布于年均温 8. 5 ℃、海拔
500 ～ 1 900 m 的低山地区[ 14 - 15] . 本研究以圆柏属
这两种常绿木本植物为材料 , 从秋季到翌年春季 ,
期间包括冷锻炼(8 ～ 11月)、冻锻炼(12 ～ 翌年 1
月)和解冻锻炼(2 ～ 4月)3 个阶段. 通过测定自然
降温过程中抗氧化系统 、膜脂过氧化 、NO 释放量 、
NOS和 NR活性的季节变化 , 研究植物内源 NO在
圆柏属植物叶抗冻过程中的信号功能 , 有助于更好
地理解常绿木本植物叶片的抗冻性机制.
第 28 卷　第 2 期
2 0 0 6 年 4 月
冰　川　冻　土
JOU RNAL OF GLACIOLOGY AND GEOCRYOLOGY
Vol. 28　No. 2
Apr. 2 0 0 6
1　研究地区与方法
1. 1　自然概况
　　试验地位于兰州市东南 20 km 处的榆中县二
阴山区(103°50′～ 104°10′E , 35°38′～ 35°58′N),
海拔 1 900 m. 该区属高寒半湿润气候区 , 在研究
期间(2004 年 8 月至 2005 年 4 月)月平均气温为
4. 1 ℃, 月平均最高温度为 26. 5 ℃, 月平均最低温
度为 - 13. 9 ℃. 从 2004年 10月至翌年4月最低气
温在 0 ℃以下 , 土壤冻结(图 1). 年平均无霜期110
d , 年平均降水量 362 mm , 年平均空气相对湿度
59. 8%, 年平均日照时数 2 520 h.
图 1　2004 年 8 月至 2005 年 4月各月平均气温和最高 、
最低气温
Fig . 1　Seasona l va riations o f monthly mean air
tempera ture s , maximum and minimum tempera tur es
fr om August 2004 to April 2005
1. 2　材料
　　实验材料为生长良好的 5 a 生祁连圆柏和圆柏
实生苗鳞形叶. 自 2004年 8月到 2005年 4月 , 每
月的 22 日取一次叶样 , 每次取样时间为上午
10∶00 ～ 12∶00 , 以避免日温差影响. 将每种试验
苗木分为 3组(每组 30 株), 每组混合样作为一个
测定样品. 在田间采集苗木中间部位枝条上的针
叶 , 分组混匀后立即冷藏带回实验室 , 一部分迅速
测定 NO 释放率;另一部分用液 N 固定 , 置于超低
温冰箱( - 80 ℃)中保存待测其余指标.
1. 3　测定方法
　　参照 Murphy et al . [ 16] 的方法测定 NOS 活性
和 NO释放率 , 用 Wray et al . [ 17] 的方法测定 NR
活性 , Cakmak et al . [ 18] 的方法测定叶片 MDA 含
量 , Chance et al . [ 19] 的方法测定 POD活性 , Clair-
bo rne[ 20] 的方法测定 CA T 活性 , Gupta et al . [ 21] 的
方法测定 APX活性 , 考马斯亮蓝法[ 22] 测定蛋白质
含量 , G rif fi th[ 23] 的方法测定 GSH , A rnon[ 24] 的方
法测定 Car , Bates et al . [ 25] 的方法测定 Pro.
1. 4　统计分析
　　用S PSS 10. 0双变量相关性分析程序进行变量
间的相关性分析 , 独立样本 t检验程序分析同一阶
段两树种间差异.
2　结果与分析
2. 1　两种圆柏叶片 MDA含量的季节变化
　　随秋末气温下降 , 祁连圆柏和圆柏叶中 MDA
含量 9月比 8 月分别增加 23. 1%和 30. 2%, 然后
呈现明显下降趋势 , 12月达到最低值 , 此后随气温
的回升又有所增加(图 2). 这表明 , 叶在组织结冰
状况下 , 细胞内膜脂过氧化水平较低 , 其叶细胞的
越冬生存与其细胞控制膜脂过氧化作用 、维护细胞
膜完整性有关.
图 2　两树种叶中 MDA 含量季节变化
Fig . 2　Seasona l va riations in M DA content
in the leave s. Value s ar e mean ± SE
o f three replicates
2. 2　两种圆柏叶片抗氧化系统的季节变化
　　从 8 月到 9月 , 两树种叶片的 CA T 活性均表
现为下降;从 9月到 12月 , 祁连圆柏叶中 CAT 活
性呈线性增加趋势 , 而圆柏为波动增加 , 但二者均
在 12 月达最大值. 此后 , CA T 活性呈下降趋势 ,
但春季随气温回升又持续增强(图3a). 两树种叶片
的 POD活性从 8月开始持续增强 , 11月均达最大
值 , 1 月酶活性虽有所降低但仍然高于秋初观察
值;春季 POD活性先增强 , 然后降到秋初水平(图
3b). 从 8月到 10月 , APX活性相对稳定 , 11月增
强并达到一峰值 , 12月又降低 , 与 9 月观察值相
当;春季 , APX活性迅速增强 , 3月份出现了整个
观察期中的最大值(图 3c). 祁连圆柏叶中 GSH 含
量 8月开始持续增加并于 12 月达第一个峰值 , 而
圆柏叶中 GSH 含量在经历了 10月份的迅速增加
后于 11 月开始降低 , 但仍高于 8 、 9月的观察值;
250　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　冰　　　川　　　冻　　　土 　　28 卷　
春季 , 祁连圆柏叶中 GSH 含量再次迅速增加并于
3月达到整个观察期中的最大值 , 而圆柏叶中 GSH
含量略微增加 , 后又降低到 9 月的观察水平(图
3d). 与 GSH 相似 , Car和 Pro含量从 8月到 10月
显著增加 , 在整个冬季祁连圆柏 Ca r和 Pro 含量都
持续增加并于 12月达到一峰值 , 而圆柏 Car 和Pro
含量有所降低;春季 , 两树种叶中两种抗氧化剂含
量均增加并于 2月达到整个观察期中的最大值 , 此
后又明显回落(图 3e , f). 此外 , 从 8月到翌年 1月
随温度降低 , 两树种叶中的抗氧化酶活性和抗氧化
剂含量都与平均温度和 MDA 含量明显负相关(表
1).
2. 3　NOS活性 、NR活性和 NO释放率的季节变化
　　从图4可以看出 , 在冷锻炼初期的9月(温度
表 1　抗氧化系统与平均温度 、MAD 含量相关性分析
(2004. 8—2005. 1)
Table 1　Pea rson co rr elations between anti-oxidativ e sy stem
and mean temperature , between anti-oxidativ e sy stem and
lipid pe rox idation , from August 2004 to Janua ry 2005
温度
圆柏 祁连圆柏
MDA
圆柏 祁连圆柏
POD - 0. 487 - 0. 700 - 0. 388 - 0. 780
CAT - 0. 326 - 0. 242 - 0. 624 - 0. 724
APX - 0. 327 - 0. 774 - 0. 513 - 0. 634
GSH - 0. 142 - 0. 984** - 0. 220 - 0. 824*
Car - 0. 443 - 0. 894* - 0. 564 - 0. 854*
Pro - 0. 693 - 0. 954** - 0. 220 - 0. 827*
　　注:**P<0. 01;* P <0. 05.
图 3　两树种叶抗氧化系统的季节变化
Fig. 3　Seasonal v aria tions in anti-ox idative sy stem s in the leave s. Values a re mean
± SE o f three replicates
2512 期 陈银萍等:NO在两种圆柏属植物叶片抗冻过程中的信号功能研究 　
开始下降)和解冻锻炼初期的 2月(温度开始回升)
NOS 和 NR活性都分别达到一个峰值(图 4a , b).
祁连圆柏叶中 NOS活性和 NR活性从 8月到 9 月
分别增加 130. 4%和 40. 0%, 从 1月到 2月分别增
加 46. 1%和 16. 8%(p<0. 05);圆柏叶中 NOS 活
性和 NR活性从 8月到 9月分别增加 67. 7%和 30.
0%, 从1月到2月分别增加 15. 7%和 13. 3%(p<
0. 05);相应地祁连圆柏叶中 NO 释放率 9 月比 8
月 , 2月比 1月分别增加 9. 7%和 10. 7%, 而圆柏
叶中只增加 8. 0%和 6. 0%(p<0. 05)(图 4c).
图 4　两树种叶中 NOS 活性(a)、 NR活性(b)和
NO 释放率(c)的季节变化
Fig . 4　Seasonal va riations in activ itie s o f NOS (a),
NR(b) and the r ate o f NO release(c) in leaves.
Values are mean ± SE of three replicates
2. 4　两树种间差异性分析
　　根据秋冬气温变化过程中两树种叶抗氧化系统
的变化规律 , 可将其冷冻适应过程划分为 3个阶
段 , 即 8 ～ 9月的冷锻炼初期(平均气温和最低气温
都在0 ℃以上)、10 ～ 11月的冷锻炼期(平均最低气
温在 0 ℃以下 , 平均最高气温在 0 ℃以上)和 12至
翌年 1月的冰冻期(平均最低气温在 0 ℃以下 , 平
均最高气温接近 0 ℃). 表 2 为各阶段两树种间抗
冻性 、抗氧化系统和 NO释放的差异性分析 , 可以
看出 , 圆柏叶中 MDA 含量高于祁连圆柏 , 在冷锻
炼初期两树种间没有显著性差异(p>0. 05), 但经
历冷锻炼后在冰冻期表现为差异极显著(p <
0. 01). 圆柏叶中抗氧化酶活性 、抗氧化剂含量都
低于祁连圆柏 , 经历冷锻炼后在冰冻期两树种叶片
POD 和 APX 活性表现为差异显著(p <0. 05),
GSH 和 Pro 含量表现为差异极显著(p<0. 01). 在
整个测定期 , 祁连圆柏叶中 NO 释放率 、 NOS 和
NR活性都高于圆柏 , 冷锻炼初期的 NOS 活性在
两树种间表现为差异显著 , 而冷锻炼初期和冷锻炼
期的 NO 释放率和 NR活性均表现为差异极显著 ,
但两树种在冰冻期的 NO释放率 、NOS和 NR活性
均表现为差异不显著(表 2).
3　讨论与结论
　　植物体主要依靠抗氧化系统清除活性氧
(ROS)[ 26 -27] . 本研究中 , 两种圆柏属植物叶片抗冻
性均与抗氧化系统密切相关 , 如 POD , CAT 和
APX以及 GSH , Car 和 Pro 均在 ROS 的清除中发
挥重要作用. 冷锻炼初期 , 随温度降低抗氧化酶活
性降低 , 抗氧化剂含量没有明显增加 , 氧自由基积
累速率大于酶系统清除能力 , 导致膜脂过氧化 , 膜
系统受损. 之后叶片经过冷锻炼形成了较高的抗冻
性 , 初期氧自由基的增加被抗氧化酶活性的增强和
抗氧化剂含量的增加阻止. 冰冻期 , MDA 含量维
持稳定表明 ROS 没有积累 , 而抗氧化酶活性和抗
氧化剂含量有所降低 , 表明二者现有水平已足以调
节控制 ROS 水平 , 保持叶片抗冻性. 春季 , MDA
含量 、抗氧化酶活性和抗氧化剂含量均先轻微增加
后降低 , 这与秋季观察结果相似 , 两个时期都发生
了冻融循环 , 该循环诱导了叶片的冷锻炼和解冻过
程[ 2 8] .
　　NO 信号分子参与了植物对多种环境胁迫的响
应[ 3 , 6 -9] 以及植物抗病反应[ 2] . 环境胁迫中积累的
NO 能清除氧自由基和脂质自由基 , 阻止由 ROS引
起的氧化胁迫 , 并能诱导抗氧化酶的表达[ 4] . 在渗
透胁迫下 , 外源 NO 能促进过氧化氢酶(CA T)、抗
坏血酸过氧化物酶(APX)活性的上升和脯氨酸含
252　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　冰　　　川　　　冻　　　土 　　28 卷　
表 2　冷锻炼初期 、冷锻炼期和冰冻期两树种间差异性分析
Table 2　Dif fe rences be tween two tree specie s during ea rly cold acclima tion , co ld acclimation and freezing stages
冷锻炼初期(8～ 9月)
祁连圆柏 圆柏 t - tes t
冷锻炼期(10～ 11月)
祁连圆柏 圆柏 t - test
冰冻期(12～ 翌年 1月)
祁连圆柏 圆柏 t - test
M DA 4. 82±0. 55 5. 26±0. 76 p=0. 277 3. 67±0. 49 4. 10±0. 33 p=0. 022 3. 29±0. 37 3. 69±0. 28 p=0. 002
CAT 0. 12±0. 02 0. 09±0. 02 p=0. 010 0. 13±0. 01 0. 09±0. 02 p=0. 003 0. 13±0. 02 0. 12±0. 03 p=0. 324
POD 20. 99±3. 25 14. 41±7. 42 p=0. 088 57. 50±7. 21 52. 40±3. 17 p=0. 158 46. 98±12. 25 30. 02±4. 35 p=0. 018
APX 0. 29±0. 48 0. 29±0. 04 p=0. 996 0. 36±0. 11 0. 34±0. 07 p=0. 654 0. 37±0. 05 0. 30±0. 04 p=0. 037
GSH 0. 19±0. 02 0. 16±0. 02 p=0. 273 0. 32±0. 04 0. 23±0. 04 p=0. 005 0. 39±0. 03 0. 18±0. 01 p=0. 000
Car 0. 15±0. 01 0. 15±0. 02 p=0. 713 0. 29±0. 02 0. 27±0. 03 p=0. 432 0. 31±0. 07 0. 22±0. 01 p=0. 177
Pro 0. 17±0. 05 0. 16±0. 04 p=0. 851 0. 65±0. 08 0. 25±0. 03 p=0. 000 0. 74±0. 14 0. 26±0. 05 p=0. 001
NOS 24. 2±10. 72 12. 84±3. 72 p=0. 048 17. 17±2. 39 15. 13±2. 04 p=0. 144 14. 52±1. 98 12. 71±1. 07 p=0. 078
NR 5. 46±0. 49 3. 91±0. 70 p=0. 000 5. 20±0. 24 4. 17±0. 48 p=0. 001 4. 88±0. 15 4. 15±0. 65 p=0. 053
NO 0. 16±0. 01 0. 15±0. 01 p=0. 261 0. 16±0. 01 0. 15±0. 01 p=0. 003 0. 15±0. 01 0. 15±0. 01 p=0. 241
量的积累 , 抑制脂氧合酶(LOX)的活性 , 提高种子
萌发过程中的抗氧化能力[ 29] . 在 UV - B辐射下的
玉米中胚轴生长过程中 , NO 可能既作为第二信使
又作为一种抗氧化剂起作用[ 30] . 为阐明NO 在低温
冷冻胁迫中的作用 , 本研究测定了低温冷冻过程中
两种圆柏属植物叶中 NO 释放率 、 NOS 和 NR 活
性. 结果表明 , 在低温冷冻过程中两种圆柏属植物
叶中 NO 的积累与抗氧化系统密切相关 , 当温度在
秋季和春季开始降低和升高时 , NO 合成的关键酶
NOS 和 NR活性迅速增强 , NO 释放率也相应地
达到两个峰值. 之后在冰冻期 , NO 释放率 、 NOS
和 NR活性都维持较低值. 值得注意的是在 9月和
2月 ROS和 NO 同时积累 , 之后抗氧化系统被启
动 , 抗氧化酶活性和抗氧化剂含量迅速增加 , 植物
抗冻性增强. 这表明 , 秋季和春季的冻融循环导致
叶中 ROS 积累(MDA 含量增加), 发生氧化胁迫 ,
叶片细胞膜完整性丧失 , 同时在冻融循环过程中叶
中 NOS 和 NR活性增强 , NO大量释放. 作为信号
分子 , NO 诱导了抗氧化酶的表达和抗氧化剂的积
累 , 使初期 ROS积累受阻(MDA 含量降低), 叶片
抗冻性增强.
　　综上所述 , 在低温冷冻条件下 , 两树种叶中
NO大量合成 , 诱导抗氧化酶活性增强和抗氧化剂
积累 , 及时清除氧自由基防止膜脂过氧化 , 是维持
细胞膜完整性 、保证其安全越冬的重要生理反应.
两树种间存在差异 , 祁连圆柏叶中 NO 释放 、抗氧
化酶活性和抗氧化剂积累都高于圆柏 , 而 MDA 低
于圆柏. 与圆柏相比 , 冻融循环过程中祁连圆柏叶
中大量释放的 NO激活了抗氧化系统 , 诱导了抗氧
化酶的表达和抗氧化剂的积累 , 结果在冰冻期祁连
圆柏叶中 CAT 、 POD 、 APX 活性和 GSH 、Car 、
Pro 含量都高于圆柏 , 相反 , MDA 含量低于圆柏.
此外 , 在冷锻炼初期 , 两树种间没有显著性差异 ,
但经历冷锻炼后在冰冻期二者差异显著. 这表明 ,
祁连圆柏在抗冻性诱导中具有更广泛的适应性策
略 , 比圆柏表现为较强的抗冻性 , 这与其自然生存
环境条件相一致.
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254　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　冰　　　川　　　冻　　　土 　　28 卷　
Signal Functions of Nitric Oxide in the Freezing Resistance
in the Leaves of Evergreen Woody Plants of Sabina
CHEN Yin-ping1 , 2 , 　ZHANG Man-xiao3 , 　CHEN Tuo4* ,
ZHANG You-fu4 , 　AN Li-zhe1 , 4*
(1. School o f Li f e Science , Lanzhou Universi ty , Lanzhou Gansu 730000 , China;2 School o f Environmenta l and Municipa l Eng ineering ,
Lanzhou J iaotong Universi ty , Lanzhou Gansu 730070 , China;3 Lanzhou Petrochemica l Col leg e o f Tech no logy ,
Lanzhou Gansu 730060 , Ch ina;4. Cold and Ar id Reg ions Environmenta l an d Eng ineering Research Inst itute ,
Ch inese Acad emy o f S ciences , Lanzhou Gansu 730000 , Ch ina)
Abstract:The seasonal changes of anti-oxidative
sy stems , lipid peroxidation , apparent NO-release ,
activi ties of NO synthase (NOS) and nit rate reduc-
tase (NR) in the leaves o f S abina przewalski i
(SP) and Sabina chinensis (SC)were investig ated
to understand the ro le o f endogenous NO , as a sig-
nal mo lecule in f reezing to lerance of evergreen
w oody plants. The re sul ts show ed tha t act ivities o f
CA T , POD and APX , contents o f GSH , Pro and
Ca r increase w ith temperature decrease , and the
maxima appear in the w inter. MDA content , the
rate of NO release , NOS and N R activi ty increase
markedly and reach tw o peaks in September and
February , respectively . M eanwhile , w ith mean
temperature decreasing f rom August to January ,
the co rrelat ions betw een the activit ies o f POD ,
CA T , APX and contents o f GSH , Car and Pro and
the mean tempe rature and MDA content in the
both species become negative. Furthermo re , NO
generation is alw ays found before increasing of an-
t i-oxidative enzyme activi ty and antio xidant con-
tent , indicating that the anti-oxidative systems
play an impo rtant role in potentiat ing f reezing - re-
sistance o f the plant and limit ing the production of
f ree radicals to pro tect membrane integ ri ty . NO as
an early signal mo lecule is able to induce the f reez-
ing tolerance by activat ing the ant i-oxidative sys-
tem involved in bo th anti-ox idative enzyme and an-
t ioxidant . On the o ther hand , SP show s a prevai l-
ing st rategy in signal function o f NO and has high-
er anti - oxidative enzyme activi ty and antio xidant
content than SC in o rder to develop the tolerance to
f reezing.
Key words:S abina;evergreen w oody plants;nit ric o xide;anti-oxida tive sy stem;f reezing to lerance
2552 期 陈银萍等:NO在两种圆柏属植物叶片抗冻过程中的信号功能研究