全 文 ：祁连圆柏对人胃癌细胞 SGC-7901细胞
周期和凋亡影响的实验研究
王索安1　陈增良1　徐　涛2　杜　蓬1　陶　锋1 　王　玮1　仇　容1　沈　健1
(1浙江医学高等专科学校·杭州 310053　2浙江理工大学生命科学院·杭州 310000)
摘　要　目的:探讨祁连圆柏体外对人胃癌细胞 SGC-7901 细胞周期和凋亡的影响。方法:采用MTT显
色法 ,检测不同浓度祁连圆柏醇提物作用不同时间后对 SGC-7901 细胞增殖的影响;光镜观察凋亡细胞
的形态特点;流式细胞术(FCM)检测其诱导细胞凋亡的细胞周期阻滞点;免疫组化 SP法检测 SGC-7901
细胞增殖核抗原 PCNA表达及凋亡相关基因蛋白 P53 、Fas表达。结果:祁连圆柏对 SGC-7901细胞增殖有
明显的抑制作用 ,并使 G2/M 期细胞增多 , G0/G1 期细胞减少。 20μg/ml用药 24 小时在 G1 期细胞前出现
亚二倍体峰 ,既“凋亡峰”出现。药物组细胞 PCNA 表达明显低于空白组 , Fas表达明显升高 , 而 P53在诱导
前后均无表达。结论:祁连圆柏可抑制 SGC-7901 细胞增殖及侵袭性并可通过诱导该细胞系凋亡发挥抗
肿瘤作用 ,以上作用均有剂量和时间依赖性;Fas 基因激活和 G2 M 期阻滞可能是诱导人胃癌细胞 SGC-
7901细胞凋亡的主要机制。
主题词　胃肿瘤 中医药疗法　祁连圆柏 治疗应用　细胞凋亡　体外研究
　　胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤 ,其发病率和死亡率目
前居我国恶性肿瘤的首位 ,除手术和放疗外 , 化疗仍是进展
期胃癌治疗的主要手段。而化疗中药物出现的严重的毒副
作用及耐药性已成为目前临床治疗中的难题之一 ,因此寻找
毒副作用小 、药源广泛 、价格低廉 、抗肿瘤作用明显的天然药
物是当今抗肿瘤药物发展的方向。祁连圆柏(Juniperus prze-
walskii)系柏科植物 ,是常用中藏药 , 笔者在抗肿瘤药物筛选
时发现该药对人胃癌 SGC-7901 细胞有明显的增殖抑制和
诱导凋亡作用 ,现报道如下。
1　材料与方法
1.1　细胞株　人胃癌 SGC-7901 细胞株:购自上海细胞生
物所。
1.2　试剂 、仪器与药品　RPMI-1640 培养液:Sigma公司产
品 ,用前加双抗 、青霉素(100U/ml ,)、链霉素(100μg/ml);小牛
血清:杭州四季青生物工程公司产品 , 56℃水浴 , -20℃保
存;0.25%胰酶 、0.02%EDTA、Hanks 液 、3.7%NaHCO3 等试
剂:自配。 CO2 培养箱:NATURE , USA;CKX 倒置相差显微镜:
Olympus , Japan。祁连圆柏:青海大学医学院藏医系惠赠 , 采
用水提醇沉法提取 ,减压浓缩 、冷冻干燥成粉末状 ,同时以少
量二甲亚砜溶解 ,再用双蒸水稀释成 20mg ml的原液。
1.3　细胞培养　(1)细胞复苏:将冻存在离心管内的 SGC-
7901细胞用 37℃水浴解冻。 吸出细胞悬液 , 装入另一支离
心管中 , 加入含 15%小牛血清的 1640 培养液(pH7.2), 吹打
混匀后离心(1000r min , 5 分钟), 吸去冻存液。(2)细胞培养:
复苏细胞加入含 15%小牛血清的 1640 培养液充分混匀 , 使
其浓度为 5×104 个 ml , 接种于培养瓶中。置孵箱内(37℃,
5%CO2)培养。(3)细胞转代:倒置显微镜下观察培养瓶内细
胞长满单层后弃掉培养液。加入适量 0.25%胰酶液(覆盖瓶
底), 置 37℃环境中消化 1 ～ 2分钟。倒置显微镜下观察到细
胞收缩并出现裂隙后终止胰酶反应。加入适量的 Hanks 液
轻轻洗一遍后加入含 15%小牛血清的 1640 液 5ml吹打制成
细胞悬液 , 按 5×104 个 ml浓度接种培养。
1.4　细胞增殖抑制试验　MTT还原法。
1.5　细胞形态的观察　(1)培养瓶中接种 1×106 个细胞 ,培
养 24 小时 ,生长良好者 , 用不同浓度(1.0 、5.0、10 、20μg ml)祁
连圆柏分别处理 24、48、72 小时 ,每 12 小时用倒置显微镜观
察并照相记录用药组和对照组细胞的形态变化。(2)细胞爬
片 HE 染色下细胞形态的观察:用 6 孔培养板接种 1×106 个
细胞 ,培养 24 小时 , 观察生长良好 , 不同浓度不同时间各组
分做 6 个复孔 ,其余处理同“1.3” 。
1.6　凋亡细胞周期及凋亡率的检测　采用 FACSVantage流
式细胞仪进行细胞周期分析 , 检测计算细胞亚二倍体的百分
率。计算细胞增殖指数(PI)。 细胞增殖指数(PI)=
G2 M+S
G0 G1+G2 M+S
1.7　增殖细胞核抗原(PCNA)及凋亡相关基因蛋白 P53 、Fas
检测　免疫组化 SP法。免疫组化结果用 NYD-1000型图像
分析仪处理 , 随机选取 10 个高倍视野的肿瘤细胞共 1000
个 ,计算每 100个细胞中的阳性细胞数 ,亦即阳性表达指数
(Positive Index , PI)。
1.8　统计分析　实验数据用( x±s)表示 , 采用方差分析 ,两
两比较采用 Dunnett-t 检验。应用 SPSS13.0 统计软件包进
行分析。
2　结果
2.1　细胞增殖的 MTT 法检测结果　MTT 法检测结果表明 ,
祁连圆柏在体外可明显抑制人胃癌细胞株(SGC-7901)细胞
·208· 中国中医药科技 2010 年 5月第 17卷第 3 期 May 2010 Vol.17 No.3
的增殖 ,以 10μg/ml以上浓度作用更为明显 , 且呈现明显的
剂量依赖性和作用时间的特点 ,见表 1。
表 1 祁连圆柏对胃癌细胞株 SGC-7901
细胞增殖的影响(x±s , %, n=6)
组别　　 细胞增殖抑制率(%)
24h 48h 72h
1.0μg ml 2.1±0.2 4.9±0.4 6.4±0.6
5.0μg ml 13.6±1.4＊＊ 17.6±2.3＊＊ 21.3±3.1＊＊
10μg ml 24.9±3.3＊＊ 42.3±6.1＊＊ 55.3±8.1＊＊
20μg ml 39.1±4.5＊＊ 68.6±8.9＊＊ 86.6±8.6＊＊
　　与 1.0μg ml处理组比较＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
2.2　细胞的形态学观察
空白对照组SGC-7901 细胞 4 ～ 6 小时贴壁 , 24 小时增
殖旺盛 , 48 小时细胞呈高棱柱形 、排列呈串珠样生长 , 72 小
时细胞长成致密单层。
实验组 SGC-7901 细胞加药诱导 24小时后见有少数细
胞皱缩 、变圆变小 ,胞质内出现颗粒 , 细胞膜完整;48 小时后
此类细胞进一步增多 , 部分细胞呈圆形 ,细胞核与胞质分辨
不清 ,细胞间隙增大 , 细胞数目减少;72 小时后可见细胞呈
集落生长特性明显降低 , 细胞多呈单个生长状态 , 细胞数目
已显著减少 ,少量细胞脱落而悬浮于培养液中 ,大部分细胞
裂解成圆形小体 ,另有部分细胞体积增大 , 呈圆形或椭圆形 ,
细胞内见颗粒出现。
实验组在 24、48 、72 小时后做细胞爬片 HE 染色 ,可见一
些细胞皱缩 ,核染色质浓缩深染并向核膜聚集 ,核碎裂 , 胞浆
呈伊红着色的典型的凋亡细胞形态 ,少量细胞呈溶解坏死状
态。
2.3　细胞凋亡周期及凋亡率　见图 1 及表 2～ 3。
人SGC-7901细胞经该药诱导后在 FCM 检测的含量图
中 ,在G1 期细胞前出现亚二倍体峰 , 既凋亡峰(图 1), 表明
细胞 DNA 降解 ,渗漏导致 DNA 染色能力下降。凋亡峰随祁
连圆柏剂量加大作用时间的延长而增高。
图 1　实验组 FCM 分析结果(经祁连圆柏 20μg ml 24小时处理)
表 2 20μg/ml祁连圆柏对 SGC-7901细胞周期的影响(x±s , n=6)
组别
细胞周期(%)
G0 G1 　　 S　　　 G2 M　　　
PI
空白组 77.31±9.12 20.30±1.93 2.39±1.13 0.2569
24h 72.23±8.60 21.27±3.65 6.50±1.61＊＊ 0.2777
祁连圆柏组 48h 68.45±7.33 24.40±3.71 7.15±1.83＊＊ 0.3155
72h 59.51±6.10＊＊ 21.01±3.50 19.40±2.17＊＊ 0.4041
　　与空白组比较＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
表 3 祁连圆柏作用不同时间对人 SGC-7901
细胞凋亡诱导率的影响(x±s , %, n=6)
组别 24h　　　 48h　　　 72h　　
空白组 1.39±0.41 1.98±0.51 2.31±0.47
10μg ml 3.72±0.56＊＊ 7.69±1.63＊＊ 18.56±1.33＊＊
20μg ml 7.34±0.71＊＊ 13.52±1.90＊＊ 23.67±2.49＊＊
　　与空白组比较＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
2.4　PCNA、Fas 、P53免疫组织化学检测结果　见表 4。
PCNA阳性信号位于核内 , 呈棕黄色。Fas的阳性反应主
要定位在细胞膜 , 少量在浆内表达。 P53在诱导前后空白对
照组与用药组均无表达。
表 4 祁连圆柏对 PCNA 、Fas蛋白表达影响(x±s , n=6)
组别
FCNA 阳性表达指数(%) Fas阳性表达指数(%)
　　24h 　　48h 　　24h 　　48h
空白组 81.26±3.81 87.31±4.11 11.69±1.13 15.12±1.98
10μg ml 63.13±3.45＊＊ 58.16±3.56＊＊ 15.31±2.17＊ 24.61±4.23＊＊
20μg ml 52.72±3.67＊＊ 49.20±3.23＊＊ 20.94±3.10＊＊ 28.26±4.69＊＊
　　与空白组比较＊P<0.05 , ＊＊P<0.01
3　讨论
祁连圆柏(Juniperus przewalskii)系柏科植物 , 是常用中藏
药 ,具有止血镇咳之功效 , 临床上主要用于治疗咳血 、吐血 、
尿血 、便血及子宫出血等病症[ 3] 。 2000 年宗玉英等对 110种
植物藏药进行了体外筛选实验 , 发现 5 种中藏药对人乳腺
癌 、肺癌 、口腔上皮癌具有杀伤作用 , 但抗肿瘤机制不明 , 祁
连圆柏是其 5 种之一[ 4] 。本实验采用 MTT法检测不同时间
和浓度的祁连圆柏对体外培养人胃癌 SGC-7901 细胞生长
的影响 , 结果表明 ,祁连圆柏醇提物对人 SGC-7901 细胞增
殖的抑制作用不仅呈剂量-效应关系 , 而且呈时间-效应关
系 ,即具有明显的浓度和时间的依赖性。
近几年 , PCNA被证实是一中很好的判断肿瘤细胞增殖
活性与肿瘤的浸润 、转移和预后的标记[ 5] 。增殖细胞核抗原
PCNA 是存在于细胞核内的一中酸性蛋白质 , 是 DNA 聚合酶
的辅酶之一 , 参与 DNA 合成并在细胞周期中起着重要的调
控作用 ,其量的变化能较好地反映细胞的增殖状态 , 临床病
理资料显示 PCNA指数升高 , 提示增殖活性高的恶性瘤细胞
其侵袭性强 , 进展迅速 ,易发生转移 , 其本质与恶性生物学行
为有关[5 ,6] 。本实验免疫组化结果显示 , 用药组 PCNA 表达
明显降低 ,该效应呈现剂量和时间依赖性 , 结合流式细胞仪
检测 ,经该药诱导后人SGC-7901 细胞在 PI荧光直方图中 ,
凋亡细胞在 G1/G0 , 前出现亚二倍体峰 , 即凋亡峰。结果表
明祁连圆柏能抑制人胃癌 SGC-7901 细胞增殖及侵袭性 ,并
可通过诱导该细胞系凋亡杀伤癌细胞。
肿瘤细胞无限增殖是因为监测细胞内基因缺陷的检测
点功能丧失及细胞周期紊乱 , 因此细胞周期在肿瘤细胞的生
长调控中具有重要作用[ 7 , 8] 。通过改变细胞周期来阻止肿瘤
细胞的无限增殖已受到学者们的关注 , 一般认为细胞周期的
调节主要发生在两个重要的转变期:G1 ～ S 期和 G2 ～ M
期[8] 。G2 ～ M 期是细胞周期进程中的关键检查点 , 这个检查
点是由 Cdc2(CDK1)和 cyclin B组成 , 细胞从G2 期进入M 期 ,
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去磷酸化酶 Cdc25激活。 Cdc2 去磷酸化而活化 ,细胞顺利进
入M期 。当出现 DNA 损伤或错配[9] , 细胞启动信号通路抑
制 Cdc2活化 , 其主要通路是 CHK激酶使 Cdc25 磷酸化失活 ,
从而抑制Cdc2 活化 ,使细胞不能进入M期 , 而是进行细胞修
复或细胞凋亡。本实验细胞周期分析显示与对照组比较 , 经
祁连圆柏 20μg/ml处理的 SGC-7901 细胞 24、48、72 小时可
见G2/M期细胞比例逐渐增多 , G0/G1 期细胞比例减少 , S 期
细胞比例变化不大 ,细胞增殖指数 PI 值呈递增趋势 ,结果提
示G2/M 期阻滞是祁连圆柏抑制 SGC-7901 细胞增殖及诱
导其凋亡的作用机制之一 ,并为与其它细胞周期阻滞药(作
用于其它细胞周期)联合应用提供实验依据。
上调肿瘤细胞的 Fas 蛋白表达水平可恢复对机体免疫
监督系统Fas 介导的杀伤肿瘤细胞的敏感性。 Fas 蛋白是属
于肿瘤坏死因子受体家族细胞表面“死亡受体” , 为 I型跨膜
糖蛋白 ,死亡受体 Fas接受死亡因子 Fas配体所传导的死亡
信号 , 并激活 caspase 家族而诱发细胞凋亡[ 10] , 实验结果表
明 ,用药组 Fas 蛋白阳性表达和凋亡百分率值均显著高于对
照组 ,提示祁连圆柏可能通过上调 SGC-7901 细胞的 Fas 蛋
白表达水平增强 Fas 介导的死亡信号的传导并诱导肿瘤细
胞进入凋亡。
参考文献
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9　Brown J W , Prieto LM , Perez-Stable C, et al.3 , Estrogen and progester-
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10　Green DR.Apoptotic pathways:tenminutes to dead.Cel l ,2005 , 121(5):
671.
(收稿:2009-04-24)
阿胶黄芪口服液治疗围绝经期综合征 86例疗效观察
耿彩霞　于新巧　赵纪刚
(河北省临城县中医院·临城 054300)
　　1　临床资料
1.1　一般资料　120例均为 2009-02～ 2009-10本院妇科门诊及住
院患者 ,分为两组。治疗组 86例 ,平均年龄 49.92岁;病程 3个月 ～ 1
年 18例, 1～ 2年 30例 ,5～ 8年 12例。对照组 34例 ,平均年龄 48.89
岁;病程 3个月 ～ 1年 6例 ,1～ 2年 13例 , 5～ 8年 5例。 2组病例一
般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2　病例选择标准　符合《妇产科学》[ 1] 围绝经期综合征的诊断标
准和《中医妇科学》 [2]绝经前后诸症的诊断标准;年龄 40～ 60 岁;排
除卵巢及其他器质性病变。
2　治疗方法
治疗组:予阿胶黄芪口服液(河北君临药业有限公司生产 , 批
号:20090901)每次 2支,每天 2次口服。对照组:更年康片(广州白云
山和记黄埔中药有限公司生产 ,批号:B9D001)每次 4片 ,每天 3次。
2组均 1个月为 1个疗程 ,3个疗程后观察统计疗效。
3　结果
3.1　　疗效标准　根据《中医病证诊断疗效标准》 [ 3] 评定疗效。
3.2　结果　见表 1。
表 1 两组疗效比较[ n(%)]
组别 n 近期痊愈 显效 有效 无效 愈显率(%)总有效率(%)
治疗组 86 16(18.60) 34(39.53) 26(30.25) 10(11.63) 58.13＊ 88.37　
对照组 34 4(11.77) 7(20.59) 17(50.0) 6(17.64) 32.36　 82.38　
　　χ2 检验;与对照组比较＊P<0.05
4　讨论
围绝经期综合征属中医“绝经前后诸症” , 为常见病 、多发病 ,为
体内代谢紊乱所致又与外界各种不良刺激有关。辨证以肾阴虚 、肾
阳虚为纲。根据肾为先天之本 ,脾胃为后天之本 ,先天生后天 ,后天
养先天 ,成形始于精 ,养形在水谷的理论 ,可知先天之本之肾中精气
有赖于后天之本之脾所运化的水谷精微的培育充养 ,才能不断充盈
与成熟 ,且脾虚 、肾虚是逐渐加重且相互影响的病理过程 , 脾虚失运
化 ,气血生化不足 , 机体失去营养而加重围绝经期的症状 ,中医认
为 ,围绝经期综合征主要是女性在围绝经期生理功能衰退 ,乃肾虚 、
脾虚所致。女性在围绝经期肾虚天癸渐竭 ,冲任两脉虚损 ,气血不
足 ,脾虚失运而引起一系列症状。故选择了健脾补肾 、益气补血的
阿胶黄芪口服液进行治疗。 方中大枣 、砂仁健脾;枸杞子、仙茅补
肾;黄芪益气;阿胶补血。该方药少力专 、组方严谨 ,使脾肾得补 ,气
血得养 ,冲任得固 ,标本兼治 ,从而达到驱除诸症的目的。 本研究结
果显示 , 应用阿胶黄芪口服液治疗围绝经期综合征疗效确切 ,值得
在临床上推广。
　　参考文献
1　乐杰.妇产科学.第 5版 ,北京:人民卫生出版社 ,2002:382.
2　马宝璋.中医妇科学.第 6版 ,上海:上海科学技术出版社 , 2002:
104.
3　国家中医药管理局.中医病证诊断疗效标准.南京:南京大学出
版社 , 1994:66. (修回:2009-10-18)
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