全 文 ：石楠抗寒基因 AmGS高效转化体系的研究
刘　静 1 ,王长宪1 ,王　斌 2 , 孙仲序 3 ,刘　杰 4 ,黄艳艳1 ,赵进红1 ,张　虹 1
(1泰安市泰山林业科学研究院 ,泰安 271000;2.中国科学院遗传与发育生物学研究所 ,北京 10010;
3.山东农业大学园艺学院 ,泰安 271018;4青岛科技大学生物系 ,青岛 266042)
摘要:本研究以石楠为受体材料 ,利用农杆菌浸染方法开展沙冬青抗寒基因 AmGS转化试验 ,通过对不同的受体
材料浸染部位 、菌液浓度 、乙酰丁香酮和浸染时间对转化材料的死亡率%、分化率%、分化芽数(个)、芽苗长度
(cm)以及芽苗颜色的分析 ,得出最佳转化方法为:采用茎尖为转化材料 , 菌液浓度为 2/3 ～ 1/2原液 , 浸染时间
为 10min,添加乙酰丁香酮浓度为 25～ 30 mg/L。其中浸染部位是影响基因高效转化的最主要因素 , 菌液浓度 、
乙酰丁香酮和浸染时间的作用次之 ,经在 50 mg/L浓度的卡那霉素培养基筛选培养 , 获得一批的抗性植株 , 经
PCR检测获得 6株转化株系。
关键词:石楠 农杆菌浸染 抗寒基因 AmGS高效转化
中图分类号:S685.12文献标志码:A文章编号:1000-2324(2009)-02-0191-04
收稿日期:2008-06-19
基金项目:吉林省科技厅资助项目(200705C05);通化师范学院自然科学基金资助项目(XS070077)
作者简介:刘　静(1958-), 女 ,研究员 , 主要从事林果茶栽培与育种技术研究。
STUDYONTHEHIGHLYEFFECTIVETRANSFORMATIONSYSTEMOFCOLD-TOLERANT
GENEAMGSTRANSFORMEDINTOCHINESEPHOTINIA
LIUJing1 , WANGChang-xian1 , WANGBin2 , SUNZhong-xu3 , LIUJie4
HUANGYan-yan1 , ZHAOJin-hong1 , ZHANGHong1
(1.TaishaninstituteofForestryScience, Taian271000, China;2.InstituteofGeneticsandDevelopmentalBiology, ChineseAcademyofScience,
Beijing100101, China;3.HorticulturalColegeofShandongAgriculturalUniversity271018, China;4.QingdaoUniversityofScience
andTechnology, Qingdao266042, China)
Abstract:BymeansofAgrobacteriumcontamination, cold-tolerantgeneAmGs, absorbedformAmmopiptan-
thusmongolicus, wastransformedintoChinesephotinia.Wemadeaninvestigationwhatdiferentcontamination
position, Agrobacteriumconcentration, acetosyringoneandcontaminationtimeoftheacceptormaterialafected
thetransformantdeathrate, diferentiationrate, numberofdiferentialbuds, budslengthandbudscolor.Then
wegotthebesttransformationmethodthatAgrobacteriumwas2/3to1/2 asdenseasoriginalliquid, acceptors
werecontaminatedfor15 minutesandacetosyringonewas25 mg/Lto30 mg/Lwhenstemapexesweretrans-
formed.Contaminationpositionwasthemajorfactorofefectsonthegeneadvancedtransformation.Theefects
ofbacterialconcentrationandcontaminationtimewereminorfactors.Agroupresistantplantsweneobtained
throughwiththeoulturemediumcontains50mg/Lkanamycin, thensixtransferplantscanhegotbyPCRexami-
nation.
Keywords:Chinesephotinia;Agrobacteriumcontamination;cold-tolerantgeneAmGS;highlyefectivetransfor-
mation
1 材料与方法
1.1 材料与来源
1.1.1 转化受体材料 石楠试管苗来自泰山林科院生物技术中心。
1.1.2 转化目的基因 用来转化的抗寒基因 AmGS是中国科学院遗传发育所王斌研究员实验室与山东
林科院泰山分院合作 ,采用分子克隆方法(cDNA-AFLP和 RACE)从内蒙古严寒沙漠中的常绿抗寒木本
山东农业大学学报 (自然科学版), 2009, 40 (2):191-194JournalofShandongAgriculturalUniversity(NaturalScience)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
植物沙冬青中克隆出来的国内外第一个木本植物抗冻肽调节基因 ,用来转化的抗寒基因 AmGS菌液由王
斌老师提供 。载体的构建见图 1。
图 1 植物表达载体 pCAMBIA2300-AmGS构建图
Fig.1 ConstructionofplantexpressionvectorofpCAMBIA2300-AmGS
1.2 方法
1.2.1 菌液培养 ①预培养 。剪取建立良好再生体系的幼苗茎段 ,去掉所有的叶子 ,保留茎段长度大约
为 1.5 ～ 3 cm,将其平铺在分化培养基(配方为:MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L)上预培养 6d。
用 YEP培养基每 100mL加入 500μL～ 1mL菌液配成菌原液 ,放入震荡培养箱中在 28℃180r/min摇菌 。
1.2.2 浸染 侵染设计采用正交实验方法 , 4因素 3水平 ,见表 1。
表 1 正交试验设计方案 L9(34)
Table1 DesignplanoforthogonalexperimentL9(34)
因素 Factors 浸染部位Contaminationposition
菌液浓度(%)
Bacterialconcentration
乙酰丁香酮(AS)
Acetosyringone(mg/L)
浸染时间(min)
Contaminationtime
水平 Levels 1 茎段 2/3浓度 20 10
2 茎尖 1/2浓度 25 15
3 愈伤组织 原液 30 20
1.2.3 筛选与调查 将浸染的茎段接入培养基 ,共培养 2 d后 ,转入含不同浓度卡那霉素的培养基
内进行筛选培养 , 60 d后调查记录死亡率%、分化率%、分化芽数(个)、芽苗长度(cm)以及芽苗颜色 。
1.2.4 PCR分子检测 反应体系。以质粒 DNA作为阳性对照 ,以未经转化的石楠组培苗作为阴性对
照 ,对转化再生苗 DNA进行 PCR扩增检测 。根据所提供的 AmGS基因的序列资料 ,设计了一对引物 。引
物 1:5-TCATGGCACCTGATATCACCACCGCT-3;引物 2:5-TATTAGGCAGCGGATGGGGCGGGAA-3
;采用 ddH2O(38.5 μL);Bufer(6 μL);Dntp(2 μL);Primer1(1 μL);Primer2(1 μL);TemplateDNA(1
μL);TaqE(0.5 μL);Total(50μL)反应体系。反应程序 。预变性 , 94 ℃, 5 min;变性 , 94 ℃, 30 sec;复性 ,
55 ℃, 40 sec;扩增 , 72 ℃, 1min, 30 cycle;延伸 , 72 ℃, 10min;
2 结果与分析
2.1 不同转化方法对转基因植株茎段再生的影响
浸染后在含 50 mg/L的 Kam选择性培养基上 ,转化植株的茎段能够正常生长并且在切口处长出大量
的绿色小芽点后形成不定芽 ,而对照苗的茎段则变黄 、变枯死亡 。经初筛和连续两次继代筛选培养 60 d
进行调查 ,结果见表 2。
·192· 山东农业大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 40卷
表 2 石楠转化后卡那筛选受体材料分化情况
Table2 AcceptorsdifferentiationofgeneticalymodifiedChinesephotiniascreenedbykanamycin
组合
Combinations
死亡率(%)
Deathrate
分化率(%)
Diferentiation
rate
分化芽数(个)
Numberof
diferentiation
buds
芽苗长度(cm)
Budslength
芽苗颜色
Budscolor
1 6.25 93.75 2.63 0.50 2.38
2 0.00 93.75 2.13 0.58 1.75
3 100 0.00 0.00 0.00 0.00
4 0.00 100.00 2.44 0.45 2.44
5 6.00 94.00 3.38 1.05 2.63
6 6.25 83.33 1.31 0.29 1.56
7 100.00 0.00 0.00 0.00 0.00
8 100.00 0.00 0.00 0.00 0.00
9 100.00 0.00 0.00 0.00 0.00
注:颜色:绿 4、黄绿 3、紫 2、黄 1、枯黄 0
Note:Color, Green3, Greenandyelow2, Yellow1, Witheredandyellow
由表 2可以看出:死亡率最高的为第 3、7、8、9组合 ,最低的为 2、4组合;分化率最高的为第 4组合 ,最
低的为第 3、7、8、9组合;分化芽数最多的为第 5组合 ,最少的为第 3、7、8、9组合;芽苗长度最长的为第 5
组合 ,最短的为第 3、7、8、9组合;芽苗颜色最好的为第 5组合 ,最差的为第 3、7、8、9组合。
2.2 不同转化方法正交试验极差分析
对表 2进行极差计算 ,结果见表 3。
表 3 不同转化方法正交试验极差分析
Table3 Extremedifferenceanalysisofdesignplanbymeansofdifferenttransformation
类别
Categories
主效因子
Mainlyefective
factors
浸染部位
Contamination
position
菌液浓度
Bacterial
concentration
浸染时间
Contamination
time
类别
Categories
死亡率%
Deathrate
X1 35.42 35.42 37.50 37.42
X2 100.00 35.33 33.33 35.42
X3 4.08 68.75 68.67 66.67
R 95.92 33.42 35.34 31.25
分化率%
Diferentiation
rate
X1 62.50 64.58 59.03 62.58
X2 92.44 62.58 64.58 59.03
X3 0.00 27.78 31.33 33.33
R 92.44 36.8 33.25 29.25
分化芽数(个)
Numberof
diferentiation
buds
X1 1.59 1.69 0.31 2.00
X2 2.38 1.84 1.52 1.15
X3 0.00 0.44 1.13 0.81
R 2.38 1.4 1.21 1.19
芽苗长度(cm)
Budslength
X1 0.36 0.32 0.26 0.52
X2 0.60 0.54 0.34 0.29
X3 0.00 0.10 0.35 0.15
R 0.60 0.44 0.09 0.37
芽苗颜色
Budscolor
X1 1.38 1.61 1.31 1.67
X2 2.21 1.46 1.40 1.10
X3 0.00 0.52 0.88 0.81
R 2.21 1.09 0.52 0.86
注:因子 1.浸染部位 , 因子 2.菌液浓度 ,因子 3.浸染时间
NOTE:Factor1Contaminationposition, Factor2 DNAconcentration, Factor3 Contaminationtime
从表 3分析结果看出 , 对死亡率各因素之间影响大小依次是浸染部位 >乙酰丁香酮浓度 〉菌液浓度 〉
浸染时间 ,所以浸染部位对死亡率影响最大 ,乙酰丁香酮浓度次之 。因此 ,对降低死亡率而言 ,最佳组合为
·193·第 2期　　　　　　　　　　　　　刘静等:石楠抗寒基因 AmGS高效转化体系的研究
茎尖 +菌液浓度为原液 +AS浓度为 30mg/L+浸染时间为 20 min。
对分化率各因素之间影响大小依次是 ,浸染部位 〉菌液浓度 〉乙酰丁香酮浓度 〉浸染时间 ,因此 ,侵染
部位对分化率影响最大 ,菌液浓度次之。所以 ,对提高分化率而言 ,最佳组合为茎尖 +菌液浓度为 2/3原
液 +AS浓度为 25 mg/L+侵染时间为 10 min。
对分化芽数各因素之间影响大小依次是浸染部位 >菌液浓度 >乙酰丁香酮浓度 >浸染时间 ,因此 ,
侵染部位对分化芽数的影响最大 ,菌液浓度次之。对提高分化芽数而言 ,最佳组合为茎尖 +菌液浓度为
1 /2原液 +AS浓度为 25 mg/L+浸染时间为 10min。
对芽苗长度各因素之间影响大小依次是浸染部位〉菌液浓度〉浸染时间 〉乙酰丁香酮浓度 。因此侵染
部位对芽苗长度影响最大 ,菌液浓度次之 。对提高芽苗长度而言 ,最佳组合为茎尖 +菌液浓度为 1/2原
液 +AS浓度为 30 mg/L+浸染时间为 10 min。
对芽苗颜色各因素之间影响大小依次是浸染部位〉菌液浓度〉浸染时间 >乙酰丁香酮浓度 ,因此侵染
部位对颜色变化影响最大 , ,菌液浓度次之。其最佳组合为茎尖 +菌液浓度为 2/3原液 +AS浓度为 25
mg/L+浸染时间 10min。
2.3 转基因植株的分子检测
对经抗菌素卡那霉素筛选初步得出的转基因植株 ,进行了 PCR分子验证 ,结果如图 2所示。其中 ,有
6个系号的植株经过 PCR扩增 ,得到一条和预期长度一样大小的 989 bp的片段 ,而未转化植株基因组未
出现 PCR扩增片段 ,初步证明外源基因已经整合到石楠基因组中 。
图 2 转基因石楠 PCR检测图
Fig.2 PCRresultoftheprogeniesofthetransgenicphotinia
1:DNA标准分子量;4:质粒 DNA(阳性对照);8:非转基因植株(阴性对照);2 , 3 , 5 , 6 , 7, 12:转化植株。
1:DNAmarke;4:DNAfromplasmid;8:Untransgenicplant;2 , 3 , 5 , 6 , 7, 12:transgenicplant。
3 小结
本试验结果得出 ,获得石楠抗寒基因 AmGS高效转化体系的最佳方法为 ,采用茎尖为转化材料 ,菌液
浓度为 2 /3 ～ 1/2原液 ,浸染时间为 10 min,添加乙酰丁香酮浓度为 25 ～ 30 mg/L。其中浸染部位是影响
基因高效转化的最主要因素 ,菌液浓度 、乙酰丁香酮浓度和浸染时间的作用次之 。因此选择合适的浸染部
位能提高基因转化效率。另外 ,本试验外源基因 AmGS是否已经整合到植株的基因组中有待于进行 PCR
-Southern检测 ,同时对转化株系遗传稳定性和抗寒性还需进一步研究 。
参考文献
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·194· 山东农业大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 40卷