全 文 ：在油棕和吕宋糖棕上检测与椰子败生
病有关的核糖核酸
J
.
W
.
R an dl
e s等
目前有人认为类病毒可能是椰子败生
病的病原 , 但对此病的流行病学却了解得
很少 。 尽管已经观察到该病自然扩展 , 但
尚不知道接种体的来源和传播方式 。 为了
鉴定接种体的可能贮主 , 研究病原寄主的
范 围很重要 。 因此 , 我们试图确定椰子以
外的其它棕搁科植物是否是败生病的天然
寄主 。
据认为 , 椰子中两种异常的单一核普
酸顺序和主要为环形结构的 R N A 与败生
病有关 。 其中有一 种 ( c R N A 一 1 ) 被
认为是诊断此病的标示物。 虽然用凝胶 电
泳分析法分析椰子提取物很容 易检 测 到
c R N A 一 1 , 但是此法不能 明 确证 明那
些我们估计是天然寄主的其它棕搁科植物
存在 c c R N A 一 1 。 我们报道过一种 改进
的提取技术 , 应用这种提取技术便可能在
非洲油棕和 吕宋糖棕上检测 到一 种 类 似
c c R N A 一 1 的成份 。 此外 , 我们还 利用
一种反向转录 D N A 探测法 , 检测了这些
棕桐科植 物中 c R N A 一 1 特殊的核普酸
顺序 。
材抖和方 法
( 一 ) 棕搁材料来源 从种植在败生
病分布地区的棕搁树上采集第二或第三片
最嫩的完全展开的复叶上的小叶 。 取样的
品种有 : 菲律宾阿尔拜研究中心的椰子 、
非洲油棕 、 枣 椰子 , 菲 律 宾 南 甘 马舞
P as ac
a o 的圣费尔南多的 吕宋糖棕 ; 阿尔
拜 、 吉诺巴坦 iB n o g s ac a n 的圆叶 蒲葵 ;
阿尔拜 、 圣多明各 、 圣伊西德罗的丘明鱼
尾葵 。 样品采集后立即处理 , 或在 4 ℃贮
存过夜后处理 。
( 二 ) 核酸提取 将叶片样品 ( 50 一
10 0克 ) 加进三份 体 积 ( 重 量 /体 积 ) 的
O
.
I M亚硫酸钠 ( N a Z S O 3 ) 中 , 有的还加
进 1 %焦碳酸二乙醋 。 然后根据分析的需
要 , 选取下述方法中的一种 , 从提取物中
提纯核酸 。
方法一 ( 用于凝胶 电泳分析法 ) 按
R a n d l e s等 1 9 7 6年介绍的方法 , 用聚乙二
醇制取椰子叶片提取物 。 用于制取油棕提
取物 , 则将此法作了修改 , 即增加聚 乙烯
毗咯烷酮 ( 不可溶类型的 ) 至 2 % , 澄清
后在冰块上摇动这种混合物 30 分钟 , 然后
用聚乙二醇制取提取物 。 处理 吕宋糖棕提
取物的方法与油棕的一样 , 但用离心法使
难溶的聚乙二醇沉淀后 , 在 O℃的 温 度条
件下用 20 %硫酸按处理上层清液 30 分钟 。
用离心法回收难溶物质 , 并用与椰子和油
棕一样的抽取步骤进行抽提 。
方法二 ( 用于分子杂交分析的总核
酸的提取 )把 50 毫升的等分抽取物与 0 . 5克
十 二烷 基硫 酸钠混合 , 再与等体积的含
有0 . 1% 8一经基吟琳的 90 %苯酚一起摇动
3 一 5 小时 。 离心后 , 用三倍体积的乙醇
与水相混合以沉淀核酸 。 用离心法收集沉
淀物 , 将其重新悬浮在10 毫升 1 %的十二
烷基硫酸钠和 10 毫升苯酚溶液中 , 并摇动
10 一 15 分钟 。 然后才分离水相和用 乙醇沉
淀核酸 。 上述用苯酚和十二烷基硫酸钠抽
提和用乙醇沉淀的步骤再重复一次 。 然后
将总核酸重新悬浮在灭菌的蒸馏水中并与
等量的 4 M氯化锉混合 。 在 4 ℃下处理 18
小时后 , 于 1 0 , 0 0 0重力加速度下离心 1 5分
钟把氯化锉可溶性 R N A 分离出来 , 并用
乙醇沉降法回收 。 把沉淀 物 溶 解 在 Z x
s s e
(
s s e 缓冲液 = o . i 5 M氯化钠 , o . o i 5 M
柠檬酸钠 ) 中并用一半体积的 1 %三一甲
基十六烷澳胺沉降可溶性R N A 而 进一步
将其提纯 。 对此沉降物进行洗涤和干燥。
( 三 ) 凝胶电泳法 按R a n d l e s 等以
前介绍的聚丙烯酞胺和琼醋糖凝胶电泳法
进行 。
( 四 ) 在蔗糖密度梯度上的核酸分部
分离 溶解于 0 . 2毫升灭菌蒸馏 水 中的核
酸在含有 o . l x s s c 白勺1 0一 35 %线性蔗糖密
度梯度中用离心法进行分部分离。 将具有
各种蔗糖密度梯度的溶液放在 S p in c 0 S W
14 型转子里 以每分钟 3 7 0 0 0转的速 度 离心
16 小时 。 玫集各部分 ( 2 毫升 ) , 分别加
入 50 微克酵母核糖核 酸 ( R N A ) , 并 且
用三份体积的乙醇沉降核酸 。 将各部分溶
解在 50 微升杂交缓冲液 ( O . 1 8 M氯化钠 ,
。 . 05 %十六烷基硫酸钠 , O . 01 M三经甲基
氨基甲烷酸钠 , p H 7 . 0 ) 中。
( 五 ) 分子杂交分析 用 S : 核酸酶分
解了的聚腺普酸化 了的 c c R N A 一 1 作 为
骨髓母细胞瘤病毒反向转录 酚 模 板 , 将
H
“标记的反向转录 D N A 合并到 c c R N A 一
1 (
e D N A ) 上 。
按 R a n d l e s等 2 9 7 9年所述的方法 进行
杂交 。 将核酸溶解在 25 一 40 微升的杂交缓
冲液中 , 并加入 c D N A ( 脉冲 数 1 , 0 0 一
1
,
5 00/ 分钟 ) 。 用石蜡油复盖溶液 , 并在
1 0 ℃下加热 3 分钟 。 然后在 GS℃ 下 培养
1 12 小时 。 通过取出25 微升等份样品与 3 0
微升 S ,核酸酶消化介质 混合 (该混合物中
含有 O。 3M氯化钠 , O . 03 M 醋酸钠的 缓 冲
液 , l m M硫酸锌 和 5 % 甘 油 , p H 为
4
.
6 ) 来测定杂交百分率。 取 1 50 微升等份
溶液与 2个单位的 S ,核酸酶在 45 ℃下一起
培养 40 分钟 , 并将其酸难溶性物质 的放射
性与不用 S : 核酸酶处理的另外 15 0毫 升溶
液的进行比较 。 把所得的数值减去空 白试
验 ( 没有 R N A 的试验 ) 的值 , 杂 交 百分
率用 5 1抗性放射性与杂交后的总 c D N A 的
比率表示 。 在这种系统中 , 同源杂交动力
学典型地表示为 R 。 t士 = 1 X 10 “ 一 7 X
1 0
一 “摩尔 /秒 /升 , 与同 源 R N A 杂 交 的
c R N A 的最 大 值 为 40 一 60 % ( 表 1 ) 。
〔 R 。 t为核普酸的浓度 (摩尔 /升 ) x 杂交
时间 ( 分 ) 〕
结 果
症状 : 取样研究的两株感病油棕不产
生花序 , 病叶破碎 , 复叶数量减少 , 叶面
积减小 。 老复叶的羽叶上出现大的赤黄色
斑点 , 而最幼嫩的展开复叶则普遍退绿 ,
并产生出小的斑点 。
与邻近的健康树比较 , 感病的吕宋糖
棕的复叶面积显著减小 , 在第三至第四片
最幼嫩的展开复叶上出现大的浅绿色至黄
色斑点 。 因为吕宋糖棕的一生才产生一次
花序 , 所以不能象椰子一样从 花 序 长 出
的多寡来诊断感病对产生花序的影响 。 不
过 , 观察结果表明感病糖棕没有出现典型
的最终 “ 结实阶段 ” 就死亡了 。 另外三种
棕搁科植物 ( 丘明鱼尾葵 , 圆 叶蒲 葵 和
枣椰于 ) 的样品复叶面积 减小 , 羽 叶 着
生斑点 , 不结果实 。 斑点黄色 , 比在油棕
和吕宋糖棕上出现的小 , 但跟感病椰子上
的差不多 。
( 一 ) 用聚丙烯酸胺凝胶电泳对 c c R
N A 一 1 的测定 用聚丙烯酞胺 凝咬 电泳
法分析油棕和昌宋搪棕的核酸 , 发现一种
电泳迁移率与 c c R N A一 1 相同的 R N A 。
按油棕核酸抽提技术提取的其它三种棕搁
科植物的核酸 , 没有出 现类 似 。 c R N A 一
1 的区带 。
表 1 检测具有类似椰子 败 生 病 叶
斑症状的油棕和吕 宋 糖 棕 的 核 酸 中的
c c R N A 一 1 特殊的核苔酸顺序的结果
病健树株数…c D N A 杂交百分率一 2
1059830弱
品 种
无 R N A
椰 子 {健康
}感染败生病
油 棕 !健康# 1…健康# 2
{感病# 1
八09曰吕宋糖棕
#
:
健康# :
#
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#
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,人内O1J.几述占脚O通占ù勺
一
#
`
{感病# :
} #
2
# 8
#
`
到的 c D N A 和总核酸间的同源百分率 。 具
有上述症状的油棕和吕宋糖棕大致表现出
用此法可取得最大杂交百分率 。 因此 , 吕
宋糖棕和油棕至少含 有一 半或 许全 部的
c 。 R N A 一 1 核普酸顺序 。 具有异常病斑
的丘明鱼尾葵 , 圆叶蒲葵和枣椰子的抽提
物没有发现 。 。 R N A一 1 。
为了测定含有同源核普酸顺序 的 R N
A 的最小体积 , 我们在几种蔗糖密度梯度
的条件下分级分离 核酸 , 并 把各 部分与
c D N A 杂交 。 我们观察到 , 主要在 。 c R N A
一 1 和 c c R N A一 2 可能要联结 的 部 位的
低分子量区比率最高 。 椰子核酸在梯度中
的同源现象较低 , 大概是由于 在 各 种蔗
糖梯度下核酸的分离不完全以 及 随 后 应
用较高的 R 。 t值检 查 微 量 。 c R N A一 1 和
c c R N A一 2的缘故 。 R a n d l e s等 以 前 应 用
琼脂糖凝胶 电泳法 的研究表明 , 在高分子
量的 R N A 中不出 现 。 c R N A一 1 和 。 c R N
A一 2 的顺序 。 因为 e e R N A一 1 和 e e R N
A一 2 的浓度太低 , 不能用紫外光吸收法
检测 , 所以不能计算出油棕和 吕宋糖棕的
R
。 t值。 另外在梯度中同源现象较低 , 可
能是由于各种核酸分离不完全 。
当应用琼脂糖凝胶 电泳法分离油棕和
椰子核酸时 , 在 c c R N A一 1 和一 2 的区
带上再 次观察到最大同源现象 。
a
.用 c D N A与从 0 . 5克叶片组织提取的等量 的核
酸杂交 1 12小时 。 表中 的 数 值 已 经 减 去 “ 无
R N A’ , 处理的数值 . 从而表示出形成杂合分子
的进入的“ H一 D N A 的百分率 .
讨 论
要确诊败生病 , 光存在一种电泳迁移
率与 c R N A一 1 相似的区带还不 是充分
的证据 。 所以我们采用了分子杂交法以确
定这些棕搁科植物 是否含有 。 c R N A一 1
的特殊核普酸顺序 。
( 二 ) 分子杂交分析 表 1 表明了从
椰子 、 油棕和 吕宋糖棕抽提的核酸中观察
本文提供了油棕和吕宋糖棕自然感染
椰子败生病的证据 , 但是其它三种具病因
未明的出现叶斑 的棕桐科植物没有出现含
有可检测的 c R N A一 l 。 症状学的研究
已导致其它研究工作者断定椰子败生病可
能侵染油棕和吕宋糖棕 。 我们在油棕和 吕
宋糖棕上都检测到具有电泳迁移率与 c R
N A一 1 相似的 R N A , ( 下转第 6 5页 )
花 、 座果和保果 的效应 。
表 3 灌 溉 对 Ba n ga lo ra品 种 的 开
花 、 座果和保果的效应 ( 6个花穗的平均
数 ) .
项 目
每个花穗的花数
每个花穗的完全花数
完全花的拓
每穗的座果数
座果数的多
每穗的保果数
保果拿拓
灌溉 {不灌溉睁 的临界数多差扣
。
灌溉时土壤水份消耗的研究 。 试验作两个
处理 :①每 1 0天灌溉一次 , ②不灌概 。 供
试的芒果有 8 个品种 , 以单株作一小区 ,
重 复 两 次 。 取 15 、 45 、 75 厘米三种土层
深度 的土壤作重量测定 , 以分别代表 。 一
3 0
、
3 0一 6 0 、 6 0一 5 0厘米土层的水份 。 灌
溉区的取样在灌概前一天和后一天进行 ,
非灌溉区则两星期取样一次 。
根据定期测量的水份计算出整个试验
期水分的总消耗量 ( 表 1 ) 。
灌溉与不灌溉处理的芒果树的水份消
耗有极大的差别 , 而且表层土壤消耗的水
份通常显著比下层土壤消耗的多 。 两种处
理对芒果树的生长和生产情况的效应见表
2
。 从对班格罗拉 ( B a n ga l or a ) 品 种两
种处理所收集的 6 个圆锥花 序 的 资料分
析 , 可清楚地看出 ( 表 3 ) 灌 溉 对 于 开
5 8 52 7
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nUn以nUot了`代dtiCU工an卜é J甲 任.刀伙O口即任J`.上卫孟,自,曰nùUnU刀性J.上J及人no
0 8 0
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n曰内0.1,O。刁土nU曰I,,`心口
4
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82 3
( ( S o u t h I n d i a n H o r t i e u l t u r e 》
2 9卷 1 期 1 9 8 1年
林淑增译 董婉秋 、 骆维校 )
( 上接第 60 页 ) 连同从分子杂交分
析中得到 的这两种棕搁科植物染病样品含
有一种与 c c R N A一 1体积相 似 , 核酸排
列顺序基本相同的 R N A 的证据 , 证明在
这两种棕树上产生了所要诊断 的 。 c R N A
一 1 。
这两种棕桐树的染病样品来自生长在
椰子败生病发生地区的成龄树 。 油棕尤其
易于感染椰子败生病的事实表明 , 这种具
有经济重要性的作物有发生败生病的潜在
危险 。
因为我们仅测验了种植在田间的棕搁
树 , 所以 , 在其它几种棕构树上未能发现
c c R N A一 1 , 并不能表明这些树不是椰
子败生病病原的寄主 。 为了用本文所述的
我们所采用 的方法进一步检测其感病性 ,
可能需要进行试验性接种和发展其它核酸
提取方法 。
对于鉴定受类病毒的 R N A 侵染的植
物和血清学技术不适用于这种鉴定时 , 分
子杂交技术具有潜在 的价值 。 这种方法可
在未经分部分馏的感病植物总核酸中在浓
度很低的情况下检测出 特 殊的 核普 酸顺
序 。 此技术对于扩大研究椰子败生病病原
寄主范围是有用的 。
( ( P h y t o p a t h o l o g y 》 7 0 卷 3 期
1 9 8 0年 蔡炳堂译 张开明 、 陈秋
波校 )