全 文 ：槟榔(Areca catechu Linnaeus)属棕榈科槟榔属
（Areca）多年生常绿乔木， 是一种典型的热带经济
作物和观赏作物， 也是重要的南药资源之一。 据报
道， 在中国海南省， 槟榔是第二大经济作物。 而槟
榔黄化病是槟榔上主要的病害之一， 现已遍及印
度、 中国等大部分槟榔生产国主产区， 造成槟榔大
面积减产， 并且有进一步扩大的趋势。 1976 年后，
国内外科研工作者通过各种方法证实了在发病的槟
榔中存在植原体 [1-7]， 但是植原体是否为槟榔黄化
病的真正病原还在进一步研究当中。
植原体（Phyltoplasm）原称类菌原体（mycoplasma
like-organism， MLO）， 是一类无细胞壁的植物病
原微生物 ， 其基因组较小 （约0.53～1.35 Mb） [8 -9]，
（G+C）含量较低(约 25 mol)， 在系统分类学上植原
热带作物学报 2014， 35（11）： 2243-2248
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2014-04-23 修回日期 2014-07-23
基金项目 公益性科研院所基本科研业务费专项(No. 1630052013010)； 海南省重大科技项目（No. ZDZX2013023-1）。
作者简介 杨文君 (1985年— )， 男， 助教； 研究方向 ： 植物分子病毒学 。 *通讯作者(Corresponding author)： 刘志昕(LIU Zhixin)， E-mail:
liuzhixin@itbb.org.cn； 余乃通(YU Naitong)， E-mail： yunaitong@163.com。
槟榔植原体膜蛋白基因的克隆及其抗血清制备
杨文君 1，2， 余乃通 2*， 张雨良 2， 王健华 2， 刘志昕 2*
1 雅安职业技术学院， 四川雅安 625000
2 中 国 热 带 农 业 科 学 院 热 带 生 物 技 术 研 究 所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室 海南海口 571101
摘 要 根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因（AcPmp）序列设计 1 对特异引物 mp-FP/mp-RP， 以病样槟榔
总 DNA 为模板扩增该 AcPmp 的编码区并连接到 pMD19T simple 中间载体 。 将测序正确的阳性菌提取质粒
pMD19T-AcPmp， 经 NcoⅠ和 XhoⅠ双酶切后回收 AcPmp 片段 ， 然后以正确的编码框连接到原核表达载体
pET32a(+)， 转化 Escherichia coli BL21感受态细胞。 含有 pET32a-AcPmp的 BL21表达菌经 IPTG诱导和 SDS-PAGE
分析表明， 在 30 ℃， 0.1 mmol/L IPTG 条件下诱导 4 h， 可产生部分可溶性的融合蛋白。 利用 Ni2+-NTA 亲和层析
柱法进行纯化并获得高纯度的可溶性融合蛋白。 将纯化后的融合蛋白多次免疫家兔， 取其抗血清， 以融合蛋白
（1 ∶ 10 000 稀释）作抗原， 间接 ELISA 法测定抗血清效价大于 125 000。 Western Blot 杂交结果表明槟榔植原体膜
蛋白抗血清能与融合蛋白特异性结合。
关键词 槟榔植原体； 膜蛋白基因； 原核表达； 抗血清制备
中图分类号 S59 文献标识码 A
Cloning and Prokaryotic Expression of Areca
Phytoplasma Membrane Protein Gene and
Preparation of Its Polclonal Antiserum
YANG Wenjun1,2, YU Naitong2*, ZHANG Yuliang2, WANG Jianhua2, LIU Zhixin2*
1 Yaan Vocational College, Yaan, Sichuan 625000, China
2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory
of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture, Haikou, Hainan 571101, China
Abstract Total DNA was extracted from the infected Areca and used for amplifying the membrane protein gene
of Areca Phytoplasma by using primers mp-FP/mp-RP based on its sequence from previous study. The membrane
protein gene was finally inserted into prokaryotic expression vector pET-32a ( + ) and the recombinant plasmid
pET32a -AcPmp was identified by NcoⅠ/XhoⅠ restriction enzymes and Sanger sequencing. Subsequently the
recombinant plasmid was transferred into Escherichia coli BL21 competent cell, and the positive colony was
induced at 30 ℃ with 0.1 mmol/L IPTG for 4 hours. The result showed that small part of soluble fused protein
was expressed and then purified by Ni2+-NTA agarose affinity chromatography, and the high purity of fused protein
was finally obtained in 500 mmol/L imidazole Elution buffer. Two rabbits were immunizeed for 3 times by using
purified protein and phosphate buffer control the antiserum against Phytoplasma MP was collected and indirect.
Indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ID-ELISA) indicated that the titer of antiserum was higher than 1 ∶
125 000. Western Blot analysis further showed that the antiserum was specifically binding with the MP fused protein.
Key words Areca phytoplasma; Membrane protein gene; Prokaryotic expression; Preparing anti-serum
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.024
第 35 卷热 带 作 物 学 报
PCR 反应条件如下： 94 ℃预变性 3 min ； 94
℃变性 30 s， 55℃ 退火 30 s ， 72℃延伸 1 min， 35
个循环； 72 ℃延伸 10 min 并终止。 取适量 PCR 产
物进行琼脂糖凝胶（1％）电泳检测， 剩余 PCR 产物
采用 TIANGEN 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒（天根
生物技术有限公司）回收纯化， 具体操作过程参照
说明书进行。 将纯化 PCR 产物用 T-A 克隆的方法
连接到质粒 pMD19T simple vector（TaKaRa 公司），
转化 DH5α 大肠杆菌。 经菌液 PCR 和质粒双酶切
（NcoⅠ/XhoⅠ）鉴定后， 阳性克隆子送往上海英俊
生物技术有限公司进行测序。
1.2.3 原核表达载体的构建及鉴定 将中间质粒
pMD19T-AcPmp 和表达载体 pET32a(+)分别进行
NcoⅠ/XhoⅠ双酶切， 37℃水浴过夜。 TIANGEN 琼
脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒纯化线性的 AcPmp 和
pET32a(+)片段。 将回收的目的基因 AcPmp 片段连
体属于柔膜体纲（Mollicutes）[10]。 就物种起源而言，
植原体被认为是厌氧植原体属中形成的一个单元演
化分枝； 从进化学说而论， 植原体来自于革兰氏阳
性菌， 梭菌属细菌的祖先 [11]。 植原体不能人工培
养， 主要寄生于植物韧皮部筛管细胞中， 可引起植
物植株黄化、 丛枝、 花变叶、 矮缩或花器返祖等症
状， 给经济作物造成巨大的损失 [12]。 自 1967 年由
Doi 首次报道植原体以来， 至今已发现有 300 多种
植物的病害与植原体相关， 其中在中国已报道的约
74 种[13-15]。 由于植原体没有细胞壁， 菌体细胞膜直
接与寄主植物或虫媒介体细胞接触， 因此， 认为其
膜蛋白可能在虫媒介体-植原体-寄主植物的相互
关系中起着非常重要的作用[16-21]。
本研究 PCR 扩增获得海南琼海槟榔植原体膜
蛋白基因（AcPmp）编码区序列， 构建到原核表达载
体 pET32a(+)并转化表达菌。 通过该融合蛋白的表
达、 Ni2+-NTA 亲和层析柱法纯化以及家兔免疫 ，
制备了效价高、 特异性强的槟榔植原体膜蛋白抗血
清， 为后期着手开展植原体膜蛋白与寄主蛋白之间
的互作等研究奠定了前期基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病样 槟榔黄化病病样材料采至海南琼海， 16S
rRNA检测为阳性。 健康槟榔由本实验室保存提供。
1.1.2 菌株与质粒 克隆载体 pMD19T simple vector
购至大连宝生物公司（TaKaRa）； 表达载体 pET-
32a(+)由本实验室保存； 克隆菌株 E.coli DH5α 购
至北京全式金生物技术有限公司； 表达菌株 E.coli
BL21（DE3）购至德国默克公司。
1.1.3 酶和化学试剂 PrimerSTARTM HS DNA
polymerase、 rTaq DNA polymerase、 氨苄青霉素
（Ampicillin）、 IPTG 均购自大连宝生物公司； 限制
性内切酶 NcoⅠ/XhoⅠ购自 Fermentas 公司； 琼脂
糖凝胶 DNA 回收试剂盒、 DNA Marker 购自天根
生化科技有限公司 ； 蛋白低分子量 Marker 购自
Promega 公司； 丙烯酰胺、 N， N′-亚甲基双丙烯酰
胺、 三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自 Solarbio 公司；
十二烷基磺酸钠（SDS）、 考马斯亮蓝 R-250 购自
Amresco公司； 其它化学试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 总 DNA 提取 槟榔基因组总 DNA 提取按
照本实验室改良的 CTAB法[22]。
1.2.2 PCR 产物的克隆及测序 根据实验室测得
的槟榔植原体膜蛋白基因编码区序列（图1）设计一
对特异引物 mp-FP（5′-TGCCATGGCTATGAATCAC
AAAGAAAATTTTTTA-3′， 含 NcoⅠ酶切位点 ）和
mp-RP（5′-CCCTCGAGTTATGATTGTACTTTTAAGT
CTGT-3′， 含 XhoⅠ酶切位点）。 引物由 Invitrogen
公司合成。
图1 槟榔植原体膜蛋白基因序列
Fig. 1 Membrane protein gene sequences of Areca Phytoplasma
ATGAATCACAAAGAAAATTTTTTACAAACTAAAAACGGCAAAATTACAGTTGGTGTTT
TAGCATCTGCAGGTATAGCTTTAGTTGTTTATTTAATAACAGCGAAATTATTGCATTGGG
CACCTTTTACAATAAAAACATTAACAACTAAAGATATTGATAATTTAAAAGTCGAAATT
AAAGATTTCACAGGTTTAAACACAAAAGATAAACTTAGTTCAGATGATGCTAAACAAG
AATCGCAAAAAGCATTTGACGCTATAAACAAAATAGTAGATGCATTTGCAGAAAATAA
CAAAGCAGACATTAAAGATAAAAAAATTTCTGATTCAACAATAGCCGCAGCAAACAAT
TTAAAAACAAAAGCTGATAATGCATTAAAATTTGTTAATGAGAACGCTAGTGTTACTAA
TTGGACAGATGACAGAGTACAAGATTTTGTTAATAATAAAGTGGTAAAAACCAAAGAA
ATTAATGATTTATTAAGTCAAGCTAAAACAGACTTAAAAGTACAATCATAA
2244- -
第 11 期
接到 pET32a(+)上 ， 构建重组表达质粒 pET32a-
AcPmp。 连接产物转化到 BL21（DE3）大肠杆菌感
受态细胞。 经菌液 PCR和 NcoⅠ/XhoⅠ质粒双酶切
鉴定后， 再随机选择 3个阳性单克隆送往上海英俊
生物技术有限公司进行测序。
1.2.4 融合蛋白的诱导表达和可溶性分析 含有
重组质粒 pET32a-AcPmp 的大肠杆菌 （BL 21）以
1 ∶ 100 的接种量接种于 50 mL LB 液体培养基(含氨
苄青霉素 100 μg/mL)中， 37 ℃摇床振荡培养。 A600
值达到 0.5～0.6时， 加入终浓度为 0.1mmol/L的 IPTG，
30℃继续诱导培养 3～6 h。
取不同诱导时间的表达菌液 1 mL加入 2 mL离
心管中， 12 000 r/min 离心 1 min， 弃上清， 沉淀用
50 μL 双蒸水悬浮， 再加入 50 μL 的 2×SDS-PAGE
上样缓冲液混匀， 沸水浴煮 5 min 后放置在冰上
2 min。 在 4℃条件下， 12 000 r/min 离心 1 min， 取
上清 10 μL 进行 SDS-PAGE 电泳。 另收集经诱导
培养 4 h的菌液 10 mL， 离心沉淀后用 500 μL 双蒸
水悬浮细胞， 使用超声波进行菌体破碎； 离心后将
上清转到 2 mL离心管中， 沉淀用 500 μL 双蒸水重
悬 。 取 5 μL 上清和 5 μL 沉淀 ， 加入等体积 2×
SDS-PAGE 上样缓冲液， 沸水浴煮 5 min。 取10 μL
进行 SDS-PAGE电泳， 分析融合蛋白的可溶性。
1.2.5 融合蛋白的纯化 扩大培养 pET32a-AcPmp
表达菌至 1 L， 按上述条件诱导表达 4 h。 于 4 ℃
6 000 r/min 离心 30 min， 菌体沉淀溶于 50 mL
Binding buffer 中， 冰浴放置 30 min。 冰上超声波
破碎仪破碎细胞后， 于 4℃ 12 000 r/min离心 30 min，
上清过 0.45 μm 滤膜。 过膜上清液进行 Ni2+-NTA
亲和层析柱纯化： 用 6 mL 灭菌水洗涤琼脂糖树脂
2 次， 再用 6 mL Binding Buffer 平衡亲和柱； 然后
含目的蛋白的上清液上柱， 用 6 mL Washing Buffer
（500 mmol/L NaCl， 20 mmol/L imidazole， 20 mmol/L
Tris-HCl， pH8.0） 洗脱杂蛋白 ； 最后再以 6 mL
Elution Buffer（500mmol/L NaCl， 0.5mol/L imidazole，
20 mmol/L Tris-HCl， pH8.0）将融合蛋白洗脱下来。
融合蛋白溶液置换 ： 将含有融合蛋白的 Elution
Buffer置于透析袋经 100 mL 1×PBS 溶液透析 3 次，
即可获得溶于 PBS的纯化蛋白。
1.2.6 抗血清制备及血清学检测 纯化的融合蛋
白溶液经透析袋透析后获得溶于 1×PBS 的蛋白溶
液， 利用 BCA 法测定其浓度后， 与佐剂（1 ∶ 1）混
匀， 采用皮下多点注射抗原的方法多次免疫家兔，
每只家兔的融合蛋白总注射量为 1.5～2.0 mg。 第 3
次免疫 10 d后， 每只白兔耳缘静脉取血 0.5～1.0 mL，
分离抗血清。 以 1×PBS的蛋白溶液（1 ∶ 10 000）作抗
原， ID-ELISA 法检测抗血清效价， 血清效价未符
合要求则继续免疫。 血清效价符合要求后， 心脏采
血， 分离抗血清。 以免疫前的家兔血清为对照。
1.2.7 Western Blot 鉴定抗血清特异性 取诱导
表达 4 h 的 pET32a -AcPmp 菌体 ， 处理后进行
SDS-PAGE凝胶电泳。 用蒸馏水漂洗电泳后的蛋白胶，
转入电转液中平衡 10 min。 利用转膜仪在 100 V，
60 mA 的条件下反应 1 h 使蛋白转移到 NC 膜上，
取出 NC膜并在蒸馏水中漂洗。 将 NC膜平衡于 TBST
缓冲液[20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）， 150 mmol/L
NaCl， 0.05％ Tween-20]后， 置于含有 5％脱脂牛
奶的封闭液中封闭过夜(4 ℃)。 然后用 TBST 缓冲液
漂洗 NC膜 3次， 将其放入按 1 ∶ 5 000的一抗 TBST
溶液， 在 37℃孵育 40 min。 取出 NC 膜经 TBST 漂
洗后， 转入按 1 ∶ 30 000 稀释的碱性磷酸标记的山
羊抗兔（IgG）TBST溶液中， 37℃孵育 40 min。 再取
出 NC 膜， 经 TBST 漂洗后， 滴加含有 330 μg/mL
NBT（0.5 g NBT溶于10 mL 70％的二甲基甲酰胺）
和 165 μg/m LBCIP （0.5 g BCIP 溶于 10 mL 100％
的二甲基甲酰胺）的显色液于 NC 膜蛋白面， 直到
条带清晰后， 用蒸馏水漂洗 2 次， 终止显色反应。
取出 NC膜晾干并扫描保存图片。
2 结果与分析
2.1 AcPmp基因克隆和表达质粒的构建
从病样总 DNA 中扩增获得的 AcPmp 基因片
段， 经 1％琼脂糖凝胶电泳后结果如图所示（图 2），
扩增片段大小约为 500 bp， 与预期结果相符， 而健
康植株和 ddH2O对照均未出现特异性扩增条带。
构建的表达质粒 pET32a-AcPmp经 XhoⅠ/NcoⅠ
双酶切验证， 出现特异性 DNA 条带， 其中一条大
小约为 500 bp（图 3）， 与预期 AcPmp 基因片段结
果相符。 测序结果进一步证明成功构建了重组表达
质粒 pET32a-AcPmp。
M： DL 2 000； 1： 水对照; 2； 健康槟榔； 3~6： 染病槟榔。
M: DL 2 000; 1: Water control; 2: Healthy Areca; 3~6: Infect Areca.
图2 槟榔植原体AcPmp基因PCR扩增
Fig. 2 PCR amplification of AcPmp gene of Areca Phytoplasma
M 1 2 3 4 5 6
2 000
750
500
100
bp
杨文君等： 槟榔植原体膜蛋白基因的克隆及其抗血清制备 2245- -
第 35 卷热 带 作 物 学 报
M： 蛋白marker； 1： 洗脱液 ； 2~5： 咪唑浓度依次为
20、 50、 100、 500 mmol/L的洗脱液。
M： Protein marker； 1： Washing buffer； 2~5： Elution
buffer with 20， 50， 100， 500 mmol/L Imidazole.
图6 融合蛋白的纯化
Fig. 6 Purification of the fusion protein
80
60
40
30
20
12
100
M 1 2 3 4 5
50
ku
M 1 2 3 4 5 6 7
94
62
40
30
24
16
ku
M: 蛋白marker； 1： BL21诱导0 h； 2: BL21诱导4 h；
3： pET32a/BL21诱导 0 h； 4： pET32a/BL21诱导 4 h； 5：
pET32a-AcPmp/BL21诱导0 h； 6： pET32a-AcPmp/BL21诱
导4 h； 7： pET32a-AcPmp/BL21诱导6 h。
M: Protein marker; 1: BL21 induced 0 h; 2: BL21 induced
4 h; 3: pET32a/BL21 induced 0 h; 4: pET32a/BL21 induced 4 h;
5: pET32a-AcPmp/BL21 induced 0 h; 6: pET32a-AcPmp/BL21
induced 4 h; 7: pET32a-AcPmp/BL21 induced 6 h.
图4 融合蛋白的原核表达分析
Fig. 4 Prokaryotic expression analysis of fusion protein
2.2 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析
SDS -PAGE 电泳结果显示 （如图 4） ： 含有
pET32a-AcPmp 重组质粒的表达菌经 IPTG 诱导表
达 4、 6 h后， 在大小约 37 ku处均有一明显的蛋白
条带， 其大小与预估的融合蛋白（6×His-AcPmp）符
合。 而未诱导的 BL21 表达菌、 pET32a/BL21 表达
菌 、 pET32a-AcPmp/BL21 表达菌和 IPTG 诱导的
BL21 表达菌、 pET32a/BL21 表达菌均未出现该特
异蛋白条带。
融合蛋白的可溶性分析（如图 5）： SDS-PAGE
胶显示融合蛋白（6×His-AcPmp）主要以沉淀的形式
表达， 但是仍有一小部分溶于溶液中， 即可溶性融
合蛋白， 含量较低。
2.3 融合蛋白的纯化
为了简便操作过程和尽量保持融合蛋白的生物
活性， 笔者选择上清液（可溶性的融合蛋白）进行
Ni2+-NTA 亲和层析蛋白纯化。 于 30℃， IPTG 终浓
度为 0.1 mmol/L 的条件下， 对重组表达菌 pET32a-
AcPmp/BL21 进行大量（1 L）诱导培养 4 h。 如 2.2
所述， 获得的融合蛋白大部分以包涵体形式存在，
但也有一小部分可溶于溶液中， 即是可溶性的。 可
溶性的杂蛋白经 100 mmol/L 咪唑浓度的 washing
buffer 洗脱除去后， 与亲和层析柱 Ni2+螯合的目的
蛋白纯度已达要求。 最终， 用含 500 mmol/L 咪唑
浓度的 washing buffer 将融合蛋白溶于其中（图 6）。
M： DL 2 000； 1, 2： 经XhoⅠ/NcoⅠ双酶切的pET32a-AcPmp。
M： DL 2 000； 1, 2： pET32a-AcPmp by XhoⅠ/NcoⅠ。
图3 重组质粒pET32a-AcPmp双酶切鉴定
Fig. 3 Identification of the recombination plasmid
pET32a-AcPmp by XhoⅠ/NcoⅠ
2 000
1 000
750
500
250
100
bp
M 1 2
M： 蛋白Marker； 1， 2： 可溶性蛋白； 3， 4： 不可溶性蛋白。
M： Protein Marker； 1， 2： Soluble proteins； 3， 4： Insoluble proteins.
图5 融合蛋白的可溶性分析
Fig. 5 Analysis of soluble of fusion protein
80
60
40
30
20
12
M 1 2 3 4
ku
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第 11 期
3 讨论与结论
随着生物技术， 特别是蛋白分子生物学的快速
发展， 研究学者们对蛋白的结构及生物学功能的认
识有了显著的提高。 从蛋白的溶解度方面来说， 目
前常规纯化技术对于可溶性蛋白的分析、 纯化和制
备均具有较高的成功率。 但对于一些棘手的不溶性
蛋白质（如膜蛋白等）的纯化研究却困难重重， 如蛋
白质的活性问题等。 近年来， 对于膜蛋白质的纯化
2.4 抗血清制备和效价测定
用 ID-ELISA 法对家兔进行免疫前血清本底水
平检测， 结果显示： 实验所选用的新西兰大白兔
（编号A）血清本底比较低（表 1）， 符合实验要求。 将
溶于 1×PBS 溶液的纯化融合蛋白作为免疫原， 第
一次与完全佐剂等比例混匀， 第二、 三次与不完全
佐剂等比例混匀， 采用肌肉与皮下注射相结合免疫
新西兰大白兔。 3 次注射后采集血清， 以融合蛋白
溶液（1 ∶ 10 000稀释）为抗原进行 ID-ELISA 测定抗
血清效价。 结果显示（表 2）， 本试验制备的多克隆
抗血清的效价大于 125 000。
2.5 Western Blot 鉴定抗血清特异性
经 Western Blot抗原抗体结合反应和 NBT/BCIP
显色反应， 兔抗融合蛋白（6×His-AcPmp）的抗血清
与 IPTG 诱导的 pET32a-AcPmp 表达菌有特异性反
应（图 7）， 其特异性蛋白大小约为 37 ku， 与预期
大小相符， 而与其它杂蛋白条带均无明显特异反
应， 表明本研究制备的兔抗融合蛋白抗血清具有较
好的特异性。
表1 ID-ELISA检测免疫前家兔的血清背景
Table 1 Antiserum background of pre-immuned rabbit by ID-ELISA
样品
稀释梯度
1 ∶ 200 1 ∶ 1 000 1 ∶ 5 000 1 ∶ 25 000 1 ∶ 125 000 1 ∶ 625 000
抗血清A 0.242 0.386 0.232 0.141 0.124 0.085
空白 0.118 0.091 0.105 0.089 0.099 0.094
说明： Blank为1×PBS溶液， 阳性结果标准OD405阳/OD405阴＞2.1, 且OD405＞0.1。
Note： Blank means “1×PBS solution”， and the criteria of positive result is OD405P/OD405N＞2.1, and OD405＞0.1.
表2 免疫后抗血清的ID-ELISA结果
Table 2 ID-ELISA results of immuned antiserum
样品
稀释梯度
1 ∶ 200 1 ∶ 1 000 1 ∶ 5 000 1 ∶ 25 000 1 ∶ 125 000 1 ∶ 625 000
抗血清A1 2.621 2.939 3.115 1.616 0.550 0.197
抗血清A2 3.237 3.378 3.113 1.763 0.580 0.213
空白 0.116 0.109 0.133 0.109 0.110 0.108
阴性对照（CK-） 0.103 0.106 0.109 0.112 0.121 0.104
说明： 阴性对照CK-为免疫前血清， Blank为1×PBS溶液， A1和A2为免疫后抗血清， 显色时间分别为5、 10 min。
Note: Negative control (CK-) from pre-immuned antiserum, Blank means “1×PBS solution”, and A1、 A2 from immuned antiserum with 5 min and
10 min of color time.
M： 蛋白Marker； 1： 未诱导pET32a/BL21表达菌； 2： IPTG诱导pET32a-AcPmp/BL21表达菌4 h。
M： Protein Marker； 1： un-induced pET32a/BL21； 2： IPTG induced pET32a-AcPmp/BL21 with 4 h.
图7 表达融合蛋白的SDS-PAGE分析（A）及Western Blot检测（B）
Fig. 7 SDS-PAGE analysis (A) and Western blot detection (B) of fusion protein
ku ku
94
62
40
30
24
16
M 1 2
94
62
40
30
24
16
M 1 2
杨文君等： 槟榔植原体膜蛋白基因的克隆及其抗血清制备
A B
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第 35 卷热 带 作 物 学 报
和功能研究等技术是非常迫切的， 这是因为膜蛋白
在基础生理过程中（如信号转导、 分子转运、 能量利
用以及细胞和组织结构的维护）具有极其重要的作用。
利用细菌原核表达系统表达外源蛋白来获得高
纯度和高浓度的蛋白已经成为一项成熟的实验技
术， 且可选择的宿主和载体具有多样性， 这就为不
同性质的蛋白表达和蛋白纯化奠定了基础。 表达的
外源蛋白主要有 2种形式， 一种是可溶性的外源融
合蛋白， 一种是以包涵体形式存在的融合蛋白。 这
2 种不同形式的蛋白进行纯化时， 主要区别在于包
涵体需要经过变复性处理， 而可溶性蛋白则不需
要[23]。 本研究的槟榔植原体膜蛋白在大肠杆菌中主
要以包涵体的形式存在， 但仍有一小部分是可溶
的。 为了简便操作过程和尽量保持融合蛋白的生物
活性， 我们选择上清液（可溶性的融合蛋白）进行
Ni2+-NTA 亲和层析蛋白纯化。 在 30 ℃的条件下大
量诱导表达融合蛋白， 取可溶性的上清（含部分融
合蛋白）进行纯化， 与佐剂混匀多次免疫新西兰大
白兔， 制备高特异高效价的抗血清。
本研究制备的槟榔植原体膜蛋白多克隆抗血清
具有效价高、 特异性强等特点， 且抗血清将为后续
细菌双杂交或酵母双杂交等实验的展开奠定基础。
除此之外， 现今槟榔植原体的检测或诊断基本采用
PCR 方法[24-25]， 而其它的快速检测方法较欠缺。 与
PCR 方法相比 [24-25]， 本研究槟榔植原体膜蛋白多克
隆抗血清的制备， 是后续 ELISA 检测方法建立的
先决条件， 将大大降低检测槟榔植原体的费用， 具
有操作简单、 快速、 应用范围广泛等特点[26]。
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责任编辑： 黄 艳
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