全 文 ：食品研究与开发2009 年 8 月第 30 卷第 8 期
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收稿日期：2008-04-16
魏敏 1，宋旭艳 1，韩旭 2，罗诚浩 1，*
（1.湖北中烟工业公司技术中心，湖北 武汉 430051；2.武汉大学 生命科学学院，湖北 武汉 430072）
酶促提取紫苏残渣黄酮加速氧化试验
及稳定性分析
摘 要：对紫苏叶经挥发油提取后的残渣，比较分析加酶、不加酶提取紫苏残渣的黄酮产率，分析紫苏残渣黄酮提
取物的抗氧化性，以及一些影响因素，结果显示：①复合酶促提取紫苏残渣黄酮产率为 5.625 ％，高于不加酶提取
黄酮产率 5.000 ％；②在清除 DPPH.自由基试验中，黄酮提取物浓度为 0.52 g/L时，清除率达 52.44 ％；③在加速氧
化试验中，分别测定在 60 ℃温育 1、2、3、4、5 d后紫苏残渣提取物的黄酮含量及抗氧化性，显示黄酮提取物具有较
长期的稳定性；在 pH2～10提取液黄酮含量、pH4～10抗氧化性较稳定，均随着 pH值升高略有所降低。因此，复合
酶促提取比不加酶提取的紫苏残渣黄酮的产率高，紫苏残渣黄酮提取物在一定范围内随浓度增加清除自由基能
力增强，具有较好的长期热稳定性，在一定 pH范围内的黄酮含量、抗氧化性的稳定性好。
关键词：复合酶促提取；紫苏残渣；黄酮；加速氧化；稳定性
ANALYSIS OF STABILITY AND THE ACCELERATED OXIDATION EXPERIMENTS OF FLAVONOIDS
IN PERILLA RESIDUE BY COMPLEX ENZYMATIC EXTRACTION
WEI Min1, SONG Xu-yan1, HAN Xu2, LUO Cheng-hao1,*
(1．Technology Center of China Tobacco Hubei Industrial Corporation，Wuhan 430051, Hubei，China;
2．College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei, China)
Abstract: The extraction rate of flavonoids in Perilla residue after extracting volatile oil from Perilla leaf was
作者简介：魏敏（1979—），女（汉），助理工程师，硕士，主要从事天然植物烟用研究。
* 通讯作者
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紫苏（Perilla frutescens）系唇形科（Labiate）一年生
草本,是传统的药食两用植物,具有多种药用价值和保
健功能，且富含黄酮类化合物[1]。 黄酮化合物具有清除
人体中超氧离子自由基及抗衰老、增加机体免疫力的
生理活性，无毒副作用，是一类极具开发前景的天然有
机抗氧化剂 [2]。 而酶在植物有效成分提取中能达到提
高收率、降低成本和提高产品质量等效果[3-4]。
目前，已有关于紫苏黄酮提取工艺、抗油脂氧化、
体外清除自由基等的研究 [5-8]，但鲜有利用紫苏残渣、
采取酶促提取、相关稳定性研究等报道。因此，在前人
研究的基础上开展了从紫苏叶提取挥发油后的残渣
中提取紫苏黄酮、采用复合酶促提取的方法、进行加
速氧化试验以及考察一些影响稳定性的因素，以期充
分合理利用工业残渣获得稳定性好、天然有效的抗氧
化剂。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
1.1.1 材料
紫苏叶残渣：紫苏叶经水提挥发油后的残渣。
1.1.2 药品
芦丁标准品：99 ％， 南京替斯艾么中药研究所；
DPPH（1，1－二苯基苦基苯肼）：AR,Sigma 公司；食品级
纤维素酶（型号 K9146）：珠海市科力创生物科技有限
公司；中性蛋白酶（型号 K9120）：珠海市科力创生物科
技有限公司）；无水乙醇、亚硝酸钠（A.R）：国药集团化
学试剂有限公司；硝酸铝（A.R）：上海振欣试剂厂；氢
氧化钠（A.R）：天津市风船化学试剂科技有限公司。
1.1.3 仪器
UV BlueStar紫外分光光度计：北京莱伯泰科公司；
高速冷冻离心机（3K15）：Sigma公司；粉碎机（70S-26321）：
Foss Tecator Box，分析天平（0.000 1, BP 221S）：Sartorius；
分析天平（0.000 01，XP205）：METTLER TOLEDO；电热
恒温水浴锅(HH-S)：余姚市金惠电子设备厂；电热鼓风
干燥箱（YLD-2000）：黄石市医疗器械有限公司。
1.2 方法
1.2.1 紫苏叶残渣中黄酮类物质的酶促提取
紫苏叶残渣样品经 40 ℃干燥后粉碎， 准确称取
10 g粉末，放入 500 mL 烧瓶中；20 mL蒸馏水调 pH值
至 5.2，加 0.1 g纤维素酶和中性蛋白酶（质量比为 1:1），
倒入上述 500 mL烧瓶中， 与紫苏叶残渣粉末混匀，置
于 55℃恒温水浴内保温 1.5 h后， 加入 380mL无水乙醇
90℃回流提取 1 h，水泵减压抽滤，滤液经 11 000 r/min
高速离心，取上清液，定容至500 mL，即得到紫苏叶残
渣黄酮提取液，为澄清紫红色溶液。
对照组为不加酶，其它步骤相同，同样为澄清紫
红色溶液。
1.2.2 总黄酮含量的测定——UV法
1.2.2.1 标准曲线的制备
准确称取芦丁标准品 0.050 2 g， 用 30 ％乙醇溶
解，并完全移入 500 mL 容量瓶中，用 30 ％乙醇定容。
分别取芦丁标准溶液 0、1、2、4、6、8、10 mL于 7只 25 mL
容量瓶中，用 30 ％乙醇补充至 15 mL，加入 5 ％的亚硝
酸钠 0.7 mL， 摇匀， 放置 5 min 后加入 10 ％硝酸铝
0.7 mL，6 min 后再加入4 ％的氢氧化钠 5 mL，混匀，用
30 ％乙醇稀释至刻度，10 min 后于波长 510 nm 处比
compared between by complex enzymatic extraction and by non-enzymatic extraction. However, anti-oxidation
activity and some influencing factors of stability of flavonoids extract from Perilla residue was analyzed. The
results showed that: ①The extraction rate of flavonoids in Perilla residue by enzymatic extraction (5.625 ％)
was higher than that by non- enzymatic extraction (5.000 %); ②Removal DPPH·radical experimental: when
the flavonoids extract’s concentration was 0.52 g/L, the removal rate was 52.44 % ; ③ In the accelerated
oxidation experiments, the flavonoids content and anti-oxidation activity were determinated after incubated 1,
2, 3, 4, 5 d at 60 ℃ , showing that the flavonoids extract had good thermal stability in a long time. And the
flavonoids in Perilla residue extract content was stable at pH2-pH10，but anti-oxidation activity was stable at
pH4-pH10. In a word, The extraction rate of flavonoids in Perilla residue by complex enzymatic extraction
(5.625 ％) was higher , and its’ anti-oxidation activity was good. The ability of removal DPPH· radical was
enhanced with increasing of concentration in a certain range. However, the flavonoids in Perilla residue
extract also had good thermal stability. And its content and anti-oxidation activity ware stable in a certain pH
range, which declined slightly when pH increased.
Key words: complex enzymatic extraction; perilla residue; flavonoids; accelerated oxidation; stability
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色测定，空白为芦丁 0 mL标准液。 测得吸光度 A与浓
度 C 的标准曲线回归方程为 ：A=7.602 1C +0.008 5，
R2＝0.991 7。
1.2.2.2 黄酮含量的测定方法
分光光度法：采用亚硝酸钠－硝酸铝比色法。
分别取提取液各 0.2 mL 于 5 只 25 mL 容量瓶中，
用 30％乙醇补充至 15mL， 加入 5％的亚硝酸钠 0.7mL，
摇匀， 放置 5min后加入 10 ％硝酸铝 0.7 mL，6 min 后
再加入 4 ％的氢氧化钠 5 mL，混匀，用 30 ％乙醇稀释
至刻度，10 min后于波长 510 nm 处比色测定， 记录吸
光值在 0~1.0以内为有效。
1.2.3 清除 DPPH.自由试验
DPPH·在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙
醇溶液(显深紫色)在 516 nm处有最大吸收峰。 当与抗
自由基活性物质作用时，其孤对电子被配对，因而吸收
消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基
清除剂的活性。
准确称取 2.5 mg DPPH·溶于 100 mL 甲醇， 配制
为浓度 0.025 g/L DPPH·紫色溶液。
分别配制紫苏残渣黄酮提取液为 0.04、0.2、0.36、
0.52、0.68、0.84、1 g/L浓度，加样 0.1 mL样品液和 3.9 mL
DPPH·溶液于比色皿中， 混匀 5 min 后检测 516 nm 处
吸光值。
0.1 mL蒸馏水和 3.9 mL DPPH·溶液混匀 5 min后
于 516 nm处所测吸光值为 A0。
0.1 mL样品和 3.9 mL DPPH·溶液混匀 5 min后于
516 nm处所测吸光值为 A1。
以 0.1 mL 样品和 3.9 mL 甲醇溶液混匀 5 min 后
于 516 nm处所测吸光值为空白。
清除率＝（1－A1/A0）×100％
每次取 2个平行样，重复测定 2次取平均值。
1.2.4 稳定性测定
1.2.4.1 加速氧化试验
配制一定浓度的紫苏残渣黄酮提取液，分别在
60 ℃温育 1、2、3、4、5 d 后，以 UV 法分别测定紫苏残
渣提取液的黄酮含量和对 DPPH·自由基清除率。 每次
取 2个平行样，重复测定 2次取平均值。考察加速氧化
结果，一般温度每上升 10℃，反应速度加快 2 倍~3倍，
若以常温为 25 ℃为标准，则 60 ℃时的反应速度为常
温时的（23.5－33.5，即 11.3 倍~46.8 倍），如连续进行 5 d
的测试， 则相当于自然存放时间的 5×11.3=56.5 d 至
5×46.8＝234 d 的试验。
1.2.4.2 pH影响稳定性试验
配制一定浓度的紫苏残渣黄酮提取液， 在 pH2、
4、6、8、10、12 时 ， 以 UV 法分别测定黄酮含量及
DPPH·自由基清除率。
每次取 2个平行样，重复测定 2次取平均值。
2 结果与分析
2.1 紫苏残渣黄酮含量
测得紫苏残渣黄酮提取液的吸光值后由回归方
程计算所得数值，经浓度换算即是黄酮的含量。10 g紫
苏残渣粉末，提取后溶液定容到 500 mL，加酶黄酮提
取液 0.2 mL 定容到 25 mL 30 ％乙醇体系， 吸光值为
0.074 66，浓度为 0.009 g/L，换算为加酶黄酮提取液浓
度为 1.125 g/L，质量为 562.5 mg，含量为 5.625 ％；同样
计算不加酶黄酮提取液浓度为 1.000 g/L，质量为 500mg，
含量为 5.000 ％。 标准液与提取液浓度与吸光值如表
1、图 1所示。
2.2 DPPH·自由基的清除
准确称取 2.5 mg DPPH·溶于 100 mL 甲醇， 配制
为浓度 0.025 g/L DPPH·紫色溶液。
分别配制紫苏残渣黄酮提取液为 0.04、0.2、0.36、
表 1 芦丁不同浓度标准液及紫苏残渣加酶、不加酶提取液吸光值
Table 1 Absorption value of Rutin different concentrations of
standards and enzymatic extract/non- enzymatic extract of Perilla
residue
吸光值
Absorption value
0
0.040 14
0.071 23
0.145 44
0.177 17
0.261 96
0.305 95
0.065 84
0.074 66
浓度/（g/L）
Concentration/（g/L）
0
0.004
0.008
0.016
0.024
0.032
0.04
1.000
1.125
样品
Sample
芦丁不同浓度标准液
Rutin different concentration
of standards
紫苏残渣提取液 Perilla residue extract
紫苏残渣加酶提取液
Enzymatic Extract of Perilla residue
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0.52、0.68、0.84、1 g/L 浓度， 将不同浓度的黄酮提取
液每次取 2 个平行样，重复测定 2 次吸光值取平均值
如表 2，按 1.2.3 中公式对 DPPH·自由基清除率如图2
所示。
由表 2、图 2可知，紫苏残渣黄酮提取液具有较强
的抗氧化性，在 0.52 g/L浓度时，对 DPPH·自由基的清
除率时达到 52.44 ％， 且加入提取液的浓度与清除率
在一定范围内呈正相关， 0.04 g/L 浓度时即有约 10 ％
清除作用，在 1 g/L时高达 87.77％。
2.3 加速氧化试验
配制 0.52 g/L的紫苏残渣黄酮提取液， 分别在 60℃
温育 1、2、3、4、5d后，以 UV 法测定含量，每次取 2个平
行样， 取平均值为该次测定值。 标准曲线的回归方程
为 A =11.403C－0.006 1，R2＝0.997 6，其含量变化如图 3
所示。
60℃温育 1、2、3、4、5 d 后紫苏残渣黄酮提取液对
DPPH·自由基的清除率，如图 4所示。
连续进行 5 d 的加速氧化试验， 以一般温度每上
升 10℃， 反应速度加快 2倍~3倍， 常温为 25℃为标
准， 则 60 ℃时的反应速度为常温时的 （23.5－33.5，即
11.3倍~46.8倍），则相当于自然存放时间 56.5 d～234 d
的试验。由图 3、图 4 可知，随着加速氧化实验时间的
增加，紫苏残渣黄酮含量呈下降趋势，但温育 60 ℃、
5 d 即相当于自然存放 56.5 d～234 d， 黄酮含量仍有
0.33 g/L， 比原样的 0.52 g/L 降低了 36 ％；DPPH·自由
基清除率也随之有所降低， 在 60 ℃温育 1 d、2 d 时，
DPPH·自由基清除率甚至升高到 64.05 ％、59.75 ％，而
所测黄酮含量是降低的， 分别为 0.44 g/L、0.34 g/L，说
明在 60 ℃温育时，提取液成分发生了化学反应，生成
了更多具抗氧化性的物质； 在 60 ℃温育 3、4、5d 后
DPPH·自由基清除率基本稳定，保持在约 40 ％的较高
清除率。
2.4 溶液 pH值对紫苏残渣黄酮提取液稳定性的影响
配制 0.52 g/L 的紫苏残渣黄酮提取液，分别调 pH
值至 2、4、6、8、10、12，以 UV 法测定含量，每次取 2 个
平行样， 取平均值为该次测定值。 标准曲线的回归方
程为 A =11.403C－0.006 1，R2＝0.997 6，其含量变化如图
5所示。 不同 pH 值紫苏残渣黄酮提取液对 DPPH·自
由基的清除率，如图 6所示。
表 2 不同浓度紫苏残渣黄酮提取液在 DPPH·体系中的吸光值
Table 2 Absorption value of different concentration of Perilla residue flavonoids extract in DPPH·system
吸光值 A
A1平均值 Average of A1
A0平均值 Average of A0
清除率/% Removal rate/%
紫苏残渣黄酮提取液浓度/（g/L）
Concentration of Perilla residue flavonoids extract/（g/L）
0.04
0.610 41
0.678 99
10.10
0.2
0.535 88
0.678 62
21.03
0.68
0.169 71
0.505 73
66.44
0.36
0.324 93
0.518 12
37.29
0.52
0.243 15
0.511 27
52.44
0.84
0.101 6
0.499 59
79.66
1
0.060 33
0.493 37
87.77
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由图 5、 图 6可知，0.52 g/L 的紫苏残渣黄酮提取
液在 pH2~10 时含量较稳定，略有所下降，在 pH12 时
含量为 0.26 g/L，下降了一半。可能因为是用 90％乙醇
体系提取的紫苏残渣，故提取液黄酮在高浓度乙醇溶
液中含量较稳定，受 pH影响较小。 而紫苏残渣黄酮提
取液对 DPPH·自由基的清除率在溶液 pH4~10 范围内
较稳定， 在 pH2、pH12由 52.44％分别下降为 26.46 ％
和 25.52，几乎下降一半，但仍有较强的清除能力。原因
分析同上，可能是高浓度乙醇溶液（90 ％）提取的紫苏
残渣黄酮，受 pH值影响较小。
3 讨论
黄酮类化合物具有抗氧化活性主要是通过酚羟基
与自由基反应形成稳定的半醌式自由基结构， 其抗氧
化活性的强弱与羟基是否能形成稳定的自由基结构有
关，B 环上邻二酚羟基的存在是决定其抗氧化活性的
主要因素[9-10]。 酶在植物提取中的作用是使植物材料降
解形成更疏散的结构，使有效成分最大限度地溶出，达
到更高的提取收率； 通过降低持水率使滤液过滤时滤
渣释放出更多的水或溶剂， 即使溶液浓缩/蒸发液降
粘，提高有效成分收率及回收溶剂量，降低生产成本。
紫苏叶经水溶液浸提、水蒸气蒸馏提取挥发油后
剩下的残渣， 采用 90 ％乙醇浸提残渣中的有效成
分——黄酮类化合物。 采取复合酶促提取， 对比产率
表明经复合酶促提取比不加酶提取的黄酮收率较高；
通过 DPPH·自由基清除试验说明，紫苏残渣黄酮提取
液有较强的抗氧化性。 连续进行 60℃温育 5 d的加速
氧化试验，相当于自然存放时间 56.5 d～234 d 的试验，
表明紫苏残渣黄酮提取液具有较长期的稳定性，其含
量随着时间的延长有所降低，但仍有较强的抗氧化性，
在 60℃温育 1 d、2 d时，DPPH.自由基清除率甚至升高
到 64.05 ％、59.75 ％，而所测黄酮含量是降低的，分别
为 0.44 g/L、0.34 g/L，说明在 60 ℃温育时，提取液成分
发生了化学反应， 生成了其他具抗氧化性的物质；在
60 ℃温育 3、4、5 d 后 DPPH·自由基清除率基本稳定，
保持在约 40 ％的较高清除率；pH 值影响稳定性实验
表明，紫苏残渣黄酮含量在 pH2~10较稳定，对 DPPH·
自由基的清除能力在 pH4~10 较稳定。 可能因为是用
90 ％乙醇体系提取的紫苏残渣，故提取液黄酮在高浓
度乙醇溶液中含量较稳定，受 pH 影响较小。 据此，采
用复合酶促提取这种安全有效的催化提取前处理、
90 ％乙醇提取的紫苏残渣黄酮收率高、 抗氧化性强、
热稳定性好、pH2～10含量较稳定、pH4～10抗氧化性较
稳定。 而紫苏挥发油在香精香料行业应用广泛， 上述
研究表明，对于综合合理有效利用香料工业紫苏残渣，
提取有效成分进行再利用，是具有可行性的。
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