全 文 ：植物生理学通讯 第45卷 第7期，2009年7月 657
收稿 2009-03-18修定 　2009-06-01
* 通讯作者(E-mail: limy@swu.edu.cn; Tel: 023-68251250)。
彩叶草中一个富亮氨酸重复相关蛋白基因SsLRP的克隆和分析
祝钦泷1,2, 李名扬2,*
1华南农业大学生命科学学院, 广东省植物功能基因组与生物技术重点实验室, 广州510642; 2西南大学园艺园林学院, 西南
大学花卉研究所, 重庆400716
提要: 根据彩叶草叶片小型EST库中一条具有1个富亮氨酸重复(leucine-rich repeat, LRR)结构域的EST序列, 采用RACE
与文库结合的方法, 克隆了1个具有5个LRR结构域的全长cDNA, SsLRP (LRR-Related Protein) (GenBank登录号FJ787729)。
SsLRP cDNA全长1 024 bp, 包含一个657 bp的ORF框, 编码218个氨基酸。其5’-UTR区含有2个终止子TAG, 3’-UTR区
具有推测的加尾信号AATAAA。SsLRP蛋白N端具有的信号肽和保守的亮氨酸拉链结构域, 具有5个保守的LRR结构域,
多个磷酸化位点和N-糖基化位点。多序列比对和系统进化分析表明, SsLRP与番茄SlLRP同源性最高。二级结构和三级
结构预测表明, SsLRP的功能可能与保守的LRR结构域密切相关, 推测该基因可能参与蛋白间的相互作用与信号识别。RT-
PCR分析表明, SsLRP与番茄SlLRP具有相似的表达模式, 在正常植株的根、茎、叶和花中都有表达, 在受菌核病感染植株
的茎和叶中表达上调。
关键词: 彩叶草; 富亮氨酸重复蛋白; SsLRP基因
Molecular Cloning and Analysis of a Novel Leucine-Rich Repeat Related Pro-
tein Gene, SsLRP, from Solenostemon scutellarioides (L.) Codd
ZHU Qin-Long1,2, LI Ming-Yang2,*
1Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Biotechnology of Guangdong Province, College of Life Sciences, South China
Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2Institute of Ornament Plants, College of Horticulture and Landscape, South-
west University, Chongqing 400716, China
Abstract: According to a EST sequence with a LRR (leucine-rich repeat) domain from Solenostemon
scutellarioides, a novel leucine-rich repeat prelated rotein (LRP) gene with 5 LRRs, denoted SsLRP (GenBank
Accession No. FJ787729), was rapidly cloned using a strategy of RACE combined with cDNA library. The full
length of SsLRP was 1 024 bp and contained a 657 bp open reading frame (ORF) encoding a 218 amino acid
protein. Two stop codons (TAG) were found in 5’-UTR and one possible polyadenylation signal, AATAAA,
was found in 3’-UTR. The SsLRP contained a predicted signal peptide and a conserved LZ (leucine zipper)
domain in the N-terminal region, five conserved LRR domains, and multiple phosphorylation sites and N-linked
glycosylation sites. Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis showed that SsLRP shared high
homology with tomato SlLRP, and belonged to the same subfamilies of LRPs. The prediction analysis of sec-
ondary structure and three dimensional structures of SsLRP showed that the possible function of the protein
was decided by the multiple LRR domains, and involved in protein-protein interactions and signal perception.
The RT-PCR analysis showed that SsLRP and SlLRP had the same expression pattern. SsLRP was expressed in
all normal tissues, and up-regulated at high levels in diseased steam and leaves infected with Sclerotinia
sclerotiorum.
Key words: Solenostemon scutellarioides; leucine-rich repeat protein; SsLRP
植物特异的富亮氨酸重复蛋白(leucine-rich re-
peat protein, LRR)大多具有相似或相同的功能, 直
接参与对病原体的识别和信号转导(Kobe和Kajava
2001), 主要包括LRR型的类受体蛋白激酶(LRR re-
ceptor-like protein kinase, LRR-RLK)、抗病基因编
码的蛋白(disease-resistance proteins, R)、多聚半
乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase-inhibiting
protein, PGIP)和LRR相关蛋白(LRR-related protein,
LRP)等。LRR-RLK参与植物体应答逆境和与防御
相关的过程, 与抗逆性反应、调节植物发育和介导
植物激素信号转导相关, 如水稻抗白叶枯病基因
DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2009.07.025
植物生理学通讯 第45卷 第7期，2009年7月658
Xa21的胞外LRR结构能够特异识别配体, 诱导胞
内激酶磷酸化, 保护水稻免受病原菌的侵害(Wang
等2004); 拟南芥AtSERK1基因具有5个LRR结构,
参与了胚胎发育的调节和相关信号传导(Hecht等
2001)。已克隆的R基因参与细胞对病原体的防御,
基本上都具有LRR这一共同的结构, 通过该结构与
不同病原体的特异识别, 参与病原的识别过程(王友
红等2005)。抗真菌的PGIP基因与多聚半乳糖醛
酸酶(polygalacturonase, PG)的相互作用也是通过
LRR介导的特异识别完成的(蒋豪和汤浩茹2008)。
LRPs大多为防卫反应相关蛋白, 主要以LRRs为功
能单位直接参与防卫反应的信号识别, 如高粱SLRP
基因是防卫反应相关基因(Hipskind等1996); 番茄
SlLRP基因受发育调控, 参与正常状态下或受病原
侵染时的信号识别过程(Tornero等1996); 辣椒
CaLRP1基因参与应答逆境胁迫信号转导, 是韧皮
部特异的病原诱导表达基因(Jung等2004); 烟草的
NtLRP1基因参与了病原诱导的过敏反应的信号识
别(Jacques等2006), NtLRP2基因参与逆境胁迫信
号转导, 在病毒侵染和盐胁迫下表达上调(Xu等
2009)。
彩叶草是唇形花科鞘蕊花属草本观叶植物, 广
泛用于园林绿化, 具有较强的抗病性, 至今关于彩
叶草抗病性的研究很少。为此我们构建了彩叶草
叶片cDNA文库(祝钦泷等2007a), 通过RACE与文
库结合的方法(祝钦泷等2007b), 首次从彩叶草叶片
中分离到一个可能参与防卫反应信号识别的SsLRP
蛋白基因。
材料与方法
从彩叶草[Solenostemon scutellarioides (L.)
Codd]红色品种‘C4’构建的小型EST库中, 经测序
和BLASTx比对分析, 获得一条426 bp的具有1个
LRR结构域的EST序列。采用RACE和文库结合
的方法, 快速分离目的基因。根据该EST序列设
计2条基因特异引物(GSP), 5’ GSP1 (5 GAT-
GTGCTCAAATGGACCACTGGAAGG 3)和5’ GPS2
(5 GGAGACATCTATAACTTTCAAGGTAG 3), 分
别与文库载体上5端的2条特异引物5’ P (5’
TriplEx sequencing primer: 5 TCCGAGATC-
TGGACGAGC 3) 和 5’ NP (5 TriplEx LD-Insert
screening primer: 5 CTCGGGAAGCGCGCCATTG-
TGTTGGT 3)配对进行5’ RACE, 扩增目的基因的
5端。在50 mL体系中, 用1 mL 稀释100×的原始
文库为模板, 以5’ GSP1 和 5’ P为引物, 进行第1次
扩增; 再用一扩产物0.5 mL为模板, 引物 5’ GSP2
和5’ NP进行第2次扩增。2次PCR反应采用相
同的TD-PCR (降落PCR)条件: 95 ℃变性10 min,
裂解噬菌体, 加入PCR 反应混合物, 并按以下程序
扩增: 94 ℃变性4 min; 94 ℃变性1 min, 65~55 ℃退
火1 min (每循环下降0.5 ℃), 72 ℃延伸2 min, 20
个循环; 94 ℃变性1 min, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延
伸2 min, 15循环; 72 ℃延伸10 min。根据5端序
列, 设计特异引物FLRP (5 GCCGATTCTCCTTT-
TAACATTTTTGCTTTTATTGC 3)和载体上3端
的特异引物3’ P (3’ TriplEx LD-Insert screening
prime: 5 TAATCGACTCACTATAGGGCGAATTGG
3)直接扩增全长cDNA。纯化PCR产物, 连接于
克隆载体pMD18-T, 送上海生工公司测序。
生物信息学分析主要采用Vector NTI Suite 10.0
软件及网上软件包进行。BLAST分析、ORF的
查找、核苷酸的翻译以及蛋白保守结构域搜索, 均
在在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上进
行。应用ExPASy (http://www.expasy.ch/)提供的
ProtParam程序对推测的SsLRP编码蛋白进行相对
分子量、等电点(pI)等基本特征的运算; 在网站
http://www.expasy.org、http://www.softberry.
com/、http://www.cbs.dtu.dk/services/和http: /
psort.nibb.ac.jp/form.html上, 用相关软件进行综合
预测分析编码蛋白的基本性质、结构特点、亚细
胞定位、磷酸化位点等; SsLRP蛋白二级结构预测
采用SOPMA程序分析, 三级结构预测采用SWISS-
MODEL的同源建模, 用PyMol software软件显示。
用Invitrogen的Trizol试剂提取彩叶草根、茎、
叶、花以及受菌核病感染植株的茎和叶的总RNA,
用Promega的M-MuLV逆转录酶进行cDNA第一
链合成。以彩叶草Action (GenBank登录号DQ42
3374)为对照, 进行半定量RT-PCR分析。SsLRP使
用ORF引物lrp1 (5 ATGGCGGGGAGAGGAG-
ATTT CT和lrp2 (5 TTAAGAACAGTTT-
GTATCATAACTA GCA 3)进行30个循环的扩增,
Action采用引物actin1 (5 CTCGGCAGTTGTGGT-
AAACATG 3) 和 actin2 (5 CCGTGTCGCTCCTG-
AA AGC 3)进行24个循环的扩增。
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结果与讨论
1 彩叶草SsLRP全长cDNA的克隆及序列特征
通过RACE和文库结合的方式, 以1 mL稀释
100×的原始文库为模板, 经5’ RACE获得了一条
约650 bp左右的片段, 测序后BLASTx比对和拼接
表明该片段为SsLRP的5端。用5端特异引物与
3’ P, 以稀释100×的原始文库为模板进行全长扩增,
获得一条约1.0 kb的cDNA片段, 测序后用BLASTx
比对表明, 该片段编码的推测蛋白与番茄SlLRP
(GenBank登录号CAA64565)有高达87%的同源性,
确定为彩叶草富亮氨酸重复相关蛋白SsLRP基
因。SsLRP (GenBank登录号FJ787729)全长cDNA
为1 026 bp, 由127 bp (1~127bp)的5-UTR (5
untranslated region)、242 bp (785~1 026 bp, 包括
32 bp的polyA结构)的3-UTR及657 bp (128~784
bp)编码218 aa的ORF框组成(图1)。SsLRP 5和
3-UTR富含A+T, 各占其碱基的55%和71%, 比
ORF区域高(53%), 与其他植物基因很相似(Liu等
2003)。位于125~131 bp的ATG及邻近序列
(GCCATGG)符合真核生物起始密码ATG预测保守
序列(A/GXXATGG) (Kozak等1984), 同时在5-UTR
中还发现位于65~67 bp和113~115 bp的2个终止
密码TGA, 进一步确认该ATG为起始密码(图1)。
在PolyA上游23 bp处有典型的加尾信号
“AATAAA”(图1)。
图1 SsLRP的核酸序列及其推测的氨基酸序列和结构
Fig.1 cDNA sequence, the deduced amino acid sequence and structure of SsLRP
起始密码子和终止密码子用粗体表示, 5-UTR区的2个终止子用下波浪线表示; 虚线部分为27个氨基酸的信号肽; 箭头表示信
号肽剪切位点; 方框中为N端保守的亮氨酸拉链结构域, 其中保守的亮氨酸用粗体表示; 阴影部分表示保守的LRR结构域, 其中保守
氨基酸用黑体表示; 粗体加单下划线表示推测的磷酸化位点; 粗体加双下划线表示推测的N-糖基化位点; 加尾信号 “AATAAA”用粗
体加单下划线表示。
2 彩叶草SsLRP蛋白的基本特征、同源比对和
高级结构预测分析
SsLRP编码一个218 aa的蛋白, 分子量为23.76
kDa, 等电点pI=5.11, 为酸性蛋白, 其中亮氨酸含量
很高, 占整个氨基酸量的16.97%, 为富亮氨酸蛋
白。SsLRP中极性氨基酸和疏水氨基酸比例很高,
均为氨基酸总量的33.03%, 利用ProtScale分析其
疏水性, 显示SsLRP蛋白中疏水性最大值是2.878
(第12位aa), 最小值为-2.033 (第201、202位aa),
N端存在一个大的疏水区域(第5~19位aa), 但总体
植物生理学通讯 第45卷 第7期，2009年7月660
为亲水蛋白。Tmpred的跨膜结构预测表明在N端
疏水区内(第7~23位aa)具有跨膜结构。SignalP 3.0
预测显示SsLRP N端具27个氨基酸的信号肽, 正
好位于疏水区的跨膜结构中, 是一个分泌蛋白。
TargetP预测显示SsLRP最可能定位于细胞的分泌
途径(细胞外基质)。NetPhos 2.0 Server的磷酸化
位点预测与N-糖基化位点预测显示, SsLRP蛋白有
6个Ser磷酸化位点、3个Thr磷酸化位点、2个
Tyr磷酸化位点和2个N-糖基化位点(图1), 这些位
点的存在说明蛋白翻译后修饰在实现SsLRP蛋白
的功能中起重要作用。ProtScale和CDS保守结构
域搜索表明, SsLRP蛋白N端具有一个高度保守的
亮氨酸拉链结构域(LZ, leucine zipper: Lxxxxxx
LxxxxxxLxxxxxxLxxxxxx), 中部和C端具有5个
保守的LRR结构域(LxxLxxLxxLxLxNx
LxGxIPxx) (图1)。SsLRP蛋白5个保守的LRRs
中, 除第1个不完整外, 其余4个高度保守(图1)。
SsLRP蛋白在整个结构上与一些已被研究的LRP
蛋白高度一致(图2), 暗示SsLRP可能具有与它们
一致或相近的功能。
用NCBI的BLASTp程序以及Vector NT I Suite
10.0软件的分析表明, SsLRP蛋白序列与许多已知
的植物富亮氨酸重复相关蛋白(LRP)具有较高的同
源性(图2), 其中与番茄(Solanum lycopersicum)的
SlLRP同源性最高达87%, 与水稻(Oryza sativa)、
拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小麦(Tr ticum
aestivum)、辣椒(Capsicum annuum)和烟草
(Nicotiana tabacum)等也具有较高的同源性, 同源
性在60%~83%之间。并且, SsLRP蛋白与这些
LRP在功能结构域、磷酸化位点和糖基化位点上
表现出高度的一致性(图2), 推测它们具有相同的功
能和相似的蛋白后修饰方式。
SOPMA二级结构预测表明SsLRP蛋白主要由
a螺旋、随机卷曲、b折叠和延伸链组成。SsLRP
与不同LRPs蛋白二级结构比较显示: 在LZ结构域
中均含 a1螺旋, 除第1个LRR单元只有一个 b折
图2 SsLRP蛋白与同源蛋白的多序列比对
Fig.2 The multiple sequence alignment of SsLRP with homologous proteins
保守的N端亮氨酸拉链结构域(LZ)和LRR结构域用粗的方框表示; 粗圆点表示保守的氨基酸; 三角符号表示保守的磷酸化位点;
菱形符号表示保守的N-糖基化位点; 黑色背景表示完全一样的氨基酸序列。序列上面深灰色方框代表 a螺旋; 箭头代表 b折叠, 除
第1个LRR外, 其余保守的LRR结构均包括1个 b折叠和1个 a螺旋。
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叠外, 其余4个LRR单元均由一个b折叠和一个a
螺旋组成, 它们二级结构几乎完全一致(图2)。用
已知晶体结构的菜豆PGIP2 (Di Matteo等2003)为
模板, 使用SWISS-MODEL同源建模, 得到SsLRP
蛋白与SlLRP蛋白的三级结构(图3)。SsLRP蛋白
由5个a螺旋和6个 b折叠组成, 除第1个LRR单
元只有一个b折叠外, 其余4个LRR单元中每一个
都包含一个b折叠和一个相平行的a螺旋, 由loop
环连接形成一个发夹状的结构。并且所有LRR单
元均以一个共同的轴平行排列, 形成一个凹面为b
折叠、凸面为a螺旋的非球状的马蹄形分子结构,
在这种结构中, 保守的亮氨酸残基形成一个与配体
相结合的疏水性的核心, 而其他非保守性的氨基酸
残基则暴露在马蹄形分子的外周。SsLRP中的LZ
结构域和LRRs形成的非球状马蹄形分子结构, 都
是理想的介导蛋白之间相互作用的结构(Landschulz
等1988; Forrer等2003)。SsLRP蛋白的这一结构
特征与菜豆PGIP2的LRR结构和其它植物LRPs蛋
图3 用SWISS-MODEL同源建模推测的SsLRP蛋白和番茄SlLRP蛋白三维结构
Fig.3 3-D structure of deduced SsLRP and SlLRP from tomato by SWISS-MODEL homology-modeling
图4 用邻位相连法构建的SsLRP蛋白与其它植物LRR蛋白的系统发生树
Fig.4 Neighbor joining phylogenetic tree of SsLRP and LRRs from other plants
植物生理学通讯 第45卷 第7期，2009年7月662
白预测结构非常相似, 与番茄SlLRP蛋白的三级预
测结构几乎完全一致(图3), 因而进一步推测SsLRP
蛋白与SlLRP蛋白具有相同的功能, 参与蛋白间的
相互作用与信号识别。
3 彩叶草SsLRP蛋白的系统进化树分析
在多序列比对的基础上, 用SsLRP蛋白序列和
植物的4种类型LRRs蛋白序列构建了系统发生树
(图4)。系统树中, 不同类型的LRRs蛋白聚为一
组, SsLRP属于LRP一类, 并且和番茄、拟南芥和
水稻聚为一小支, 说明SsLRP与它们可能具有相同
的功能。另外, LRP蛋白与LRR型的类受体激酶
SERK (体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶)处于
同一大支, 暗示着LRP蛋白可能具有与SERK 蛋白
相似的参与发育调节的某些信号传导功能。
4 彩叶草SsLRP基因的RT-PCR分析
提取正常生长植株的根、茎、叶、花的
m R N A以及受菌核病感染的植株的茎和叶的
mRNA, 分别反转录为cDNA后对SsLRP做半定量
的RT-PCR比较分析。如图5所示, SsLRP在正常
植株中是组成型表达的, 其中在茎中最弱, 花中最
强; 而在感病植株的茎和叶中, 表达上调。SsLRP
的表达模式与大多数LRP基因相似, 与番茄SlLRP
基因相同, 都在正常植株表达, 在感病植株中表达
上调, 因此推测SsLRP可能参与正常状态下或受病
原侵染时的信号识别过程。
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