全 文 ：第 34 卷 第 1 期
1 9 9 5 年 l 月
厦 门大学学报 ( 自然科学版 )
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a l o f X ia m e n U h iv e sr i t y ( N a t u r a l 段 ie n e e )
从〕1. 3 4 N o
J a n
.
1 9 9 5
+ 种 (株 )杜氏藻 各胡萝 卜素的提取及含量比较①
刘广发 , 楼士林 ` 游兰英 2 何斌源 ` 赖瑞卿 ,
( ’ 厦门大学生物学系 2厦门医药研究所 )
摘要 建立了从杜氏藻鲜藻中直接提取 、 纯化 件胡萝 卜素及决速检测其含量的新方法 . 发现在
十种 (株 )杜氏藻 D口划肠从通八刀公汰` Z中生成 件胡萝 卜素的量最高 , 达藻干重的 4 . 19 % ,在最佳条件下可
达 13 % . 经动物急性毒性实验测得小鼠对杜氏藻各胡萝 卜素的最大耐受量 > 240 gm · 吨一 ’ .
关键词 杜氏藻 OD 主汤 e故边 , 卜胡罗 卜素 , 毒性
中国图书分类号 Q 94 .6 8
件胡萝 卜素是一种橙红至淡黄色 ( 因浓度而异 ) 的天然色素 , 在食品 、 医疗及保健等方面具
广泛的用途 〔,一 5〕 . 虽然人们早已用工业合成法生产出 昆胡萝 卜素 , 但在 “ 回归 自然 ” 的大趋势影
响下 , 生物合成的天然 俘胡萝 卜素受到人们的普遍欢迎 . 不过 , 绝大多数植物的胡萝 卜素含量
都很低 , 即使是胡萝 卜中的胡萝 卜素含量也仅为万分之四闹 . 经过不懈的努力 , 科学家发现 .v[ 8〕
生长于高盐环境中的某些单胞绿藻— 杜 氏藻 ( D 口司汾左玫) 含有高浓度的 各胡萝 卜素 . 本文作者搜集了十种 (株 )杜 氏藻 , 用改进的 件胡萝 卜素提取方法及计算方法 比较了它们 件胡萝 卜素含
量的差异 , 并以提取的 件胡萝 卜素进行小 白鼠急性毒性实验 . 希望本工作能对杜氏藻的养殖业
产生积极的影响 .
1 材料与方法
藻 种和培养条件 十种 (株 ) 杜氏藻分别由青岛海洋大学应用微藻研究室 、 新加坡李元昆
教授和以色列 M iG n bz u gr 博士等提供 (藻种名见表 2 ) ,在改进了的 & n 一 A m o tz 图培养基中连
续强光培养 7 d 后备用 .
溶剂的选择 将表 1 所列各溶剂分别与 D 反刃汉欢“ l 鲜藻泥按 0 . 5 闹 , l gm 的比例混合 ,
振荡 ,离心 , 得含 件胡萝 卜素的上清液 . 在 日本岛津 vu 一 24 0 紫外可见光分光光度计上读取并 比
较各样液的 O D ; 5 3值 .
件胡萝 卜素的提取 与鉴 定 及 反刀汉双心 1 0 0 0 0 IJ 4 0 0 0
r / im
n 藻泥 : 丙酮 一 1 蝴 , 0 . 5 耐~一 - - -- - 刁卜 - - -- - - - - - - -- - - - ,3 0 C 7 d 5 ha n 藻泥 振荡 , 离心 , 重复一次离 心 得 粗提 液 加 1 / 10 体积的 60 % ( :侧v ) (K ) H〔 , 飞振荡 、静置分层 . 弃水层 重 复 三 次 , 合 并 粗 提 液 加少量石油 醚振荡 , 弃丙酮层 萃 取 液
蒸馏水洗涤三次一- 一 ~- -一一 ~ 一- 书卜弃水层 萃 取液 5 0 C,一一一- . 卜减压浓缩 浓萃取 液一 活 性 氧 化 铝 柱还型三竺塑翌燮鳖二洗 脱 液
5 0 C
-一一- 一 - 一一J卜减压浓缩 第二次过柱洗脱二黑兰产深红色提取物峨庄下煤 宝垦塑迪塑鲤迪鹭测吸收光谱 . 全过程在弱
① 本文 1 994 一 01 一 13 收到
第 1 期 刘广发等 : 十种 (株 )杜氏藻卜胡萝 卜素的提取及含量比较
光下进行 .
俘胡萝 卜素含量测定 准确称取德国 .E 嫉kr 公司的纯品 俘胡萝 卜素 , 定溶于 90 %丙酮
中 , 系列稀释后制标准曲线 . 各藻经培养 , 离心后得鲜藻泥 , 以吸水纸吸干后称鲜重 . 每毫克鲜
藻加 0 . 5 而 90 %丙酮振荡 、 萃取 , 离心后读取上清液的 O D 4 5 3值 . 依标准曲线并根据以下公式
计算各藻的 件胡萝 卜素含量 :
件胡萝 卜素含量 ( %鲜重 ) ~ 样液 O D
月5 3对应浓度 ( m ol · L一 ’ ) X 提取液量 ( )L X 5 36 89 。
藻 鲜 重 (mg )
X 1 0 0%
。 一一 . ~ * 。 , 。 , 一 ~ 、 样液 O D 4 s 3对应浓度 (mo l · L一 , ) 又提取液量 ( )L 火 5 3 6 8 90 、 , _ _ 。 /压胡葵 卜素 户含倡 . ( % 干甭 ) 一 二止一匕性于份分一二于一份一子牛 ,胜飞旦~ 一 ` ` 二二二~二二二 X 1 0 O%。 , 』夕 一 , 。 二 、 / U · 二 · 藻 鲜 重 ( gm ) X O· 3 2式中 , “ 0 . 32 ” 为杜氏藻的烘干系数 , “ 5 36 89 0 ” 为每摩尔 件胡萝 卜素的毫克数 .杜 氏藻 件胡萝 卜素的动物急性毒性实验 由厦大抗癌中心提供昆明种小白鼠 14 只 ,体重18 一 2 0 9, 雌雄各半一次灌胃 2 40 m g · 吨一 `剂量的杜氏藻 各胡 萝 卜素 , 正常饲养连续观察 7
d
. 于第 8 天解剖实验鼠 , 肉眼观察主要脏器有否异常 .
2 结果与分析
从鲜杜氏藻中直接提取 件胡萝 卜素的最佳溶剂选择 各胡萝 卜素是脂溶性 q 。砧类化合
物 , 在石油醚等非极性溶剂中溶解度很高 . 提取植物中的 件胡萝 卜素前人主要有 “ 干法 ” 和 “ 湿
法 ” 两种 〔’ · ` 。〕 . 前者需先将藻烘干再用乙醚提取 , 件胡萝 卜素在长 时间高温富氧条件下损失颇
多 ;后者使用的正 已烷价格高 , 不适用于大批量生产 . 鉴于鲜藻中含有约 68 %的水份 , 必然影
响各溶剂的抽提率 , 本文特设多种溶剂提取 比较 . 实验表明 (表 1 ) , 丙酮是直接提取杜氏藻鲜
藻中件胡萝 卜素的最有效试剂 .
表 1 九种溶剂提取鲜杜氏藻中卜胡萝 卜素的效率比较
aT b
.
1 A
e
om 脚 r iso n o f t阮 e x t r a e r i n g e f f ie ie n e y o f 件 e a r o t e n e f r o m l he f r es h D 加叮板川 场 9 印 Iv e n r s
溶剂 甲醇 石油醚
:
90 %丙酮
( 7 : 3 训 v )
含乙醇 3%
的正己烷
丙酮 (训 v)乙醚
O 〔〕45 3 0 . 4 8 0 0 . 2 5 6 0 . 5 1 8 0 . 1 2 2
1 0 0%
0
.
6 6 7
9 0 %
0
.
6 4 1
8 0%
0
.
5 8 8
6 0%
0
.
4 7 7
3 0%
0
.
3 0 3
因此 , 以下大量提取杜 氏藻 件胡萝 卜素的实验都以纯丙酮为溶剂 . 由于纯丙酮挥发性较强 , 不
利于 比色测定 的准确性 , 所以在定量检测各藻种 ( 株 ) 的 各胡萝 卜素含量时以 90 %丙酮为溶
剂 . 尽管 各胡萝 卜素在各溶剂中的最大吸收峰值略有差别 , 但都很接近 O D 45 3 , 不影响测定结
果 .
杜 氏藻 D 反军过双 ` l 深红色提取物的光谱分析 图 1 的两图分别是本实验提取物与样品 件
胡萝 卜素在丙酮 (左 ) 和石油醚 (右 ) 中的吸收光谱 . 两图中三个特异性吸收峰完全相 同 , 可见这
种深红色提取物就是 各胡萝 卜素 l[ `〕 . 此外 , 两图中都没有 出现叶绿素 a , 叶绿素 b 以及 叶黄素
在波长 4 2 0一 4 7 0 n m 、 6 3 0一 6 7 0 n m 和 4 2 0 、 4 4 7 、 4 7 7 n m 的吸收峰 ,说明活性氧化铝柱对各色素
的分离效果令人满意 . 经计算 , 其纯度 已达 94 肠 . 如能在减压浓缩和干燥过程中导人氮气 , 进
一步改进层析柱和洗脱剂 , 则可除去夹杂的 a 一 、 7 一胡萝 卜素和其它痕量 色素 , 获得纯度很高的
件胡萝 卜素 .
十种 (株 ) 杜氏藻 件胡萝 卜素含量比较测定 为了进行 件胡萝 卜素含量测定 , 先以 90 %丙
酮为溶剂 , 制得 各胡萝 卜素标准曲线如图 2 .
厦门大学学报 (自然科学版 ) 1 9 9 5 年
、、 、产
入 / n r一、
图 1 及 如翻汰川 的深红色提取物和样品各胡萝 卜素在丙酮 (左 )和石油醚 (右 )中的可见光吸收光谱比较
— 样品卜胡萝 卜素 · · · “ · … D 6刀过口衬提取物F ig 1 A e o m印 r i o n o f v iis b le ligh t a腼 r p r io n s lx 笙 t r a 悦 . w e e n t悦 r记 e x tar e it v e o f D 6万云比` 1 a n d血 e onue 二 ia lp u r i fide 件 e a or r e n e id o lv de i n a e e ot n e ( le f t ) a n d ligh t 详 tor le u m ( r i gh t )
根据标准曲线图和各杜 氏藻提取液的
ó洲之
O D
4 s 3测定值 , 按上述计算公式即可迅速大
量地对各种 (株 )杜氏藻的 件胡萝 卜素含量
进行相当准确的测定 . 本方法的建立为生
产中筛选高产 件胡萝 卜素的杜氏藻提供了
切实可行的捷径 .
根据上述检测方法 , 我们检测 了十种
(株 )杜氏藻的 件胡萝 卜素含量 ,结果 (四次
重复 )列于表 .2
由表 2 可以看出 , D 加叮扮厅l 所含 各
胡萝 卜素量最高 , 达藻干重 的 4 . 19 % , 但
第二位的 D s诫` 与之相差不大 . 这两种
杜氏藻的 件胡萝 卜素含量 比其它种 (株 )高
出 3 . 4 一 21 . 7 倍 . 据我们测算 (未发表 ) , 在
Z mo l
·
L一 `Na CI 的 玫 n 一八川。 tz 培养基中将
D 反刀刀坛石l 和 D s ab 、 分别培养至对数生
L) 5 6 1
.
12 !
.
6朽
, ,
m ul
·
L
2
.
2 4 2
.
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》 1 U . )
图 2
F i .g
仔胡萝 卜素的标准曲线 , 溶剂为 90 %丙酮 ( v/ v)
2 l h e s t a n ds dr
e u vr e o f 卜 e a r o r e n e iw rh t挽 印 Iv e n t
o
f 9 0 %
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ot
n e ( v /
v
)
长期 ,后者的生长速率是前者的 2 . 2 倍 . 因此在大规模养殖杜氏藻时 , 可考虑首选 D s诫护故 .
14 只小白鼠经杜 氏藻 件胡萝 卜素急性毒性实验后连续观察 7 d , 实验动物全部存活 , 饮
食 、 活动 、 排泄等均正常 ,且毛发光亮 , 未见毒性反应 . 解剖后观察主要脏器未见异常 . 测得小 白
鼠对杜氏藻 各胡萝 卜素的最大耐受量 > 2 40 m g · 吨一 ’ , 相当于人用剂量的 3 0 0 倍 , 可见该提
取物的安全范围是非常大的 .
第 1 期 刘广发等 : 十种 (株 )杜氏藻 件胡萝 卜素的提取及含量比较
表 2 十种 (株 )杜氏藻的件胡萝 卜素含量
aT b
.
2 A li
s t o f th
e 卜 e a r o r e n e le v e l o f t he t e n s l x ℃ ie s ( s t r a i n s ) o f D口目掩从之 t est 记
各胡萝 卜素浓 鲜 杜 氏 藻 中 干 杜 氏 藻 中
种 (株 )名 (兀〕。 3 度 mo l · L一 , 各胡萝 卜素含 件胡萝 卜素含 排次
( \ 1 0 一 5 ) 量 ( % ) 量 (纬 )
D 八万d滋心1 2 . 0 3 9 7 . 7 9 1 . 3 1 4 . 1 9 1
D s诫护欲 1 . 9 4 6 7 . 0 3 1 . 2 1 4 . 0 3 2
D 吞刃 d饭泛il ( 3 0 8 6 1 ) 0 . 5 9 3 1 . 2 4 0 . 3 8 1 . 2 2 3
D s苗护。 (G Z ) 0 . 4 3 4 0 . 7 6 0 . 2 8 0 . 9 0 4
D P -i冲 互蔽at 0 . 4 2 5 0 . 7 2 0 . 2 6 0 . 8 3 5
D 钾 cer 递 0 . 4 0 9 0 . 6 8 0 . 2 4 0 . 7 5 6
刀口盆心以勿 s单 0 . 3 8 3 0 . 6 5 0 . 2 2 0 . 6 9 7
D 加议二之凌勿 0 . 2 3 8 0 . 4 6 0 . 1 6 0 . 4 9 8
D ” a斑` a 0 . 1 4 7 0 . 3 8 0 . 0 8 0 . 2 5 9
D 抑 ,艘 0 . 1 2 6 0 . 2 5 0 . 0 6 0 . 1 9 1 0
实验中我们注意到 , 同是 D s ha 、 的两株杜氏藻 , 它们的 件胡萝 卜素含量 (干重 )相差达
4
.
5 倍 (4 . 03 : 0 . 90 ) , 不同来源的 D 八刀泛双之,’l 相差 3 . 4 倍 (4 . 1 9 , 1 . 2 2) . 这个现象提示 , 由于
杜氏藻是单倍体生物 , 它们在 自然条件下发生突变的可能性相对较大 , 上述差异也许就是这种
突变造成的 . 据此 , 实验工作者可以从 D s ha’, 。 和 D 反刀过双 d l中分离出各个单藻落 ,然后利用本
文建立的 件胡萝 卜素快速定量检测法分析各藻株 件胡萝 卜素含量的高低 , 精选其中的佼佼者
用于生产 ,将会产生很可观的经济效益 . 同时我们不满足于大 自然 的恩赐 , 对杜氏藻进行人工
诱变 ,相信将会得到更加高产 尽胡萝 卜素的藻株 .
自从发现杜氏藻含有较高浓度的 俘胡萝 卜素以来 ,有些科学家深人研究了有利于 件胡萝
卜素大量积累的士g养条件 , 指 出强光 、 高盐 、 低氮是促使杜氏藻 , 主要是 D s苗 7故 和 D 反刀“ 双 u’l
大量合成 件胡萝 卜素的三要素 . 但种种迹象显示 , 除此之外添加某些生长促进剂 、 抑制剂 、 特殊
前体化合物或某些微量元素 . 都可能影 响 各胡 萝 卜素的合成 . 这个尚待开发的领域很值得重
视 .
最后还应指出 , D s曲。 和 D 反军汉双` l 在本实验中合成 件胡萝 卜素的绝对量还不很高 , 这
是因为实验条件兼顾 了各种 (株 )杜氏藻生长需要的缘故 . 我们的另一项实验表明 (未发表 ) , 在
适宜的外因调控下 , 上述两种杜氏藻的 各胡萝 卜素含量可以高达藻干重的 13 % , 是胡萝 卜中
件胡萝 卜素含量的 32 5 倍 . 藻细胞由绿色转变成 了深红色 . 各胡萝 卜素含量如此之高的生物实
属罕见 . 不仅如此 ,杜氏藻的生长条件还相 当粗放 , 只要在海水或盐湖水中添加少量无机盐 , 就
能在 15 ~ 35 『C 中以每天约分裂一次的速度生长 . 据测算 L” 〕 , 杜氏藻室外全年养殖的生产率平
均可达 20 9 干藻粉 · m 一 2 · d 一 `或 。 . 25 9 胡萝 卜素 · m 一 2 · d 一 , (因培养 目的而异 ) . 因此美 、 澳 、
以 、 日等国已兴起大规模养殖杜 氏藻提取其 俘胡萝 卜素的产业 , 同时还可收获大量的蛋 白质和
.9 8
“ 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 1 9 9 5 年
甘油等副产物 . 我国具 18 0 0 余公里的海岸线 , 内陆还有星罗棋布的大小盐湖 , 我国的杜氏藻
养殖业也应早 日迎头赶上 .
参 考 文 献
赵学武 · 养殖盐藻生产件胡萝 卜素的研究概况 . 海洋药物 , 1 9 86 , 3 : 48 ~ 53
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