全 文 ：第29卷　第 2期　　　　　　　 　西南 大学学 报(自然科学版)　　　　　　　　　　　2007年2月
Vol. 29　N o. 2 Journal of Southw est Unive rsity (N atural Science Edi tion) Feb. 2007
文章编号:1000 - 2642(2007)02 - 0106 - 05
秋水仙碱诱变绿玉树多倍体研究①
李　政 , 　黄静洁 , 　李　凌
西南大学 园艺园林学院 , 重庆 400716
摘要:采用培养基添加法 、浸泡法以及先预培养后处理法对绿玉树丛生芽进行多倍体诱变. 结果表明:在培养基中
添加 0. 2%的秋水仙碱进行 14 d培养以及先预培养 3 d 再用 0. 2%秋水仙碱进行 24 h 处理法可以获得较好的诱变
效果. 其成活率和诱变率分别达到 53. 13%、 60. 00%和 82. 35%、 72. 22%. 茎 、 叶 、 气孔 、 保卫细胞 、染色体以及
过氧化物酶等形态生理指标的检测证明四倍体较二倍体发生了显著变化.
关　键　词:绿玉树;秋水仙碱;多倍体;染色体
中图分类号:Q949. 753. 5 文献标识码:A
　　绿玉树(Euphorbia t irucall i L. )又名橡胶大
戟 、绿珊瑚 、白乳木 、光棍树 , 大戟科大戟属植物 ,
富含乳汁. 前人研究表明乳汁中含有丰富的烯 、
萜 、醇等物质 , 通过加工可以替代石油 , 因此认为
是一种有应用前景的能源植物. 我们在重庆引种绿
玉树 3年发现其对低温敏感 , 为此本实验结合前人
的研究成果[ 1 , 2] , 开展了绿玉树多倍体诱变的研究
工作. 从处理方式 、秋水仙碱浓度和处理时间对诱
导多倍体的效应及多倍体鉴定等方面进行了研究.
1　材料与方法
1. 1　材　　料
供试材料取自海南 , 后在西南大学园艺园林学
院苗圃栽培.
1. 2　方　　法
1. 2. 1　无菌培养体系的建立
以茎段作为外植体 , 去除叶片 , 切成 4 cm 左右
的茎段后在 21%PEG 中浸泡 4 ～ 5 h , 在超净工作
台内对材料进行表面消毒 , 即70%乙醇 25s;0. 1%
升汞 12 min;无菌水冲洗 4 ～ 5次. 在已灭菌的培
养皿中将材料切成 1 cm 左右的小段 , 每段保证有
一个芽. 再将茎段接种在预先配制好的 3 /4 M S+
ZT 0. 6 mg L -1培养基上. 当芽萌发长至 1 cm 左
右时 , 将芽切下进行不同方式的加倍诱变.
1. 2. 2　培养基添加法
以 3 /4 M S+ZT 0. 6 mg L - 1(pH =6. 0)作为
基本培养基 , 分别添加 0. 01%, 0. 05%, 0. 1%,
0. 2%的秋水仙碱. 转接新生芽(0. 5 cm 左右)分别
进行 14 d和 21 d的共培养. 然后经无菌水冲洗后
转接在无秋水仙素的基本培养基上进行培养.
1. 2. 3　浸泡法
将新生芽浸泡在经过灭菌的浓度为 0. 01%,
0. 05%, 0. 1%, 0. 2%的秋水仙素中浸泡 24 h. 然
后切去下部茎段 1 mm 左右再转接在基本培养基上
进行培养.
1. 2. 4　先预培养后处理法
先将新生芽接种于基本培养基上预培养 3 d , 再
将沾有浓度为 0. 01%, 0. 05%, 0. 1%, 0.2%秋水仙
素的无菌脱脂棉包裹在芽的顶端 , 经过 24 h后除去
脱脂棉并经冲洗后转接在新的基本培养基上.
① 收稿日期:2006 - 10 - 31
基金项目:林业部重点推广项目(林技发 200416- 2).
作者简介:李　政(1981 -), 男, 河北涿州人 , 硕士研究生 , 主要从事园林植物遗传育种的研究.
通讯作者:李　凌 , 教授 , 硕士生导师.
DOI牶牨牥牣牨牫牱牨牳牤j牣cnki牣xdzk牣牪牥牥牱牣牥牪牣牥牪牫
1. 2. 5　嵌合体的分离
当处理的芽萌发枝条后 , 取茎尖旁边幼叶采用
去壁低渗 -火焰干燥法[ 3] 检测绿玉树染色体数目.
将多倍体细胞比例大的枝条分切成小段 , 每段一个
芽 , 转接到新的培养基上进行分离培养. 如此反复
进行 4代分离继代.
1. 2. 6　生根移栽
以 1 /2 MS+NAA 0. 5 mg L - 1作为生根培养
基对经过分离鉴定的纯合四倍体以及二倍体进行生
根培养. 待根长至 2 cm时进行炼苗移栽.
1. 3　多倍体的鉴定
1. 3. 1　植株形态观察法
当移栽苗萌发 30 d 后 , 用游标卡尺分别测量
二倍体和四倍体的同一批萌发枝条的直径 , 测量位
置均在距枝条基部上方 5 cm 处. 每组材料测量 10
组数据进行统计. 再取二倍体和四倍体成熟叶片
(顶端数第 4 ～ 5片)用游标卡尺测量 10组叶长 、叶
宽(中部);另各取 50张成熟叶片 , 每 5张一组 , 用
游标卡尺测量叶厚 , 然后求平均值.
1. 3. 2　叶片气孔及茎表皮气孔特征观察
分别从二倍体以及四倍体上取成熟叶片 , 撕取
下表皮 , 碘-碘化钾染色后在 Leica DM1000光学显
微镜下观察保卫细胞长度 、宽度 、保卫细胞中叶绿体
数目以及每一视野(10×20)中气孔数目 , 另外 , 对两
种材料进行茎表皮扫描电镜观察:即先取 2 cm长的
茎段进行戊二醛固定 , 脱水 , 临界点干燥 , 表面喷金
处理后再用 AMARY电子扫描显微镜观察摄影 , 比
较处理前后茎表皮气孔的变化情况.
1. 3. 3　染色体记数
待处理芽长势恢复后 , 取茎尖旁边的幼叶采用
去壁低渗 -火焰干燥法检测绿玉树染色体数目:取
幼叶→0. 002% 8 - 羟基喹啉预处理 3 h →固定液
(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定 2 h→去离子水洗净固
定液→酶解(3%纤维素酶∶3%果胶酶=1∶1)3. 5 h
→去离子水后低渗 10 min→固定 30 min 以上→涂
片 , 风干→5%Giemsa(pH=7. 0)染色 8 min→自来
水洗净多余染料→镜检 、记数 、显微摄影.
1. 3. 4　过氧化物酶分析
取幼嫩的茎段(带叶片)作为材料 , 采用过氧化
物同工酶凝胶电泳技术[ 4 -7] 进行电泳 、染色并将过
氧化物同工酶谱带照相. 最后根据电泳图谱 , 比较
不同倍性绿玉树的共有谱带 、特有谱带.
2　结果与分析
2. 1　植株形态观察结果
在培养过程中发现:经过秋水仙素处理的材料
较二倍体材料的叶片颜色深;其新生嫩叶及其茎顶
端的表皮毛多于二倍体材料;萌芽间隔时间较二倍
体长;在茎直径 、叶厚 、叶长 、叶宽以及叶形指数
方面有较大差异(表 1).
表 1　二倍体与四倍体茎 、 叶以及叶形指数差异显著性比较
Table 1　Comparison of Differential Significance Be tw een Diploid and Tetraplo id on Stem , Leaf and Leaf Index
倍性 P
直径 /mm
平均
值 A 1
显著
性 S1
显著
性 S2
叶厚 /mm
平均
值 A1
显著
性 S1
显著
性 S2
叶长 / mm
平均
值 A1
显著
性 S1
显著
性 S2
叶宽 /mm
平均
值 A 1
显著
性 S1
显著
性 S2
叶形指数
平均
值 A 1
显著
性 S1
显著
性 S2
2X 4. 42 a A 0. 39 a A 12. 21 a A 2. 38 a A 5. 17 a A
4X 6. 42 b B 0. 44 b B 14. 77 b B 4. 17 b B 3. 58 b B
　　注:P:ploidy lev el;A1 :average;S1 :significanceα=0. 05;S2 :significanceα=0. 01.
　　经过秋水仙素处理的材料表现出典型的器官巨
大性(图 1). 其直径 、叶厚 、叶长 、叶宽以及叶形指
数方面均在 5%水平上有显著差异 , 在 1%水平上
有极显著差异.
2. 2　染色体记数的结果
将经过秋水仙素处理形态发生显著变化的材料
和正常二倍体材料用改良的去壁低渗 -火焰干燥法
进行染色体观察 , 发现二倍体绿玉树的染色体数目
为 2n=2X=20 , 经过加倍处理后得到的材料细胞
染色体数目为 2n=4X=40(图 2). 证明我们得到的
经过处理的形态变化显著的材料为四倍体.
2. 3　不同处理方法对多倍体诱变效果的影响
2. 3. 1　培养基添加法的诱变效果比较
将秋水仙素直接添加到培养基中进行处理能获
得较高的诱变频率. 秋水仙素浓度 0. 1%以上时 ,
加倍频率可达 75%以上 , 但处理时间延长至 21 d
时成活率降低到 34%以下. 从实验结果可以看出 ,
秋水仙素 0. 2%, 处理 14 d可以获得较理想的成活
率和加倍频率(表 2).
107第 2期　　　　　　　　　 　李　政 , 等:秋水仙碱诱变绿玉树多倍体研究
A. 叶片比较;B. 茎比较.
图中左为四倍体;右为二倍体.
图 1　二倍体与四倍体形态比较
F ig. 1　Compa rison of M orpholog y Be tw een Diploid and Tetraploid
A. 二倍体 Diploid(×1000);B. 四倍体 Tet rap loid(×1000).
图 2　二倍体与四倍体染色体数目比较
Fig. 2　Comparison o f Chromosome Numbe r
表 2　不同处理对成活率与加倍频率的影响
Table 2　Effect o f Differ ent T reatment on Surviv al Rate and Inducing Ra te
浓度 /% 处理天数 /d 接种芽数 成活数 成活率 /% 加倍个数 加倍频率 /%
0. 01 14 32 29 90. 63 9 31. 03
21 30 25 84. 00 11 42. 86
0. 05 14 30 18 60. 00 10 55. 56
21 35 16 44. 44 12 75. 00
0. 1 14 30 16 53. 33 12 75. 00
21 31 10 33. 33 8 80. 00
0. 2 14 32 17 53. 13 14 82. 35
21 30 0 0. 00 - -
2. 3. 2　浸泡法的诱导效果比较
先将带芽茎段在无菌秋水仙碱溶液中浸泡再转
接的方式进行处理 , 其成活率以及诱变频率均较
低. 秋水仙素浓度 0. 1%以上时 , 加倍频率可达
44%以上 , 但成活率降低到 28%以下(表 3). 从长
势来看 , 经过浸泡处理的茎段生长明显减慢 , 且叶
片以及新生枝条多扭曲畸形. 死亡的茎段多数开始
于顶端黄化.
表 3　不同浓度对成活率与加倍频率的影响
Table 3　Effect o f Differ ent Density on
Survival Rate and Inducing Rate
浓度
/%
接种
芽数 成活数
成活率
/%
加倍
个数
加倍频率
/%
0. 01 30 18 60. 00 1 5. 56
0. 05 45 21 46. 67 2 9. 52
0. 1 33 9 27. 27 4 44. 44
0. 2 31 3 9. 68 2 66. 67
108 西南大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　第 29卷
2. 3. 3　先预培养后处理法结果比较
经过预培养 , 再进行处理 , 24h后除去药剂并进
行转接. 发现在处理后的生长中先出现一段时间的停
滞 , 随后继续生长 , 但是其生长速度明显较未处理的
缓慢. 从表 4的统计中可以看出处理后的成活率较高.
即使在 0. 2%的浓度下 , 成活率也能够保持在
60. 00%. 其加倍频率也随着处理浓度的提高而增加.
表 4　不同浓度对成活率与加倍频率的影响
Table 4　Effect of Different Density on
Surviv al Ra te and Inducing Rate
浓度
/%
接种
芽数 成活数
成活率
/%
加倍
个数
加倍频率
/%
0. 01 33 33 100. 00 3 9. 09
0. 05 30 28 93. 33 9 32. 14
0. 1 43 32 74. 42 21 65. 63
0. 2 30 18 60. 00 13 72. 22
　　通过对以上 3种方法进行比较发现 , 在培养基
中添加 0. 2%的秋水仙碱进行 14 d培养以及先预培
养 3 d再用 0. 2%秋水仙碱进行 24 h 处理法可以获
得较好的诱导效果. 其成活率和诱导率分别达到
50%以上和 70%以上.
2. 4　叶片气孔及茎表皮气孔特征观察结果
通过观察发现四倍体保卫细胞长度 、宽度以及
叶绿体数目均较二倍体明显增加;每一视野中气孔
数目明显减少(表 5). 其中保卫细胞的平均长度增
加了23. 1%;平均宽度增加了 50. 8%;叶绿体平均
数目增加了 49. 6%(图 3);每个视野中平均气孔数
目减少了37. 0%. 在茎表皮的电子扫描显微镜观察
中发现二倍体茎表皮气孔均呈带状并沿茎的走向向
下凹陷 , 表现出典型旱生植物的特点;四倍体气孔
的排列呈无规则状 , 且向下凹陷亦不明显(图 4).
通过测量发现四倍体(40. 6 μm)茎表皮气孔直径较
二倍体(30. 2μm)增加 10. 4 μm.
表 5　二倍体与四倍体保卫细胞与气孔差异显著性比较
Table 5　Com parison of Diffe rential Significance Betw een Diploid and Te traploid on Gua rd Cell and Stoma
倍性 P
保卫细胞长度 /μm
平均值
A 1
显著性
S1
显著性
S2
保卫细胞宽度 /μm
平均值
A 1
显著性
S1
显著性
S2
叶绿体数目 /个
平均值
A1
显著性
S1
显著性
S2
气孔数目 /个 /10×20
平均值
A 1
显著性
S1
显著性
S2
2X 27 a A 6. 38 a A 11. 5 a A 134. 3 a A
4X 33. 25 b B 9. 62 b B 17. 2 b B 84. 6 b B
　　注:P:ploidy lev el;A1 :average;S1 :significanceα=0. 05;S2 :significanceα=0. 01.
A. 二倍体 Diploid(×1000);B. 四倍体 T et raploid (×1000).
图 3　气孔比较
Fig. 3　Comparison of Stoma
A. 二倍体 Diploid(×400);B. 四倍体 T et raploid (×400).
图 4　气孔形态比较
F ig. 4　Compa rison of M orpholog y o f S toma
109第 2期　　　　　　　　　 　李　政 , 等:秋水仙碱诱变绿玉树多倍体研究
2. 5　过氧化物酶同工酶电泳分析结果
从过氧化物酶同工酶酶谱(图 5)比较可以看
出:二倍体绿玉树的过氧化物酶同工酶谱带仅有 5
条 , 而四倍体谱带有 8 条 , 且其中 3 条明显加强.
说明四倍体绿玉树的过氧化物酶同工酶活性增强.
ABEF二倍体 Diploid;CDGH 四倍体 T et raploid.
图 5　过氧化物酶同工酶电泳
F ig. 5　POD Gel Electrophor esis
3　小　　结
采用组织培养与秋水仙碱处理相结合诱变得到
了绿玉树四倍体. 并且通过一系列形态 、生理指标
的测定发现四倍体生活力高于二倍体 , 具体的抗性
指标有待进一步测定.
诱变产生的四倍体多为嵌合体 , 经过不断分切
继代筛选 , 获得了 3株纯合的四倍体绿玉树.
参考文献:
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型快繁的影响 [ J] . 广西科学 , 2003 , 10(3):232 -
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中国农业出版社 , 1996.
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陕西科学技术出版社 , 1986.
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学技术出版社 , 1986.
Polyploidy Induction in Euphorbia tirucalli L. with Colchicine
LI　Zheng , 　HUANG Jing-jie , 　LI　Ling
School of Horticulture and Landscape Architecture , Southwest Universi ty , Chongqing 400716 , China
Abstract:Caespi tose buds o f Euphorbia t irucall i L. were treated w ith colchicine in different w ay s to in-
duce polyploidy . Sat isfactory results we re achieved when the buds w ere cultured on a medium supplemen-
ted wi th 0. 2% colchicine for 14 day s or they were pre-culture for 3 day s and then transferred to a 0. 2%
colchicines-containing medium and culture fo r 24 h. The surviv al rate of the explants and their induction
rate w as 53. 13% and 60. 00%, and 82. 35% and 72. 22%, respectively in the tw o treatments. Compared
wi th the diploids , remarkable changed were found to have occurred in the mo rpholo gical indica to rs of
stem , leaf and guard cell and the phy sio logical indexe s of chromosome and pero xidase in their tet raploid
counterparts.
Key words:Euphorbia tirucal li L. ;co lchicine;po lyploid;chromosome
责任编辑　欧　宾　　　　
110 西南大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　第 29卷