全 文 ：中国农业科学 2 0 0 2 , 3 5 ( 1 ) : 1 0 2 一 1 05
S e ie n t i a gA
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黄羽扇豆翻译延伸因子 2 的序列分析
陈建 中` , 戴 剑 2 , 章 镇` , R . s lo m s k i3
( ` 南京农业大学园艺学院 , 南京 21 0 0 95 ; “ 江苏省农业科学院粮食作物研究所 ,南京 21 0 01 4 ;
3 波兹南农业大学生化和生物技术系 , 波兰 )
摘要 :利用 aS n ge r 双脱氧链终止法对黄羽扇豆 ( L u p in u : zut eu : ) 翻译延伸 因子 2 ( E F’2 ) 的全长 C D N A 克隆进行
了序列分析 。 该 e D N A 长度为 2 7 9 4 b p , 其中包括 5 ’ 末端的 8 0 bp 非翻译 区 , 3 ’ 末端 1 8 5 b p 非翻译 区和 2 5 2 9 b p 长编
码序列 , 3 ’ 末端为 一 18 b p p d y ( A ) 尾 。 与其 它 G T P 结合 蛋 白比较其编译 的 8 4 3 a a (氨基酸 )序列 , 发现它们具有显
著的 同源性 ; 黄羽扇豆 EFZ 与甜菜 E FZ 的氨基酸序列 9 0 % 相同 。 其差 异主要存在于序列的中部 ; 而与肤基 tR N A
和核糖体作用部位 、 与 G T P 结合部位 和 G T P 酶活性有关的部位具有很高的保守性 。 黄羽扇豆 E FZ 第 7 0 0 个氨基
酸残基组氨酸是 白喉毒素的 A D P 一核糖基化部位 。
关键 词 : 黄羽扇豆 ; 延伸因子 ;2 亚克隆 ;序列分析
S e q u e n e in g o f E lo n g a t io n F a e t o r 2 f r o m L u P in u s Iu t e u s
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K e y w o r d s : L u P i n u s l u te u s ; E F Z ; S u b e lo n i n g ; S e q u e n e in g
蛋白质的生物合成是有机体的重要生理过程 。
它是储藏在 D N A 分子中的遗传信息与蛋白质之 间
的纽带 。 蛋白质合成过程分为 3 个阶段 : 起始 、 延伸
和终止 , 每一阶段都有一套独特的蛋 白质因子发挥
作用 。 细菌 中 的蛋 白质合成 延伸 因子 ( e lon g at ion
af ct or )为 E F 一 T u 和 E F 一G ,其它有机体 中的延伸因子
为 E F la 和 E F Z , 它们通过在核糖体上催化 氨基酸
链的延伸而推动 、 控制蛋 白质的合成 。 真核生物的
延伸因子 2 是一种质量为 10 0 0 0 道尔顿的单体多
肤 ,通过催化依赖于 G T P 水解 的转位反应将 A 位
生成的肤基 一 t R N A 转移到 P 位 ,原来 P 位上空载的
t RN A 被逐出核糖体 , 同时 , 核糖 体沿着 m R N A 向
前移动一个密码子 [` , 2」。
许多植物的 E F la 基因已被分离 , 如拟南芥 、 番
收稿 日期 : 2 0 00 一 0 7一 1 1
基金项目 : 国家 留学基金管理 委员会资助
作者简 介 : 陈建中 ( 19 6 7一 ) ,男 , 江苏泰兴人 , 双硕 士 , 主要从事园艺植物遗传育种研究 兼教学工 作 。 T el : 0 2 5一 4 3 9 5 7 2 4 ; aF x : 0 2 5 4 3 9 5 2 6 6 ; E
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1 期 陈建中等 :黄羽扇豆翻译延伸因子 2 的序列分析
茄 、 玉米 、 大麦 、 苹果等。 虽然也已分离获得果蝇 、 老
鼠和仓鼠 、 甲烷球菌以及小球藻等真核生物的 E F Z
基因 ,但在基因文库里却很少有植物 E FZ 基因的记
载 。 本研究组分析了编码黄羽扇豆 ( L u P in us z ut eu :
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)延伸因子 2 全长 c D N A 克隆的序列 , 并将其
推断的 E F Z 氨基酸序列与其它 G T P 结合蛋 白进行
了同源性 比较 。
1 材料与方法
1
.
1 材料
编码黄羽扇豆延伸因子 2 的全长 C D N A 克隆由
作者留学所在的波兰波兹南农业大学生化和生物技
术系分离获得 。 亚克 隆转化寄主为大肠 杆菌菌株
D H 5
a ,所用载体为 p B l u e s e r i p t , p G E M 7 和 p U C 1 8 。
1
.
2 重组 O N A 技术
质粒 D N A 的准备和纯化 , 限制性 内切酶的消
化 ,琼脂糖凝胶 电泳 , D N A 片段的回收以及 D N A 的
连接和质粒转化参照 as m b or o k 等 [3 〕的方法稍加改
进 。
1
·
3 O N A 序列分析
对双链重组质粒 D N A 采用 M 13 广谱引物 ( 3 `
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) 和 反 向 引 物 ( 5 `
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)按 S an ge r 双脱氧链终
止法 [4 〕进行完全序列测定 。
2 结果与讨论
2
.
1 黄羽扇豆延伸因子 2 ( E F Z )全长 e D N A 的核普
酸序列分析
黄羽扇豆 E F Z 全长 c D N A 的完全核昔 酸序列
包含一个编译 843 个氨基酸残基 的长开放阅读框
( O R F )
。 该 CD N A 除了含有 2 5 2 9 b p 的长编码序列
外 ,还含有 8 0 b p 的 5 `端非翻译区和 18 5 b p 的 3 ’端非
翻译区 。 翻译起始于第 81 一 83 核昔酸残基 的第一
甲硫氨酸密码子 A T G 处 , 而在第 2 61 0 一 2 6 1 2 核甘
酸残基的终止密码子 T A A 处终止 。 5 ’ 端非翻译区
具有较高的 G 十 C 含量 , 为 49 % , 而其它区为 4 % 。
3端具 有 一 18 个 腺 昔 酸组 成 的 po ly ( A ) + 尾 巴
(图 ) 。
2
.
2 黄羽扇豆 E F Z 的基本结构
由黄羽扇豆延伸因子 2 全长 c D N A 核昔酸序列
推断的氨基酸序列示于下图 。 它包含 842 个氨基酸
(不包括起始 甲硫氨酸 ) , 与甜菜 (基 因文库中代号
为 : e f Z 一 b e t v u , 0 2 3 7 5 5 ) 、 老鼠 ( e f Z 一 r a t , P 0 5 19 7 ) 、 酵
母 ( e f Z 一 y e a s t , P 3 2 3 2 4 ) 和 人 类 ( e f Z 一 h u m a n ,
P 1 3 6 3 9) 以及仓 鼠〔`〕和果蝇 2[] 的延伸 因子 2 一样 ,
黄羽扇 豆 E FZ 的氨 端 残 基 为 撷 氨 酸 。 R ob in so n
等〔5 〕对 A l〕p 核糖基化的老鼠 E F Z 用胰蛋 白酶消化
后所产生的 15 个氨基酸多肤进行了序列分析 ,该序
列在黄羽扇豆 E ZF 中高度保守 , 即图中下划线 的氨
基酸 序 列 区 域 。 E FZ 中被 白喉 毒 素 ( d i p h t h e r i a
ot ix n) 特异性 A D P 一核糖基化后 的氨基 酸是 白喉酞
胺 ( d i p h t h a m i d e ) , 经核磁共振 ( N M R )光谱分析 白喉
酞胺为 2一 ( 3 一酞胺 一 3 一三 甲氨基丙基 )组 氨酸 {2 一「3 -
e a r b o x y a m id o 3 ( t r im e t h y l a m m o n io ) p r o p y l ]
hi st 记 in e } ,它是一个经翻译后修饰的特殊氨基酸 , 可
使 E F Z 失活 [“ ;] 分析黄羽扇豆 E F Z 的序列得知 , 这
一特殊组氨酸位于狡端区域即第 7 0 0 个氨基酸残基
处 。
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1 04中 国 农 业 科 学 3 5 卷
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核昔酸从 CD N A 的 5’ 端起标记 ;起始密码子 A I G 和 P of y ( A ) 十尾 巴用下划线标记 ;终止密码子 T A A 被 星号标记 ;括号 中的组氨酸 ( 21 7 8 一 21 80)
是 白喉毒素 A D P 一核糖基化作用位点
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图 黄 羽扇豆 〔「Z c 0 N A 的全长核昔酸序列及推论的氨基酸序 列
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3 黄羽扇豆 E F Z 与其它延伸因子和 G 下尸结合蛋
白 ty p a 的同源性
将黄羽扇豆 E FZ 的氨基酸序列与甜菜 E F Z 、 人
类 E F Z 、 老 鼠 E F Z 、 酵母 E F Z 、 细菌 E F 一 T u ( e f t u
e i k e o
,
P 3 5 6 4 4 )和 E F 一 G ( e f g 一 e e o l i , P 0 2 9 9 6 ) 以 及
G T P 结合蛋白 t y p a ( t y p a 一 s y n y 3 , P 7 27 4 9 )的氨基酸
序列进行 同源性 比较 , 发现 黄羽扇豆 E F Z 与甜菜
E F Z 具有高度同源性 ,两者 90 % 的氨基酸相 同 。 其
差异主要存在于序列的中部 , 而一些具有重要功能
的区域却具有较高的同源性 。 如肤基 一 t R N A 和核
糖体的作用部位 G l 区 (氨基酸 2 0 一 4 0) 和 E l 区 (氨
基酸 58 一 7 3) 仁` , 2任与 G T P 结合和 G T P 酶 活性有关
的部位 G Z 区 (氨基酸 1 0 0 一 1 12 氨基酸 ) , G 3 区 (氨基
酸 12 3 一 1 3 0 ) , G 4 区 (氨基酸 1 3 8 一 1 4 2 )和 G S 区 (氨基
1期 陈建 中等 :黄羽扇豆翻译延伸因子 2 的序列分析
酸 15 4一 61 3) [`〕 ;参与核糖体的结合部位 E Z 区 (氨基
酸 4 0 0一 4 1 1 )和 E 4 区 (氨基酸 7 2 2一 7 9 0 )〔 2 ] ;以及 白喉
毒素引起 E F Z A l〕p 核糖基化部位 [` ]其序列 的保守
性程度高 。
作用类似于真核生物 E F Z 的细菌延伸因子 E F -
G 与 E F Z 的序列同源性 明显高于对应于真核生物
延伸因子 E F la 的细菌延伸 因子 E F一 T u 。 G T P 结合
蛋白 t y Pa 与所有 的延伸 因子尤其是 E F Z 和 E F一 G
也具有一定程度 的同源性 。 上述 8种 G T P 结合蛋
白具有 6个完全同源的氨基酸 。
S O g i n 等 j[7 认 为 基 于 小 单 元 核 糖 体 R N A
(S r R N A )可 以建 立 真核 生 物 系统 发 育树 , 然 而 ,
S r R N A 的 G 十 C 含量有时随着种 间染色体组 G 十 C
含量的改变发生显著的变化 8[] ; 由于建立系统发育
树时未考虑这一因素 , 因此 ,基于 rS R N A 的系统发
育树可能会有误差 〔9了。 H as ge a w a 等通 过对延伸 因
子 E F l a 的最大可能性 (m a x im u m lik e l i h o o d )分析不
赞成 sr R N A 发育树 〔` 0〕 ,并认为保守性蛋 白质的氨
基酸组成不随染色体组 G + C 含量的变化 而变化 ,
蛋白质的系统发育能为真核生物的早期演变进化提
供丰富信息 {“ 〕 , 因此 , 似乎根据保守蛋 白的氨基酸
序列比 rS R N A 序列推断系统发育树更理想 , 而翻译
延伸因子 、 R N A 聚合酶和 A l , P 酶均为这种保守蛋
白 [“ { 。
翻译延伸因子 2 催化依赖 于 G T P 水解 的转位
反应 ,使肤基 一 tR N A 从核糖体上的氨酞位 ( A 位 )转
移至肤基位 ( P 位 )[ ` , 2 〕 , 因此对所 有真核生物的蛋
白质合成具有重要作用 。 由于 E FZ 在所有有生命
的真核生物中的广泛存在 以及其相对较慢的演化速
率 ,使 E F Z 成为一种寻找生命早期演化 的有用蛋 白
质 [`“ 〕。 本研究结果分析表明来 自不 同种类生物的
E F Z 其氨基酸序列具有很高的同源性 ,所 以 , 同样认
为 E ZF 有望成为建立 系统发 育关系 的有 力工具 。
黄羽扇豆 E F Z 与甜菜 E F Z 有 9 0 % 相 同的氨基酸序
列 ,与人类 、 酵母 E F Z 同源性分别为 63 % 、 60 % ;人
类与老鼠的 E F Z 同源性高达 9 9 % 。
得一个编码 黄羽扇 豆延伸 因子 2 全长 2 7 9 4 b p 的
c D N A 克隆 , 该 CD N A 包含一个编译 863 个氨基酸
的开放阅读框架 。 经分析第 7 0 0 个氨基酸残基一组
氨酸是 白喉毒素的 A D P 一核糖基化部位 。 黄羽扇豆
E F Z 与其它 E ZF 具有较高的序列同源性 , E FZ 有望
成为研究系统发育的重要工具 。
R e f e r 6 n C e S :
[ l 〕 K o h no K , e t a l . A l l l ion a e id se q u e n e e o f m a m m a l i a n e lo n g a t i o n
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4 9 7 8 一 4 9 8 2
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, 1 7 ( 18 ) : 7 3 0 1 一 7 3 14
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[ 5 ]
[ 6 ]
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2 4 9 ( 1 6 ) : 5 0 88 一 5 0 9 3
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2 5 5 ( 2 2 )
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仁1 1 ]
3 结论 [ ` 2 ]
在真核生物的蛋白质生物合成 中 , E ZF 催化依
赖于 G T P 水解的转位反应 ,使肤基 一 t R N A 从核糖体
的氨酞位 ( A 位 )转移至肤基位 ( P 位 ) 。 本试验已获