全 文 ：收稿日期: 2003- 03- 06
基金项目:福建省自然科学基金资助项目 ( B0210010) .
作者简介:吴菁华 ( 1978- ) ,女 .研究方向:植物生化与分子生物学 .
水仙 (Narcissus tazet ta L. )单染色体的显微分离
吴菁华 1 , 黄代青2 , 吕柳新 3 , 张志忠 3
( 1.福建农林大学生命科学学院 ,福建 福州 350002; 2.福建师范大学生物工程学院 ,福建 福州 350007;
3.福建农林大学园艺学院 ,福建 福州 350002)
摘要: 用果胶酶和纤维素酶酶解的水仙根尖制备染色体标本 ,从大量中期分裂相中选择分散良好的染色体进行拍照和组
型分析 ,建立核型图 .根据核型识别目标染色体 ,应用显微操作系统成功进行单染色体分离 .
关键词: 水仙 ; 核型 ; 微分离
中图分类号: Q943; S682.2+ 1 文献标识码: A 文章编号: 1006-7817( 2003) 04-0471-03
Microdissection of the single chromosome inNarcissus
WU Jing-hua
1
, HU ANG Dai-qing
2
, LU Liu-xin
3
, ZHANG Zhi-zhong
3
( 1. College of Life Science, Fujian Ag riculture and Forestry Univ ersity , Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. Bioengineering
Colleg e, Fujian Teachers Univ ersity , Fuzhou, Fujian 350007, China; 3. Co lleg e of Hor ticulture, Fujian Ag riculture and
Fo restry Univ ersity, Fuzhou, Fujian 350002, China )
Abstract: The chromosome specimens were made from root tip dissocia ted with the mix tur e o f pectase and celluase. The
standard ka ryo type o f na rcissus w as established based on many metaphase photos. The targ et ch romosome was identified and
microdissected using microg lassneedles under the mic romanipulato r, then transferred into Eppendo rf tube fo r fur ther study.
This is a successful w ay to microdissect the targ et ch romosome in na rcissus.
Key words: Narcissus; ka ryo type; microdissection
20世纪 80年代德国欧洲分子生物学实验室 Edstrom领导的研究小组对果蝇进行染色体的微分离、
微克隆技术研究 ,建立了微切割、微分离与微克隆技术 [1 ] .经过不断发展 ,该技术现已成功应用于人类、动
物的基因研究 .其基本过程是首先分离、切割一条或一段特定的染色体 ,用蛋白酶 K消化后通过 PCR扩
增 ,将扩增产物连接到载体上并转化大肠杆菌 ,获得某一染色体区段的 DNA文库 .但由于植物细胞和染
色体的特异性 ,直至 1991年 Sandery et al[2 ]才将该技术应用到植物中 .十几年来 ,也取得了较大的进展 ,已
相继进行了大麦 [3 ]、小麦 [4 ]、燕麦 [5 ]、蚕豆 [6 ]、王百合 [7 ]、玉米 [8 ]、大豆 [9 ]和木本植物的柚子 [ 10]等作物的染色
体分离、文库的构建 ,并部分测序 .应用微分离、微克隆技术建立的特异染色体 DNA文库有着广阔的应用
前景 [11 ] ,如研究染色体的进化、结构变异、从 DNA文库中筛选大量特异性 DNA片段作为 RFLP[ 3]和 SSR
分子标记的探针 ,构建更加精细的基因图谱等 .
水仙花是著名的观赏花卉 ,种类繁多 ,其中多花水仙是福建特产 ,有开白色花、黄色花以及花冠白色副
冠黄色或淡黄色等几种不同的花色 .吕柳新等 [12 ]报道 ,在白花水仙的染色体组中 ,第 9号染色体是一对短
小的中着丝粒染色体 ,可能起源于染色体的易位 .本试验在再次进行核型分析的基础上 ,试图应用染色体
的微分离、微克隆技术 ,进一步深入研究该染色体的起源和多花水仙的进化关系 .目前已成功建立了快速
分离水仙染色体的方法 ,为下一步进行单染色体的微克隆奠定基础 .
1　材料与方法
1.1　供试材料
供试品种为多花水仙的一个变种“白花水仙” (N arcissus tazetta L. v ar. White flow er) , 2n= 22,具有 1
对特殊的中着丝粒染色体 .由福建农林大学漳州分部提供 .
福建农林大学学报 (自然科学版 ) 第 32卷 第 4期
Journal of Fujian Ag riculture and Forestry Univ ersity ( Na tural Science Edition) 2003年 12月
DOI : 10. 13323 /j . cnki . j . f af u( nat . sci . ) . 2003. 04. 014
1.2　染色体标本制作
选取健康的鳞茎 ,在 12- 1月用清水催根 .待根长 1- 2 cm时 ,根部不离体浸入 0.02 mol· L- 1八羟基
喹啉中 ,室温下处理 3- 4 h ,切下根尖用双蒸水洗涤 2、 3次 ,然后用卡诺液 (乙醇∶乙酸= 3∶ 1)固定 24
h.制片前 ,将根尖置双蒸水中低渗 30 min ,再移到质量分数为 2%纤维素酶与质量分数为 0.5%果胶酶的
混合液中 , 37℃酶解 40 min- 1 h;之后用双蒸水洗 3次 ,卡宝品红染色压片 ,镜检 .选择形态端正并分散
良好的染色体分裂相 ,部分用于拍照和核型分析 ,另一部分用液氮冰冻揭片 ,气干 ,用于显微分离染色体 .
1.3　染色体的核型分析
选择染色体形态端正并分散良好的分裂相 20个 , Zeiss显微镜的油镜下拍照 .按李懋学等 [13 ]报道的标
准进行核型分析 .
1.4　目标染色体的显微分离
用直径 1 mm的玻璃棒 ,在 Leitz拉针仪上用特制的微火酒精灯拉成短而尖的微玻璃针 ,针尖直径 1-
3μm.在制好的染色体标本载片上滴加一滴无菌水 ,借助于 Nikon倒置显微镜和显微操作系统 ,在 10× 40
明视野中找到目标染色体后 ,用制备好的微细玻璃针挑取目标染色体 ,供微克隆之用 .
2　结果与讨论
2.1　染色体制片
水仙生长有较强的季节性 ,只有经过夏秋高温的休眠期 ,冬季 ( 11- 1月 )球茎才会生根 .在此季节将
球茎用清水培养 3- 4 d即可发根 .由于水仙染色体较大 ,供作制片的根尖待长至 1- 2 cm时 ,必须进行根
尖不离体预处理 ,以促使染色体缩短、加粗 ,制片时染色体才能较好地分散开来 .预处理是水仙染色体制片
工作中十分关键的一个环节 ,必须根据研究的品种、季节以及使用的药剂种类和浓度的不同 ,进行细心摸
索 .根据作者反复多次试验 ,水仙根尖预处理时间不能短于 3 h,否则染色体太长 ,制片难度大 ;但处理时
间也不能超过 8 h,否则染色体收缩太短 ,形态上难以辨认 ,增加了分离目标染色体的难度 .预处理完成后
立即将根尖剪下 ,经漂洗后用卡诺液固定 .制片时根尖先经过酶解 ,用常规压片法制片即可获得较好的中
期分裂相 (图 1) .
2.2　核型分析
选择 20个染色体形态端正、分散良好的分裂相 ,按李懋学等 [ 13]报道的标准进行核型分析 .结果表明 ,
该品种在 1个染色体组中 ,包含有 4个长、 2个中等长 (相对长度> 7% 、 < 10% )和 5个短的染色体 [ 12 ] ,是
一个非二形组型 (图 2) ,不同于漳州水仙的典型二形组型 .
图 1　水仙中期分裂相
Fig. 1　 Ch rom osomes at metaphase of narcissus
图 2　水仙染色体核型
Fig. 2　 Karyotype of narci ssus
2.3　目标染色体的分离
目标染色体的分离过程见图 3.本试验成功分离了中着丝粒染色体和多对其它目标染色体 ,建立了一
套快速分离单染色体的技术体系 .
单染色体微分离是一项十分细致的工作 ,成功与否取决于玻璃针选用适当与否、染色体标本制备的好
坏以及具体操作过程 ,后者必须靠研究人员通过琢磨取得经验和技巧 .
玻璃针要求针尖细尖且短 ,否则没有刚劲 .对染色体标本的要求要比常规观察高得多 ,不但要求染色
体分散良好 ,而且要求细胞壁彻底消化 ,背景要干净 ,尽量避免细胞质的干扰 .即便是染色体与染色体之间
残留的一些细胞质 ,都可能给染色体的显微分离造成困难 .此外 ,由于分离的染色体要应用于后续的分子
生物学研究 ,因此还必须尽量保持染色体 DNA的完好无损 ,并在操作中避免各种内源和外源的污染 .
472 福建农林大学学报 (自然科学版 ) 第 32卷
A.染色体标本片 (箭头所指为目标染色体 ) ; B.玻璃针分离目标染色体 ; C.目标染色体已被分离 .
图 3　染色体的分离过程
Fig. 3　Microdissection of th e individual ch romosome of narcissus
用玻璃针分离分裂相中的单条染色体时 ,可在制备好的染色体标本载片上滴加 1滴无菌水 ,先在倒置
显微镜的 10× 40明视野中找到目标染色体 .然后再换至低倍镜下 ,通过显微操作仪将针尖调到视野正中
央 ,后又转换到高倍镜 ,在高倍镜下慢慢调动玻璃针尖直到接近染色体所在的平面 ,使用微调小心调节玻
璃针尖靠近目标染色体 ,轻轻触碰目标染色体 ,使染色体粘附到玻璃针尖上 ,将粘附目标染色体的针尖小
心移出液面 .另外也可以不滴加无菌水 ,直接在干的染色体玻片上进行分离操作 ,从染色体边缘小心、缓慢
地插入针尖 ,轻轻刮挖出染色体 ,并使之附着在针尖上 .前种方法在水相中进行 ,易于吸附染色体 ,但染色
体干净 ;后种方法在挑起时染色体不会脱落 ,但易带起染色质 ,不利于后面的分子生物学研究 .目标染色体
分离成功后 ,将针尖折断置于含 10μL 50 ng· μL- 1蛋白酶 K溶液 ( 1× T4 DNA连接酶缓冲液配制 ,用于
LA-PCR)或含 20μL 5 ng· μL- 1蛋白酶 K溶液 ( 1× Taq DN A聚合酶缓冲液配制 ,用于 DOP-PCR)的 0.2
mL Eppendo rf管中 .高速离心数秒钟 , - 20℃存放 .
此外还必须注意 ,供显微分离用的染色体标本搁置时间不能太长 ,否则染色体与载片的粘附力增强 ,
从中难以分离出单染色体 .因此 ,染色体标本应尽可能现制现用 .对于在加有水滴的标本中分离染色体 ,操
作速度要快 ,否则由于细胞与染色体吸水过多 ,与载片的粘附力减弱 ,易把多条染色体或整个细胞甚至多
个细胞一并挑起 ,导致试验失败 .
参考文献:
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(责任编辑:陈幼玉 )　　
473第 4期 吴菁华等: 水仙 (Narcissus tazetta L. )单染色体的显微分离