全 文 ：当归对氧化低密度脂蛋白所致血管内皮
细胞损伤的保护作用
严晓红1　欧阳静萍1　涂淑珍1　陈　云2　梁　惠2　余　追1　雷森林2
(基础医学院1 病理生理学教研室;2实验检测中心电镜室 ,武汉 430071)
摘要　通过培养人脐静脉内皮细胞 ,观察当归对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)损伤的内皮细胞(EC)乳酸脱氢
酶(LDH)的漏出量及扫描电镜下 EC 形态结构的影响 ,并观察当归在体外对 Cu2+诱导的低密度脂蛋白(LDL)氧化
修饰的作用。结果显示:在作用 24 h 后 , ox-LDL 组 LDH 漏出明显增加 , 超微结构明显受损。当归+ox-LDL 组
LDH 漏出显著减少 ,超微结构基本正常。在体外 ,当归能明显抑制 Cu2+介导的 LDL 氧化 , 且随着当归浓度的增高
显示抑制作用增强。结果表明:当归对 ox-LDL所致血管 EC 损伤具有保护作用 , 其机制可能与当归抗氧化作用有
关。
主题词　当归 ;脂蛋白类 , LDL;内皮 , 血管;抗氧化药;动脉粥样硬化
中图分类号　R543.5
　　血管内皮细胞(VEC)功能和结构的改变是动脉
粥样硬化(AS)发生的始动环节 ,氧化低密度脂蛋白
(ox-LDL)是 AS 病 EC 损伤的主要危险因子[ 1] 。本
组实验从细胞水平观察当归对 ox-LDL 致培养的
VCE损伤有无保护作用及当归的体外抗氧化作用 ,
旨在探讨当归抗 AS的作用和机制 。
1　材料与方法
1.1　材料　人脐静脉内皮细胞株 ECV304由武汉
大学典型保藏物中心提供;当归注射液购于我校附
二医院;MEM 培养基(GIBCO产品);新生小牛血清
(GIBCO产品 ,批号 1004570);扫描电镜(Hitachi S-
570)。
1.2　方法
1.2.1　ox-LDL 的制备与鉴定　采用一次性密度梯
度离心法[ 2] , 常规分离新鲜健康人血浆 , EDTA 抗
凝 ,50 000 r/min ,4 ℃, 5 h ,密度梯度超速离心分离
LDL ,在含双抗的 PBS中充分透析。LDL 蛋白含量
以 Low ry s法测定[ 3] 。LDL 装入透析袋在终浓度
为 10μmol/L 的 CuSO4溶液中透析 24 h(37 ℃),然
后在 4 ℃含 10 mg/ L EDTA的 PBS中透析 24 h ,用
琼脂糖电泳和硫代巴比妥酸反应物质的量测定
LDL的修饰程度 。
1.2.2　细胞培养与分组　人脐静脉内皮细胞株按
5×104/ml密度接种于培养瓶中 ,在 37 ℃培养箱中
孵育待细胞贴壁长成亚融合状态时 ,用 MEM 培养
基调制下列各组条件培养液 ,进行实验:①正常对照
组:仅用 MEM 培养基;②ox-LDL 损伤组:ox-LDL
的终浓度为 0.1 mg/ml;③ox-LDL +当归(2 mg/
ml)保护组:终浓度为 2 mg/ml的当归与终浓度为
0.1 mg/ml的 ox-LDL 共同作用于 EC;④ox-LDL+
当归(20 mg/ml)保护组:二者终浓度分别为 0.1
mg/ml和 20 mg/ml。各组均培养 24 h后收集各条
件培养液测 LDH ,EC 作扫描电镜观察。
1.2.3　LDH 的测定　用日本岛津 CL-2000型全自
动生化分析仪测定 LDH 活性 。
1.2.4　当归对 LDL 氧化的体外实验　在无 EDTA
的 LDL(蛋白含量为 0.5 mg/ml)中加 PBS 作对照
组 ,加 Cu2+至终浓度为 3 μmol/L 作 LDL 氧化组 ,
当归抗氧化组为在无 EDTA的 LDL 中依次加入不
同浓度的当归使其终浓度分别为 0.03 、0.06 、
0.125 、0.25 、0.5 、1 、2 、4 、8 、20 、40 mg/ml。然后加
Cu
2+至终浓度为 3μmol/L ,37 ℃水浴 2 h后用 1%
EDTA终止反应测 MDA的量。
1.2.5　扫描电镜　预置盖玻片于培养瓶内待细胞
生长成亚融合状态后 ,取出玻片 ,0.1 mol/L PBS 液
漂洗 2 次 , 2.5%戊二醛固定 , PBS 洗 3次 , 1%锇酸
后固定 , PBS洗 3次 ,梯度酒精脱水 , CO2 临界点干
第 20 卷　第 3 期
1999年 7月 　　　　　　　 　 　　　　　
湖北医科大学学报
Acta Academiae Medicinae Hubei
　　　　　　　 　 　　　　　Vol.20 , No.3
Jul , 1999
自由词
DOI :10.14188/j.1671-8852.1999.03.003
燥 ,真空下喷金 ,日立 S-570型扫描电镜观察。
1.2.6　数据统计学处理　数据以 x ±s表示 ,组间
比较用 t 检验 。
2　实验结果
2.1　扫描电镜下细胞形态的改变　正常对照组细胞
呈圆形或梭形 、多角形 ,表面微绒毛丰富 ,排列规则(图
1);细胞膜完整 ,细胞间隙较小 ,细胞间连接可见(图
2)。ox-LDL损伤组细胞皱缩变小 ,表面微绒毛减少甚
至消失(图 3);细胞间隙增大 ,细胞膜有破损(图 4)。当
归(2 mg/ml)保护组细胞形态结构明显改善(图 5、6)。
当归(20 mg/ml)时细胞大小形态结构与正常相似(图
7),细胞间隙缩小 ,细胞膜完整(图 8)。
2.2　当归对 LDH 含量的影响　ox-LDL 与培养EC
共育 , LDH 的漏出量显著高于对照组 ,加入不同浓
度当归 ,能明显减轻 LDH 从 EC中漏出(附表)。
图 1　正常对照组　EC 呈圆球形 ,表面微绒毛(←)
丰富 , 分布均匀。 ×4 200
图 3　ox-LDL组　EC 皱缩变小 ,表面微绒毛(←)消
失。 ×4 200
图 5　ox-LDL+当归(2 mg/ml)组　EC 表面微绒毛
(←)较多 、较短分布较均匀。 ×4 200
图 7　ox-LDL+当归(2 mg/ml)组　表面微绒毛
(←)丰富 , 分布均匀。 ×4 200
图 2　正常对照组　EC 呈多角形 , 细胞膜完整 , 细
胞间隙(→)小。 ×1 700
图 4　ox-LDL组　EC 膜破损(∧),细胞间隙(→)增
大。 ×1 700
图 6　ox-LDL+当归(2 mg/ml)组　细胞膜完整 , 细
胞间隙(→)较小。 ×1 700
图 8　ox-LDL+当归(2 mg/ml)组　细胞膜完整 , 细
胞间隙(→)小。 ×1 700
2.3　当归对 LDL 氧化的抑制作用 　Cu2+介导的
LDL氧化产生的 MDA 含量明显高于未加 Cu2+的
对照组(11.539±0.322 vs 5.422±0.201 nmol/L),
而不同浓度的当归对 Cu2+介导的 LDL 氧化有明显
的抑制作用 。当归浓度为 0.0625 mg/ml 时即对
Cu2+介导的 LDL 氧化有抑制作用 ,且呈浓度依赖
性 ,当归浓度为 1 mg/ml时表现为最大抑制效应 ,
当归浓度增大到 20 mg/ml ,抑制作用维持在这个水
182　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　湖北医科大学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 20 卷
平上 ,当增大到 40 mg/ml ,当归的抑制作用消失 ,表
现为氧化增强效应。
表　当归对 LDH漏出的抑制作用( x±s)
组　　别 n LDH(U/ ml)
对照 6 23.33±4.73
ox-LDL 6 38.00±4.36■
ox-LDL+当归(2 mg/ ml) 6 30.42±5.42＊
ox-LDL+当归(20 mg/ml) 6 26.33±3.46＊＊
　　与对照组比较:■　P<0.01;
与 ox-LDL 组比较:＊　P<0.05;＊＊P<0.01。
3　讨论
当归是中医活血养血药 ,研究表明 ,当归具有多
种药理作用 ,如增加冠脉血流量 ,降低心肌耗氧量 ,
清除自由基 ,抗脂质过氧化 ,抑制血小板聚集 ,抗 AS
作用[ 4～ 6] 。本实验将当归与 ox-LDL 共育 EC ,可明
显减轻 ox-LDL 导致的 VEC 的形态结构损伤和
LDH 的漏出 , 此结果表明当归对 ox-LDL 所致的
V EC损伤具有保护作用。
近几年来 ox-LDL 在 AS 的发生发展中的作用
日益被人们所重视 ,富含胆固醇的 LDL 氧化变成
ox-LDL 后 ,通过诱导细胞膜脂质过氧化 ,降低膜质
流动性 ,增加膜的通透性 ,抑制膜结合酶活性而使其
毒性作用增强[ 1 , 7 , 8] 。本实验用 ox-LDL 与 EC 一起
孵育后细胞形态明显改变 ,细胞膜破损 ,细胞间隙增
大 ,培养液中 LDH的漏出也明显增加。这种损伤不
仅有利于 LDL 等物质沉积于此间隙中渗透到膜下 ,
被单核细胞摄取氧化 ,也损伤 EC 的抗血栓形成功
能 ,还可以导致 EC 释放细胞因子促平滑肌细胞增
殖从而导致 AS 形成[ 9] 。Cu2+介导的 LDL 氧化修
饰作用是通过 LDL 中的不饱和脂肪酸在 Cu2+作用
下生成脂类自由基 ,产生更多的氧化脂质引起自由
基链式反应 ,最终生成多种反应性的醛[ 8] 。有文献
报道 ,当归的有效成分阿魏酸钠可直接捕获自由基 ,
另外当归所含的 VitC 、VitE 也具有抗氧化作
用[ 4 , 5] 。本文观察了当归对 Cu2+介导的 LDL 氧化
的体外实验 ,结果显示当归对这一氧化作用具有抑
制性 ,且呈浓度依赖性。当当归的浓度增大到 40
mg/ml抑制作用消失 ,表现为氧化增强效应 ,说明
当归对 LDL 氧化的影响呈双向性。本实验推测当
归对 EC 的保护作用机制可能与其抗脂质过氧化的
链式反应有关。
参考文献
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function and atherosclerosis.Atherosclerosis , 1994;108(sup-
pl)∶21
(1998-09-25收稿)
Protective Effects of Angelica on Oxidized Low-density Lipoprotein Induced
Damages of Vascular Endothelial Cells
Yan Xiaohong ,Ouyang Jingping ,Tu Shuzhen , et al
(Department of Pathophysiology ,Basic Medical College ,Hubei Medical University ,Wuhan 430071 ,China)
Abstract
Effects of angelica on cultured human umbilical vein endotheial cells(HUVEC)damaged by oxidized low-
(下转第 193页)
183第 3期　　 　 　　　　　　严晓红 ,等.当归对氧化低密度脂蛋白所致血管内皮细胞损伤的保护作用　　　　　　　　　　
图像分析仪测定法是通过微机图像处理系统对测试
细胞生长的形态及密度面积进行处理以确定其细胞
受损程度的一种定量的方法。具有操作简便 、快速 、
客观 、定量 、可保存及复核等优点。笔者用上述两种
方法同时对牙科材料进行了细胞毒性检测 ,结果显
示两种方法的测试结果相同 。因此笔者认为 MTT
法与细胞图像分析仪测定法用于牙科材料的细胞毒
性检测都是较理想的方法 ,可根据实验室条件选取 ,
均值得推广应用。
参考文献
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中华口腔医学杂志 , 1995;30(6)∶377
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牙科及医用金属材料的毒性研究.口腔医学纵横 , 1991;
7(2)∶108
(1998-09-24收稿)
Cytotoxicity of Dental Materials Evaluated with Cell Image Analysis and MTTMethods
Liu Shengwu ,Shi Bin ,Wang Ge
(Department of Microbiology and Immunology ,Basic Medical College ,Hubei Medical University ,Wuhan 430071 ,China)
Abstract
Objective:To assess the tw o methods of cell image analysis and M TT used to measure cyto toxicity of dental
materials.Methods:Cy toto xicities of dental materials including Fe-Ni alloy , Fe-Cr alloy , sotf porcelain-fused-to-
Fe wi th oxygen and bioactive po rcelain w ere examined with cell image analysis and M TT .In this study we used
L929 cells as the target cells.Results:The cell reproductive rates of Fe-Ni alloy ,Fe-Cr alloy , sof t porcelain-fused-
to-Fe w ith oxygen and bioact ive porcelain were 100.86%, 92.24%, 100.86% and 90.52% respectively w ith
M T T and the relative ratios of cell densi ty were 106.52%, 101.30%, 106.39% and 107.99% respectively w ith
cell image analy sis.The cyto toxicities w ere all null-grade w ith tw o methods.Conclusion:We obtained the same
results w ith two methods.Cell image analy sis and M TT are both ideal methods in measuring cy toto xicity of den-
tal materials.The tw o methods can be used w idely.
MeSH　dental materials/TO;methods;consumer product safety
(上接第 183页)
densi ty lipoprotein(ox-LDL)and its mechanism were investigated.When EC were incubated w ith ox-LDL for 24
hours , the scanning elect ron-microscopic study showed that the cellular outline changed , the intercellular space
enlarged , the cellualr membrane ruptured , and the lactate dehydrogenase(LDH)was markedly increased.Treat-
ment w ith angelica at concentrations of 2 and 20 mg/ml caused a reduction in LDH , and the morphologically
damaged HUV EC were alleviated.This study also investigated the effects of angelica on the LDL peroxidation by
copper in vit ro.The results show ed inhibitory ef fects of angelica.These results suggested that angelica provided
protection for HUVEC damaged by ox-LDL , and that the protective effects of angelica might be due to anti-lipid
peroxidation via f ree radicaed scavenging activity .
MeSH　angelica;lipoproteins ,LDL;endo thelium , vascular;antioxidants;atherosclerosis
193第 3 期　　　　　　　　　刘胜武 ,等.细胞图像分析仪测定法与 MTT 法用于牙科材料细胞毒性的检测