全 文 ：福 建 农 学 院
Jn r o u al oF fu i
n a
学 报 19( l ): 58 ~ 6 3, 19 90
A g r icu l t u r a l C o lle g e
水仙上分离出的烟草脆裂病毒的鉴定 ’
郑祥洋 林奇英 谢联辉
(福建农学院植物保护系 )
摘要 , 从福建省平潭县的矮化畸形水仙病株中获得一个分离物 N F v 一 , 并从病株根围土壤分
离物中得到一种毛刺线虫 ( rT ic ho do r us sP :) 该线虫传毒接种在芡色黎 、 昆诺黍 、 普通烟草和豌豆
上产生坏死斑 ; 在蔓陀罗 、 虹豆 、 牵牛上表现为系统症状 . 病叶榨出液采用 E U S A 测定 , 与荷
兰水仙上的烟草脆裂病毒 (T R v) 标准抗血清呈阳性反应 . 电镜下病原为 78 x 24 n m 和 19 5 x
24 n m 2 种竖杆状空心粒体 . 据此认为该分离物属于 T R V . 本文还就 T R V 的株系问题及其所致
的水仙病害进行了讨论 .
关键词 水仙 ; 烟草脆裂病毒; 鉴定
烟草脆裂病毒 (T o b a e e o r a t t l e v i r u s , T R V )分布于 欧洲 、 美国 、 巴西和 日本 (H a r r i s o n ,
19 70 )
. 英国 、 荷兰 、 新西兰 、 日木和捷克都报道了该病毒能自然侵染水仙 , 并引起轻重不
同 的病 害 (B r u n t , 19 6 6 ; ` A s多s , 19 7 1: 19 74 ; J o n e s e t a l . , 1 9 7 8 ; I w a k i p t a l . , 19 7 2 :
M o kr a
,
1% 9)
. 我国迄今还未有烟草脆裂病毒及从水仙上分离到该病毒的报道 . 作者于
19 8 7 年 4 月和 1 9 8 8年 3 月在水仙田问病毒病调查中 , 从福建平潭产区采到矮化畸形的可疑
病株 , 同时挖取病株根围土壤 . 为了明确其病原 , 搞清我国水仙病毒的种类 , 为病毒检疫及
病害控制提供科学依据 , 作者进行了病原病毒的鉴定研究 .
1 材料与方法
L l 材料
.1 1
.
1 供试毒源 于 19 8 7 年 4 月和 19 8 8 年 3 月在平潭产区 4 个种植点采集到矮化畸形
水仙病株样本 20 份 , 并挖取病株根围病土 , 分别采用根接传毒和直接种植于病土上的方法
感染芜色琴 . 经单斑分离纯化伏得的 1个分离物 N F V 一4 作为供试毒源 .
1
.
1
.
2 供试传毒线虫 以过筛漏斗法从根围病土中分离到毛刺线虫 (了衬ch 口do ur : sP . ) , 作
为传毒介体 .
1
.
1
.
3 供试鉴别寄主 将分别属于 4 科 1 种的鉴别寄主 (参见表 2) 预先培育于温室及防
虫网室无病土的盆钵内 , 供生物接种用 .
L Z 生物接种
1
.
2
.
1 线虫传毒接种 将培育好的鉴别寄主幼苗直接移植于拌有毛刺线虫病土的盆钵内
置于防虫网室中 .
1
.
2
.
2 根接传毒接种 将水仙病株根部附着的泥土洗净 , 与培育好的鉴别寄主幼苗同时
移植于无病土的盆钵内 , 置于防虫网室中 .
* 收稿 日期 : 1 9 8 9一 3一 8
DOI : 10. 13323 /j . cnki . j . f af u( nat . sci . ) . 1990. 01. 010
第 1期 郑祥洋等 : 水仙上分离出的烟草脆裂病毒的鉴定 · 59·一 - - - - - - - - - - - - - -一 ~ -一 -L 3病毒粗提纯以接种后 35一 0 4天表现坏死斑的览色蔡叶片 2 0 9为材料 , 用 0 . O67 m ol / l ( pH 7 . 4) 磷酸缓冲液伏一N a) 为缓冲剂 , 经捣碎匀浆 , 三层纱布过滤 . 滤液中加人 20 % 氯仿 , 磁力搅拌器搅拌 20 m in , 4 00 r / m in 离 心 30 m in . 取上清液并 、加人 6% P G E , 0, 充分溶解 , 经20 0 0 r / m in 离心 120 m in . 沉淀物用原液体积 10 % 的磷酸缓 冲液充分溶解后 , 加人o . s m ol / 1 N a CI 再经 40 0 r / m in 离心 3Qm in , 取上清液为病原粗提液 .1.4 病毒粒体观察病毒的粗提液经 P T A 负染后 , 直接在 J E M 一 12 0 E X 电镜下观察 .
L S 血清学测定
1
.
5
.
1 琼脂双扩散 配好 1 . 1% 琼脂 , 加 0 . 1% N a N 3 防腐 . 以病叶粗提液为抗原 , 置于周
围小孔 ; 以荷兰 A s多s 提供的 T R V 抗血清为抗体 , 置于中央孔穴中 . 室温下 24 h 后观察结
果 .
1
.
5
.
2 EL IS A 测定 以病叶粗提液为抗原 , 荷兰 A s多s 提供的 T R V 抗血清为抗体 , 冻于
辣根过氧化酶标记羊抗兔 gI G 结合物 (卫生部北京生物制品研究所出品 ) . 为酶标抗体 , 用
D G 30 2 : 型酶联免疫检测仪 (国营华东电子管厂出产 )进行间接法测试 (梁训生等 , 1 9 85) .
2 结果与分析
2
.
1 毒源样本的来源和介体线虫的分布
2 年共采到 20 份矮化畸形的病株样品 (图版 工一 1) . 在平潭所调查的 4 个点中 , 以君山村
表现比较突出 , 占的采病样的 60 % (表 .l)
表 1 毒源样本的来源及采集时间
T a b
.
1 T h e e o l e e t i n g lo e a ] i t ie s a n d t im e s o f in rC t e d P la
n t s a n d d is e a s ed
s o i l s p e e i m e n s
采 集 时 间
C o l ec t in g t im e s
采 集 地 点 e o l le e t io g lo e a一it ie s l , l
君 山 J S 县农科所 A I C 县良种场 A E S C 岚 城 L C
1 9 8 7月 )4
1 9 8 8 we心3
[l ] JS = J
u n s h a n ; A I C = A g ir e u ] tur a l I
n s t it u ct o f C o u n t y ; A E SC = A g
r ie u l tu r a l E x P e r i m e n ta l S ta t io n o f C o u n ty ;
L C二 L a n e五e n .
分离线虫结果表明 , 20 份病土样本中 , 仅君山村 2 年所采的 12 份土样含有介体线虫一
毛刺线虫 (图版 I 一 2) , 其它 3 个种植点虽然也有同样病株零量分布 , 却查不到该种线虫 . 这
可能是由于其含量很少不易分离或这种病毒随鳞茎直接由君山带到这些种植点而在水仙生长
当季直接表现出症状 .
.2 2 生物接种及寄主反应
2 种接种方法均可成功 , 但传毒效率不同 . 以介体毛刺虫接种的鉴别寄主发病高
(9 O% )
, 潜育期短 (30 一 35 天 , 平均 34 天 ;) 而根接传毒的发病率低 (仅为 5 % ) , 潜育期为
·
6 0
· 福 建 农 学 院 学 报 第 19 卷
45一 5 5天 (平均 3 4天 ).主要鉴别寄主的症状表现见表 2.
1 9 7 8年 4月接种的的 4科 1 种植物 , 除扁豆植株死亡外 , 均表现出不同的症状 (表 2 ,
图版 I 一 4一 8 ) .
表 2 N F V一 4 分离物在鉴定别毒主植物上的症状表现
T a b
.
Z T七e 访 d ie a et d s y m P t o m s o n ht e id fe er n Ua l h o s t s b y u s认 9 o f i s o la t e N F V -4
鉴 别 寄 主 介体传毒 根接传毒 鉴 别 寄 主 介体传毒 根接传毒
D i n飞r e n t ia l h o s t V砂 11 S x田 D i吮 er n 石a l h 0 S t V T 5 1
芡色黍 C . dm a r a , t ic o ot , N N 菜豆 P . , u lg a r 众 N S C
昆诺菜 C R u认 o a N N 肛豆 V . s es qu i详 da 伦 SM S M
千 日红 G . g lo b o s a N S C 豌豆 P . sa t i v u m N N
克利夫兰烟 .N e le ve la 月 id i S C / SM t S M t 牵牛 P . n 口 S M t / D i s SM t / D i s
曼陀罗 D . s t r翻的 o n iu 从 S M t / S C SM t / S C 普边烟 .N t a b a e u m N N
[l ] v T = Ve e t o
r t r a n s m is si o n ; [2 ] 5 1 = S h
o o t s一 in t e r lo o k i n g ; N = 坏死 N e em s i s : S M t = 系统斑驳 S y s t e m ic m o t t le :
iD
s = 畸形 n i s t o川 o n : S C = 系统褪绿 S y s t e m i c hc lo r s is : SM = 系统侵染 S y s t e巾 ie m o s a ie .
.2 3 病毒粒体的形态
病叶粗提液悬滴经负染后在电镜下可见到 2 种不同长度的坚杆状空心粒体 , 其大小 为
78 x 2 4 n m 和 19 5 x 2 4 n m (图版 I 一6) . 健株对照未能见到这类病毒粒体 .
.2 4 抗血清测定
2
.
4
.
1 琼脂双扩散结果表明 , 病株抗原粗提液与效价为 2 0 48 的 T R V 粒体有明显的沉淀线 (
图版 工一 10) , 而对照为阴性反应 .
2
.
4
.
2 E L I S A 测定结果表明 , 病株粗提抗原与效价为 2 0 4 8 的 T R V 粒体呈阳性反应 , 其
中抗原的最高稀释度为 :1 12 80 , 而对照为阴性反应 .
3 讨论与结论
根据该病毒分离物的介体线虫 、 传毒特性 、 寄主反应 、 电镜形态及血清学性质 , 可 以认
为引起福建水仙植 株矮化畸形 的病原应是 T R V . 虽 然与 T R V 组成烟 草脆裂病毒 组
汀 o b r a v iur s s )的另一病毒一豌豆早褐病毒 (p e a e a ir y一 b r o w i n g v i r u s )在许多特性上有共同点 ,
但两者的寄主范围不同 , 且在作者所接种的鉴别寄主中 , 兑色黎和菜豆上的症状特点表明为
T R v 侵染 (H盯 isr on , 198 1) . 此外抗血清测定结果也证明了这一点 .
该病毒已有许多株系报道 (H盯 isr on , 1 9 7 0) . 根据我省水仙上的 T R v 所致的水仙病害症
状和血清学特性 , 与荷兰水仙上 的 T R V( A s多s , 1 9 7 1) 为同一株系 . 病原粒休形态及大小 与
D R N 株系似 a r r i s o n , 1 9 7 0 )相似 . 我们分离的 T R V 的粒体形态及大小 与新西兰 J o n e s c t
al
.
( 1 9 7 8 )从水仙上分离到的相似 . 但他们报道该病毒未能使水仙出现明显 的症状 . 这可能是
由于水仙品种和地理条件不同或株系差异的缘故 . 由于我们无法收集所有株系的抗血清 , 我
第 1期 郑祥洋等 : 水仙上分离出的烟草脆裂病毒的鉴定 · 6 1·
省水仙上的 R V T所属株 系问题有待进一研究 .
R V T在 自然条件下所致的水仙病害 , 主要表理为植株严重矮化畸形 , 叶片扭曲并出现
长而宽的褪绿白条带 (可从靠近土表处延伸到叶尖 ) . 有人报道 T R V 可导致水仙叶片沿叶脉
方向显著的白条状突起 (A s多s , 1 9 7 1) , 我们在田间虽然也采集到这种典型病叶 , 但始终未能
分离到 T R V , 其病原有待澄清 .
T R V 在中国系首次报道 . 虽然在其他植物上尚未发现 , 且在水仙产区 田间所占比例比
已报道过的其他病毒 (N M v 和 N Y s v 等 )小得多 , 但由于其自然寄主范围很广泛 , 为多数观
赏植物和经济作物的重要病原扭ar isr m , 1 9 70) , 且是 目前已知水仙病毒病中致病程度最严
重的病毒病原 , 所以是一种潜在的威胁 , 应引起重视 .
致谢 本研究承中国花协 , 全国植保总站和福建省科委所资助 , 荷兰球茎花卉研究中心 c . J . A珍 s博士提
供 T R v 抗血清 , 特此致谢 .
参 考 文 献
梁训生 、 张成良、 张作芳 , 198 5 . 植物病毒血清学枝术 . 北京 : 农业出版社 , 209 ~ 2 2
A s多s C J , 19 7 1 . V ir u s d i sc a se s i n th e N e t he r l a n d s . D a加 idl oj : r n a l, 8: 3一 1 1
A s孙5 C J, 19 74 . 5 0 11一 b r o ne v iur s d ise a s e s i n o r n a m e n t a l b u 1b o u s a n d t h e ir e o n t r o 1 in ht e N e t h e r la n d s . A g ·
r ic “ It “ r e 石知 v ir o n m e n l , l : 3 03一 3 15
Bur n t A A
,
19 66
.
T h e o “ u r cr n e e o f e u e u m b e r m o as i e v ir u s a n d fo u r n e m a t o d e 一 tr a n s m i t te d v i ur cs s i n B r it -
i s h n a r e i s su s e r o P s
.
P l
a n l P a th o ot gy
,
15 (4 ) : 15 7一 160
H a r r is o n B D
,
19 70
.
T o b a e e o r a t t l e v i ur s
.
C IM / A A B
.
D e凡e r i P t i o n o f P la n t v i ur sc s
,
12
H a r ri s o n B D a n d R o b in s o n D J
,
198 1
.
T o b r a v iur s
.
nI : H a n d b o o k o f P la n t V iur s l n fe e t io n C o m P a r a t i o n
D ia g n o s is
.
T h e N e t h
e r la n d s : E d o u r d K u r s ta k P r e s s
,
5 15一 540
WI a k i M a n d K o m u r o Y
,
19 72
.
V iur se s is o l a t e d fr o m n a cr i s s u (S N
a r c加 “ 5 s PP . ) . i n J a P a n l , C u e u m b e r
m o s a ie v iru s
,
t o b a e co r a t t le v i ur s a n d b r o a d b e a n w il t v i川 5 . A n n u a ls o f zh e P h y r o aP th o lo g ic a l S o c i e z y
o
fj
a那 n , 3 8 ( 2 ) : 137一 14 5
oJ n e s A T a n d Y o u n g B R
,
197 8
.
S o m e P r o p e r t ie s o f wt o i s o la t e s o f t o b a c o r a t t Ie v iur s o b t a in e d fr o m p e o
-
n y a n d n a r e i s s u s P l a n ts in N e w Z e a l a n d
.
P al n r D 众e a s “ R e脚 r r , 62 ( 1 1) : 9 2 5一 92 8
M o k r a V
,
19 69
.
T he o c u r er n e e o f a n a g e n t er se m b il n g ht e t o b a e e o r a t it e v i ur s fo u n d o n s o m e o m a m e n t a 1
p la n t s in C ez e k o s l o v a k ia
.
I n : P l a n t V i r o lo g y
,
P a飞u e , C z e e k o sl o v a k i a : A e a d e m i s P er s s , 3 46
福 建 农 学 院 学 报 第 9 1卷
图 版 I P la e t l
第 1期 郑祥洋等 : 水仙上分离出的烟草脆裂病毒的鉴定 . 6 3.
图版 I说明 E x pl n a at io. of P 一 at esl
1
.
T R v 侵染的水仙病株 S y m pt o讯 5 in d u ed e in n ar e is s u s p一 an t b yT R V.
2
, 传播介体一毛刺线虫 T r a n s m i s s io n v 沈 t o 。 介ic^ o由、 s p .
3
. 觅色葬叶片坏死斑 N e cr o s is s p o t i n hC e 月。脚idu . am a ra , t ic o lo r .
4
. 千 日红叶片坏死斑 N o e r o s i s s p o t i n G o川助 r e月 a g ot bo as .
5
. 曼陀罗系统褪绿 S y s t em i e e h l o r o s i s in D a t u , : t r a脚。 , lu二
6
. 菜豆叶片系统褪绿斑 s y s t em i e e h一o r s is s p o t i n 外 a se o lu s , u lg r臼 .
7
. 虹豆系统花叶 Sy s t e m i e m o s a ie in V伙 , a se s q u i详 da 肠 .
牵牛系统斑 (左 )和畸形斑驳 (右 ) s y s t e m ie s p o t Oe ft )a n d d is t o r t in g (r ig h t) in 外 a r b iz臼 月 i.l
8
. 粗提液中病毒粒体 v i r u s p a rt ie ]e s i n p a r it a lly p r e p a r a t io n ep n e tr a t目 b y n e g a t iv e s t a i n .
9
. 琼脂双扩散中T R V抗体与 N F v拼的阳性反应 S e or 一o g ie a l cr a e it o n be tw e e n T R v a n t is e ur m (e n ter we 一s )t o ht e e x tr a e t
o f以 e月。 脚 id u用 a阴 a r a n t ic o纷 in fC t e d b y N F V闷 i s o la t e in d o u b l-e d ifu s io n t e s t .
10
. 琼脂双扩散中T R v 抗体与 N F v一的阳性反应 cS r o l o g ie a l car e t i o n 玩 twc e n T R v a n t is e r m恤 n t er w e l l s ) t o t h e e x t r a e t
o f hC
e n o 户 i了u用 a胡 a r a n r ic o OI r i n fe e edt b y N F V 一 4 i s o la t e s in d o u b卜一 ifu s i o n t e s t .
T H E I D E N T I F I C A T IO N O F T O B A C C O R A T T L E V I R U S
I S O L A T E D F R O M N A R C I S S U S I N F U J I A N
Z h e n g X i a n g y a n g
,
L i n Q i y i n a n d X i e L i a
n h u i
(D e tP
.
o
f P la
n r P r o t e e t ot n
, 尸月 C )
A b s t r a e t A P r e v i o u s l y u n er p
o r t e d y如 5 i n C h i n a w a s i s o la t e d fr o m n a cr i s s u s P l a n t s (刃过r c is -
su s taez
t t a v a r
.
ck in e 月 s合) w i t h s t u n t i n g a n d d i s t o r t i n g l e a v e s a n d i t s t r a n s m i s s i o n v ec t o r s一
rT i
e h o d o r u s s p
.
w e r e a l s o fo u n d i n a e o m m e r i e a l p l a n t i n g a r e a i n P i n g t a n C o u n t y d u r i n g t h七
in v e s t i g a t i o n o f v i r u s d i s e a s e s o f n a r e i s su s i n F u五a n . T h e v iur s w a s tr a n s m it t e d b y t h e v e e t o r
a n d sh o o t s一 i n t e r l o o k i n g t o 1 1 s P ec ie s o f 4 fa m i l ie s d i a g n o s t i e h o s t s二 hC e n o OP id u ,”
am
a r a n t ic o ot r
,
C
.
q u in o a
, 万艺` o t 1’a n a t a b a c e川 a n d P is u m s a r i v u m a l l i n d u e e d n e e r o s i s w h il e
D a t u r a s r r a m o n i um
,
F电哪a s e s q u i详da ils a n d hP a r b it is n 汀 sh o w e d s y s et m i e i n fe c t i o n . S a P
fr o m C
.
a 用 a r a n t ie o OI r r e a e t e d P o s i t i v e ly t o t h e a n t i s e r u m o f T R V (fr o m N e th e r l a n d s ) b y
E L I S A a n d d o u b l e一 d i而 s i o n t e s t . T h e v i r u s h a d ir g id r o d s w it h a e e n t r a l h o l e o f tw o k i n d s
o f P a r it e l e s m e a s u r e d 7 8 x 2 4 n m a n d 1 95 x 2 4 n m
.
T h e v ir u s w a s id e n t i if e d t o b e t o b a c e o r a t
·
Ue v i r u s
.
S t r a i n s o f ht e v i r u s i n F u j a n a n d t h e d i sc a se o e e u er n e e i n n a r e is s u s w e r e a l s o d i s
-
Cu s sc d
.
K e y w o dr , n a r e i s s u s ; t o b a c o r a t t l e v iur s ; id e n t iif e a t i o n